Лада гранта серебристая: LADA Granta седан – Фотогалерея – Официальный сайт LADA

Содержание

Lada Granta Седан 2021 обзор, комплектации и цены, характеристики

Обзор Granta Седан

Держит слово

Моя сила не в блеске внешних украшений и вещей. Не в достижениях виртуальной жизни. Моя сила в том, что я выполняю обещания. Не меняю мировоззрение раз в полгода, а иду к цели и помогаю другим достичь ее.

Новое в знакомом

А ведь правда, мы становимся лучше, умнее, опытнее, сильнее. Мы радуемся, открывая что-то новое в себе и рядом с собой. Замечаем, когда меняется действительно что-то важное – стиль, комфорт, возможности любимого автомобиля.

  • Новые диски 15»
    Легкосплавные диски оригинального дизайна с чередующимися двухразмерными спицами и полированной поверхностью
  • Форсунки омывателя
    перенесены с капота на облицовку ветрового окна — стильное и практичное решение
  • Современная форма кузова
    Улучшенная аэродинамика автомобиля
  • Легкое открытие багажника
    Наружная электрокнопка отпирания багажника — неотъемлемый атрибут современного комфорта и стиля
  • Большие зеркала
    Гарантия отличной обзорности
  • Настройка сиденья водителя
    Регулировка в диапазоне 40 мм

Забота о каждом

Что может сравниться с той радостью, когда дарят подарок, который ты давно хотел? Только радость человека, которому даришь то, о чем он давно мечтал. Но потребности даже близких людей иногда понять непросто. Хорошо, что есть машина, умеющая учитывать самые разные запросы.

  • Комфорт пассажиров
    Перчаточный ящик с полочкой, два подстаканника и две ниши на облицовке тоннеля пола для мелких вещей и держателем для авторучки
  • Освещение салона
    Функция задержки освещения салона после закрытия двери: освещение гаснет через 25 секунд или сразу после включения зажигания
  • «Проводи меня домой»
    Функция задержки выключения света фар: забота о водителе и пассажирах даже после того, как они покидают машину
  • Акустический комфорт
    Дополнительная шумоизоляция улучшает виброакустику салона: мягкие подкрылки в арках колес – из специального материала, эффективно гасит «пескоструй» и удары гравия
  • Датчик дождя
    Незаменимая опция, когда ваш автомобиль окатят мутной водой из соседней лужи и при мелком дожде в долгой поездке
  • Просторный 5-местный салон
    Удобно и практично: задний диван легко складывается в пропорции 2/3. Ограничители двери с функцией инерционного доводчика

Жизнь, приправленная мощностью

Гамма двигателей мощностью 87, 98 и 106 л.с. позволяет выбрать автомобиль в соответствии со своим стилем вождения.

Все моторы оснащены облегченной шатунно-поршневой группой, что улучшает характеристики и повышает ресурс.

  • Рабочий объем
    1596 см
  • Мощность
    87 л.с. (64 кВт) при 5100 об/мин
  • Момент крутящий
    140 Нм при 3800 об/мин
  • Топливо
    Бензин, min 95
  • Рабочий объем
    1596 см
  • Мощность
    98 л.с. (72 кВт) при 5600 об/мин
  • Момент крутящий
    145 Нм при 4000 об/мин
  • Топливо
    Бензин, min 95
  • Рабочий объем
    1596 см
  • Мощность
    106 л.с. (78 кВт) при 5800 об/мин
  • Момент крутящий
    148 Нм при 4200 об/мин
  • Топливо
    Бензин, min 95

Ответственность и безопасность

Мир скоростей требует повышенного внимания. И повышенной отдачи: я слежу не только за собой, но и помогаю близким. А технологии помогают мне – ощутимо и эффективно! Особенно когда это комплекс электронных помощников водителя.

Благодаря проработанной силовой структуре кузова и современным системам безопасности LADA Granta седан выполняет российские и европейские требования по защите водителя, пассажиров и пешеходов.

  • Подушки безопасности
    Две фронтальные подушки безопасности – необходимая защита водителя и пассажира
  • ЭРА-ГЛОНАСС
    Система экстренного оповещения работает даже в случае отключения аккумулятора
  • Задние датчики парковки
    Более надежная страховка при маневрировании задним ходом
  • Система торможения (ABS+BAS)
    Антиблокировочная система с усилителем экстренного торможения: сохранение устойчивости и управляемости автомобиля
  • Курсовая устойчивость (ESC)
    Предотвращает занос автомобиля
  • Помощник на подъеме
    Система HSA помогает при старте на подъёме.
    Ощущение уверенности при подъеме (доступно для комплектаций с АМТ)

Вождение с азартом

LADA Granta предлагает выбрать принципиально разные варианты трансмиссии. Для мегаполиса – «автомат». Для поселка – «механика».

Для абсолютно любых условий – автоматизированная трансмиссия (АМТ).

Механическая коробка передач

Надежность и четкость переключений. В LADA Granta применяется МТ с тросовым приводом: это улучшает виброкомфорт автомобиля. Благодаря немецкому механизму переключения передач четкость и информативность выведены на уровень европейских аналогов. В механической коробке передач для 8-клапанного мотора внедрено новое передаточное число главной пары: 3,9 вместо 3,7. Новая трансмиссия повышает динамику автомобиля и обеспечивает уверенное ускорение.

Автоматизированная механическая трансмиссия

Две коробки по цене одной. С АМТ возможно двигаться как в полностью автоматическом, так и в ручном режимах. АМТ получила обновленные настройки, а также сокращенное время переключения передач. «Городской» режим позволяет легко двигаться в пробках. Функция зимнего режима обеспечивает комфортное трогание на скользких покрытиях. Спортивный режим – для уверенного и динамичного старта.

Автоматическая коробка передач

Обеспечивает классический функционал АТ, максимально комфортное переключение передач и движение в городском потоке.

Комплектации и цены

 Подушка безопасности водителя
 Крепления для детских сидений ISOFIX
 Блокировка задних дверей от открывания детьми
 Иммобилайзер
 Дневные ходовые огни
 Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
 Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
 Система вспомогательного торможения (BAS)
 Подголовники задних сидений 2 шт.
 Подушка безопасности переднего пассажира
 Подголовники задних сидений 3 шт.
 Охранная сигнализация
 Противотуманные фары
 Система электронного контроля устойчивости (ESC) (в Comfort только для АТ)
 Противобуксовочная система (TCS) (в Comfort только для AT)
 Система помощи при трогании на подъеме (HSА) (только для АТ и АМТ)
 Розетка 12V
 Бортовой компьютер
 Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
 Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
 Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
 Воздушный фильтр салона
 Легкая тонировка стекол
 Аудиоподготовка
 Электроусилитель рулевого управления
 Регулируемая по высоте рулевая колонка
 Центральный замок
 Электростеклоподъемники передних дверей
 Обогрев наружных зеркал
 Кондиционер
 Подогрев передних сидений
 Электропривод и обогрев наружных зеркал
 Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
 Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
 Сиденье водителя с регулировкой по высоте
 Центральный замок с дистанционным управлением
 Электростеклоподъемники задних дверей
 Обогрев ветрового стекла
 Климатическая система
 Датчики парковки задние
 Датчики дождя и света
 14» стальные диски
 Запасное полноразмерное стальное колесо 14»
 Колпаки колес декоративные
 Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
 Наружные ручки дверей в цвет кузова
 Молдинги боковых дверей
 15» легкосплавные диски
 Запасное стальное колесо временного использования 14»

Характеристики

Расположение двигателя
Длина / ширина / высота, мм
База, мм
Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом. ..
Колесная формула / ведущие…
Тип кузова / количество…
Количество мест
Колея передних / задних колес,…
Дорожный просвет под силовым агрегатом (полная…
Тип двигателя
Система питания
Рабочий объем, куб. см
Код двигателя
Количество, расположение…
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об….
Максимальный крутящий момент, Нм / об….
Рекомендуемое топливо
Максимальная скорость, км/ч
Время разгона 0-100 км/ч, с
Городской цикл, л/100 км
Загородный цикл, л/100 км
Смешанный цикл, л/100 км
Снаряженная масса, кг
Объем топливного бака, л
Технически допустимая максимальная масса,. ..
Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…
Тип трансмиссии
Передаточное число главной…
Передняя
Задняя
Рулевой механизм

Фотографии

Экстерьер

Интерьер

LADA Granta в кузове седан – современный маневренный автомобиль, имеющий 4 двери и более просторный багажник, чем в лифт- и хэтчбек версиях. Стоимость базовой комплектации самая низкая, от 419 900р. По этим и другим причинам седан принимают за возможного фаворита линейки, купить и протестировать автомобиль покупатели могут уже с октября 2018 года в салонах дилера.

Внешний вид

Седан Лада Гранта после рестайлинга смотрится совершенно иначе: новой стала передняя часть, капот, рельеф багажника, молдинги в отдельных комплектациях. Появилась возможность заказать встраиваемые в зеркала повторители поворотов и ручки дверей в тон кузова. Обращая внимание на изменения в передней части:

  • Перерисованная решетка радиатора с серебристой каймой
  • Огни дневного света вписаны в ее верхние края
  • Форсунки с омывающей жидкостью перенесены на фартук лобового стекла
  • Зеркала стали шире и удобнее для обзора
  • Диски получили новый дизайн звезды с двойными лучами разной ширины

Салон автомобиля

В зависимости от комплектации, выбирается интерьер нового седана. Базовой функцией стала поддержка головы с помощью анатомических подголовников и спины, за счет боковых валиков. Водитель может отрегулировать сиденье по высоте. Свет в салоне гаснет с 25-секундной задержкой.

Центральная панель LADA Granta 2018 уютная и наглядная, все кнопки упорядочены, как и информация на многополосном дисплее. Имеется кнопка открытия багажника, вызова экстренных служб, с повышением комплектации добавляются переключатели, такие как климат-контроль или подогрев передних сидений.

Двигатели и комплектации

Представлены моторы, уже знакомые водителям по ранним комплектациям: 1.6 объем для 87-сильного, 98-сильного и самого мощного двигателя в линейке со 106 л.с. Обновленные поршни с выемками под клапаны позволяют работать тише и надежнее, избегая загиба при разрыве ГРМ. Двигатели демонстрируют резвость на низких оборотах, при этом их шум сглаживается за счет хорошей изоляции салона.

Седан представлен в пяти комплектациях: Standard, Classic, Comfort, Luxe и Prestige. В младшей из них доступен только двигатель 87 л.с. и механическая коробка передач, старшая предоставляет широкий выбор комфортных опций: гибридную коробку передач, более мощный мотор, подушку безопасности для переднего пассажира, ассистент парковки и старта на подъеме, а также другие опции из длинного списка.

Руководства по эксплуатации

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 26.10.20

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 16. 07.20

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 24.03.20

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 09.01.20

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 29.10.19

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 10.10.19

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 04.09.19

 Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Granta Drive Active от 01.07.19

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 13.03.19

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 05.10.18

 Руководство по эксплуатации LADA Granta от 20.08.18

Как узнать цвет автомобиля

У наших клиентов, желающих приобрести окрашенные детали для автомобилей Лада, часто возникает вопрос: как узнать точное наименование цвета? К примеру, у Лады Гранта существует 4 оттенка черного цвета.

Итак, для выяснения точного наименования цвета автомобиля Лада понадобится сервисная книжка автомобиля или гарантийный талон.

В свидетельство о регистрации смотреть не нужно, там МРЭО указывает цвет на свой вкус.

Наименование цвета кузова автомобилей Лада состоит из 3 цифр и названия цвета.

В сервисной книжке это выглядит так:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

В гарантийном талоне вот так:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Название цвета после его цифрового обозначения может отличаться от заводского наименования цвета. К примеру, может быть указан цвет «691 серебристый». Заводское наименование этого цвета «691 Платина». Таким образом, при заказе деталей в цвет кузова вам нужно ориентироваться именно на цифровой код цвета.

Для автомобилей Датсун (Datsun) обозначение цветов отличается, на настоящий момент таблица соответствия цветов такова:

Наименование цвета АвтоВАЗ Наименование цвета Datsun
240 Белое Облако C04 или C04G (белый)
413 Ледяной C03 или C03G (серо-голубой)
610 Рислинг C02 или C02G (серебристый металлик)
672 Пантера C05 или C05G (черный)
790 Кориандр C01 или C01G (коричневый)

Если у вас нет гарантийного талона или сервисной книжки на автомобиль, определить цвет возможно по дате выдачи паспорта транспортного средства (согласно плана покраски АвтоВАЗ).

Для определения цвета по дате выдачи паспорта транспортного средства надо перейти по ссылке http://avtosreda.ru/colorplans/2016/03.php , выбрать год и месяц выдачи ПТС, в таблице плана покраски выбрать модель автомобиля, и подобрать цвет. План покраски действителен только для автомобилей, собранных в г. Тольятти. По автомобилям, собранным в Ижевске, рекомендуем обращаться в систему обратной связи АвтоВАЗ.

Если у вас дубликат ПТС или цвет автомобиля не подобрать по плану покраски, вы можете задать вопрос о цвете автомобиля через систему обратной связи ПАО «АвтоВАЗ», указав VIN-номер автомобиля. Чтобы задать вопрос, перейдите по ссылке https://www.lada.ru/feedback/message.html

 

LADA Granta Cross – Обзор модели, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Classic (21941-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиоподготовка

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Comfort (21941-A1-X31)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Comfort (21947-A1-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Comfort (21947-A1-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Luxe (21947-A2-X30)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Luxe (21947-A2-XR0)

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

Коды и примерный вид цветов

102 абрикос   + серебристо-светло оранжевый
602 авантюрин   + серебристо-черный
425 адриатика     синий
204 айсберг     белая-двухслойная
243 акапулько     ярко-желтый
460 аквамарин   + серебристо-сине-зеленый
503 аккорд   + серебристо-коричневый
1018 алмаз. серебро   + (ИЖ) серебристый
660 альтаир   + серебристый светло-серый
355 амазонка     ярко-зеленый
145 аметист   + серебристый фиолетовый
371 амулет   + серебристо-темно-зеленый
425 андриатика     голубой
125 антарес   + темно-вишневый
277 антилопа   + серебристо-бежевый
286 апатия   + серебристый оранжевый
305 аспарагус   + серебристо-зеленый
490 астероид   + темно-сине-зеленый
440 атлантика     светло-синий
1158 аустер   + (GM) светло-серый
421 афалина   + серебристо-зелено-голубой
645 базальт   + серо-черный
107 баклажан     темно-фиолетовый
420 балтика     темно-сине-зеленый
353 бальзам     зеленый
235 бежевый     бежевый
240 белое облако     белый
201 белый     белый
302 бергамот   + серебристо-зеленый
451 боровница   + серебристо-серо-синий
480 бриз     зелено-голубой
262 бронзовый век   + бежево-коричневый
464 валентина     серо-фиолетовый
310 валюта   + серо-зеленый
655 викинг   + темно-серый
129 виктория   + серебристый ярко-красный
132 вишн. сад     темно-серебристо-красный
127 вишня     темно-бордовый
313 водолей   + серо-зеленый
488 галактика   + темно-фиолетовый
423 гейзер   + серо-голубой
481 голубой     голубой
180 гранат     темно-бордовый
150 дефиле     серебристо-серо-коричневый
285 джем   + оранжево-коричневый
502 дыня   + серебристо-желтый
321 дюшес   + серебристо-молочно-зеленый
203 жасмин     бело-желтый
230 жемчуг   + серебристо-бело-молочный
307 защитный     зеленый
257 звездная пыль   + бежево-сиреневый
307 зел. сад     темно-зеленый
963 зеленый   + зеленый
1012 зеленый авокадо     (ИЖ) темно-зеленый
1901 зол.звезда   + (GM) бежево-золотистый
331 зол.лист   + золотистый темно-зеленый
245 золотая нива   + серебристо-желто-зеленый
109 золотисто-бежевый   + (ИЖ) золотисто-бежевый
347 золото инков   + золотистый темно-зеленый
311 игуана   + серебристо-ярко-зеленый
515 изабелла   + темно-филетовый
385 изумруд   + серебристо-зеленый
441 индиго     темно-синий
406 ирис     фиолетовый
128 искра   + красный
358 кайман   + темно-зеленый
104 калина   + ярко-красный
190 калифор. мак   + золотисто-красный
453 капри   + темно-сине-зеленый
212 капучино     светлый серо бежевый
101 кардинал     ярко-красный
118 кармен     красный
630 кварц   + темно-серый
352 кедр     серо-зеленый
381 кентавр   + темно-зеленый
322 колумб. зелень   + золотисто-оливковый
116 коралл   + серебристый темно-красный
798 корица   + коричневый
370 корсика   + серебристый болотно-зеленый
665 космос   + черный
1017 красн.перец   + (ИЖ) серебристо-вишневый
1013 красный порту     (ИЖ) вишневый
281 кристалл   + светло-серый
435 ла-манш   + серебристо-фиолетовый
675 лаванда     серебристо-коричневый
487 лагуна   + серебристо-синий
445 лазурит   + фиолетово-синий
498 лазурно-синий   + серебристый темно-синий
495 лунный свет   + светло-голубой
410 магеллан     темно-синий
133 магия   + серебристо-ярко-фиолетовый
120 майя   + серебристый темно-бордовый
428 медео     голубой
234 медовый   + желто-золотой
317 меридиан     зеленый
1014 мерц. синий   + (ИЖ) серебристо-темно-синий
217 миндаль   + серебристо-бежево-розовый
280 мираж   + серебристый-желто-зеленый
606 млеч. путь   + серебристо-серо-графитовый
626 мокр.асф   + серебристый стальной
403 монте-карло     ярко-синий
325 морск. пучина     темно-зеленый
458 мулен руж     ярко-фиолетовый
377 мурена     сине-зеленый
620 мускат   + серебристо-серо-золотистый
223 нарцисс     желтый
304 наутилус     темно-зеленый
239 невада   + серебристо-серо-бежевый
628 нептун   + серебристо-темно-серо-синий
270 нефертити   + серебристый-бежевый
383 ниагара   + серебристо-серо-голубоватый
1001 озеро тахо   + (УАЗ)темно-серо-зеленый
449 океан     темно-синий
345 оливин   + золотисто-зеленый
340 оливковый     желто-зеленый
1121 олимпия   + (GM) ярко-синий
419 опал   + серебристо-голубоватый
308 осока   + зелено-голубой
387 папирус   + серебристо-серо-зеленоватый
152 паприка   + серебристо-красно-оранжевый
404 петергоф     серо-зеленоватый
795 пирано   + красно-коричневый
417 пицунда     зелено-синий
615 полюс мира   + серо-коричневый
192 портвейн   +  
406 посейдон   + темно-синий
342 прерия   + серебристо-серо-зеленый
605 престиж   + серебристо-темно-синий
276 приз   + серебристо-бежевый
210 примула     светло-желтый
448 рапсодия   + серебристо-ярко-синий
412 регата   + серебристо-темно-синий
122 реклама     ярко-красный
499 ривьера   + сине-фиолетовый
610 рислинг   + серебристо-бледно-серый
1002 ричмо   + (УАЗ) темно-коричневый
391 робин гуд   + тёмно-зелёный
182 романс     темно-красный
110 рубин     красный
442 садко     темно-голубой
1005 салатовый   + салатовый
670 сандал   + бежево-красный
446 сапфир   + серебристый сине-фиолетовый
215 сафари     светло-бежевый
671 светло-серый     светло-серый
301 сер. ива   + серебристый-зеленовато-серый
640 серебристый   + серебристый
236 серо-бежевый     серо-бежевый
233 серо-бел     серо-белый
427 серо-голуб     серо-голубой
373 серо-зеленый     серо-зеленый
1019 серое олово   + (ИЖ) серый серебристый
1011 синий калипсо     (ИЖ) темно-синий
447 синяя полночь     синий
483 сириус   + серо-синий
478 слива   + серебристо-ярко-синий
295 сливочно-белый     сливочно-белый
690 сн. королева   + серебристый
650 совиньон   + серебристо-серый
791 солярис   + темно коричневый
360 сочи   + серебристо-серо-зеленоватый
399 табачный   + серебристый коричнево-зеленый
206 талая вода   + светло-серый
509 темно-бежевый     темно-бежевый
793 темно-коричневый     темно-коричневый
456 темно-синий     темно-синий
170 торнадо     красный
100 триумф   + серебристо-красный
475 тундра   + серебристо-зеленоватый
1020 ультрамарин     (ИЖ) сине-зеленый
1115 феерия   + (GM) ярко-красный
416 фея   + серебристо-сиреневый
105 франкония   + темно-вишнево-малиновый
430 фрегат     цвет морской волны
363 цунами   + темно-зеленый
228 чайная роза     светло-желтый
408 чароит   + серебристый темно-фиолетовый
162 черешня     темно-алый
482 черника   + темно-синий
601 черный     черный
1021 черный графит   + (ИЖ) серебристо-серо-графитовый
513 черный жемчуг   + серебристо-коричневый
651 черный трюфель   + черный
637 черный шоколад   + темно-коричневый
415 электрон   + темно-серый
290 южный крест   + серо-бежевый
473 юпитер   + серебристо-голубоватый
202 ярко-бел     ярко-белый
140 яшма     темно-вишневый

LADA 219020, LADA GRANTA, год изготовления 2013, VIN ХТА219020D0124935, тип ТС легковой, модель, № двигателя 21126, 3136817, кузов ХТА219020D0124935, цвет кузова серебристый, мощность двигателя, л.

с. (кВт) 97,9 л.с. (72.0 кВт), рабочий объем двигателя 1596 куб.см., разрешенная мах масс, кг 1560 | Ульяновская область

Порядок оформления участия в торгах, перечень документов участника и требования к оформлению:
Заявки на участие в торгах подаются в электронной форме посредством системы электронного документооборота на сайте в сети Интернет по адресу: http://bankrupt.etpu.ru/

Порядок и критерии определения победителя торгов:
Право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения, который представил в установленный срок заявку на участие в торгах, содержащую предложение о цене имущества должника, которая не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, при отсутствии предложений других участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения. В случае, если несколько участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения представили в установленный срок заявки, содержащие различные предложения о цене имущества должника, но не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов, предложившему максимальную цену за это имущество. В случае, если несколько участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения представили в установленный срок заявки, содержащие равные предложения о цене имущества должника, но не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов, который первым представил в установленный срок заявку на участие в торгах по продаже имущества должника посредством публичного предложения.

Срок и порядок подписания договора купли — продажи:
В течение пяти дней с даты подписания протокола о результатах проведения торгов финансовый управляющий направляет победителю торгов предложение заключить договор купли-продажи с приложением проекта данного договора в соответствии с представленным победителем торгов предложением о цене имущества. В случае отказа или уклонения победителя торгов от подписания договора купли-продажи в течение пяти дней с даты получения от финансового управляющего предложения о заключении договора и проекта данного договора внесенный задаток победителю торгов не возвращается, а финансовый управляющий вправе заключить договор купли-продажи с участником торгов, которым предложена наиболее высокая цена имущества по сравнению с ценой имущества, предложенной другими участниками торгов, за исключением победителя торгов.

Сроки уплаты покупной цены по итогам проведения торгов:
Оплата по договору купли-продажи должна быть осуществлена в течение 30 дней с даты заключения договора купли-продажи на расчетный счет Организатора торгов — Гридяев Виктор Николаевич, счет № – 40817810772003445966, Банк получателя – Сбербанк России, БИК – 047501602, Корр. счет – 30101810700000000602

орденов и наград Среднего царства

ордена и награды Среднего царства Из статьи, первоначально опубликованной в Tournament Illuminated # 110, Spring 1994.
последнее обновление: 23 июня 2009 г.

от госпожи Джессы д’Авондейл

Среднее царство, третье царство Общества творческого анахронизма, была основана в A.S. IV. +

Герб королевства — Argent, бледно-красный, в целом проход дракона. Верт, в первую очередь древняя корона Или в собственно лавровом венке. Драконы (или их части) включены во многие имена и жетоны наград королевства.


Патенты на оружие

Уходящие короли и королевы не получают патентов на оружие. Однако в середине Королевский Орден Первенства, Герцоги / Герцогини и Графы / Графини указаны перед обладатели патентов на оружие (рыцари, лавры и пеликаны).

Гранты вооружений

По усмотрению Короны любому лицу может быть предоставлено оружие. благодаря выдающимся достижениям в любой области.Великие офицеры королевства, получившим Грант, разрешено использовать герб дракона при отображении их руки. Другие держатели Грантов могут использовать Герб в соответствии с указаниями Короны.

Следующие награды несут с собой Грант оружия, если получатели еще не есть они:


Орден Сердца Дракона: вручается тем, кто выполнил услуги от имени королевства сверх того, что обычно ожидается.Соратники ордена могут поставить инициалы CDH после своих имен, и может носить медальон со знаком ордена: Argent, a heart vert чешуйчатый серебристый.

Орден Золотой Булавы: вручается соратникам Ордена Красного. Компания, показавшая мастерство и лидерство в рукопашном бою и / или турнирах. бой, и кто обучил других этим навыкам. Соратники ордена могут ставьте инициалы CGM после их имен.Те, кто не принадлежит к рыцарству можно именовать «лейтенантами Красной роты».


Орден компании Greenwood: награжден за превосходство в двух из трех области стрельбы из лука: искусство, обслуживание, искусство и наука. Спутники заказ может помещать инициалы CGC после их имен и может стилизовать себя как Лесники Зеленолесья. Значок заказа: (Без поля). На ветке сосен феон перевернул Or.

Компания Бронзового кольца: вручается тем, кто проявил превосходство и лидерство в рапирном бою, и кто обучил других этим навыкам. Соратники по приказу могут поставить инициалы ЦБ РФ после своих имен и могут называют себя Хранителями Бронзового Кольца.

Рота Белого Копья: вручается тем, кто проявил превосходство в два из трех направлений конной деятельности; мастерство, сервис, искусство и наука.Соратники отряда могут размещать инициалы CWL после своих имен.

Орден Вечнозеленых растений: вручается тем, кто учил и проявлял превосходство в одном или нескольких из искусств, наук или в исследованиях. Соратники заказа могут разместить инициалы CE после их имен. Знак заказа: (Бесполе) Сосна бледно-пурпурного цвета и Ор.

Оружейные награды

Звания придворного барона и баронессы присвоены усмотрение Короны признать благородство тех, кто был отличная услуга короне или королевству.Придворные бароны также обычно присуждается территориальным баронам и баронессам, когда они уходят в отставку. Согласно Корпорация, титул сопровождается Оружейной наградой, однако в середине Королевский Орден старшинства, придворные бароны и баронессы указаны перед обладатели грантов вооружений.

Награда за оружие может быть вручена по усмотрению Короны в качестве отдельная награда или в сочетании со следующими наградами и орденами:


Орден Ивы: вручается тем, кто демонстрирует навыки, но еще не мастерство в одном или нескольких искусствах.Соратники заказа могут разместить инициалы CW после их имен и могут носить медальон с изображением ордена знак: Purpure, ива уничтоженная Ор.


Орден Серебряного Дуба: вручается тем, кто проявляет мастерство, но не все же мастерство в одной или нескольких науках или исследованиях. Спутники орден может размещать инициалы CSO после их имен и может носить медальон со знаком ордена: Purpure, дуб взорванный и уничтоженный. серебристый фруктовый Or.


Награда Purple Fret: вручается физическим лицам за долгое и долгое время. преданное служение своей группе, офису или царству. Получатели награды может ставить инициалы APF после своего имени и может носить медальон с нагрудным знаком заказа: Или пурпурный лад. Эту награду можно получить более одного раза.

Награда Милости Лани (ранее — Благосклонность Королевы): вручается тем, кто продемонстрировали вежливость и благородство на поле или за его пределами, а также доброта к окружающим.Человек может получить эту награду более одного раза, и получатели могут носить медальон со значком ордена: Azure, a меч собственно enfiled венка цветов серебра, скольжения и листьев Or. Оригинальная награда была учреждена во времена первого правления герцогини Эйслинн. Пациент (на геральдическом гербе которого изображена лань), имя изменено на честь ее как памятник.

Награда Королевской Чаши: вручаются тем которые в глазах Государя проявили превосходство и подлинность в выбранное ими поле.Получатели могут поставить инициалы RKC после своих имен. An человек может получить эту награду более одного раза, Жетон представляет собой медальон со знаком ордена.

Орден Зуба Дракона: вручается тем, кто выполнил драматические подвиги в боевых искусствах от имени королевства, сверх того и за его пределами что обычно ожидается. Часто вручается поле в то время, когда дело было засвидетельствовано. Соратники ордена могут поместите инициалы CDT после их имен и можете носить клык, подвешенный на цепь или медальон со знаком ордена: Argent, на бледной вершине три клыка Или.


Орден Зуба Дракона: вручается тем, кто демонстрирует мастерство поле для стрельбы из лука, или образцовая служба в продвижении стрельбы из лука. Спутники орден может размещать инициалы CDB после их имен и может носить медальон со знаком ордена: Хвост дракона, бледный, зазубренный перед вождем, внутри и исходящий из кольцевой верт, чешуйчатый серебристый.


Орден Кавендишского узла: вручается тем, кто демонстрирует мастерство область боя на рапирах или образцовая служба в продвижении боя на рапирах. Соратники ордена могут размещать инициалы CCK после своих имен. и может носить медальон со знаком ордена: четыре кавендишских узла соединены крестом, верт.

Орден Белого Шамфрона: вручается тем, кто проявил мастерство в сфере конного спорта или образцовой заслуги в продвижении в этой сфере. Соратники ордена могут размещать инициалы CWC ​​после своих имен. и может носить медальон со знаком ордена: (Бесполевой) Chamfron argent.


Орден Красной роты: за лидерство в бою. Члены Орден, известный как Сержанты Красной Роты, должен быть опытными бойцами в ближнем бою, разбирается во многих стилях оружия, и лидеры своим примером как на, так и на вне поля битвы, работая, чтобы служить военным усилиям королевства и обучая и обучение других. Их поведение должно быть примером вежливости и чести. Знак ордена: Gules, две булавы с отбортовкой из серебра.

Орден открытой раны: вручается тем, кто на поле боя дрался, получил травму, потребовавшую хирургического вмешательства или другого госпитального ухода Соратники отряда могут ставить инициалы CGW после своих имен. Этот заказ был закрыт, чтобы подчеркнуть безопасное поведение в списках.

Награды без оружия

Следующие награды не означают оружия или превосходства:


Награда «Сокровище Дракона»: вручается молодежи, имеющей оказал образцовую службу королевству.Эту награду можно получить еще более одного раза, и получатели могут носить гербовую накидку или медальон с наградой знак: Драконья игра, стоящая в вертикальном положении, поддерживающая заряженный серебряный медальон. с бледно-красным цветом.

Награда Бантона: вручается молодежи, имеющей проявил рыцарство и энтузиазм в боевых искусствах. Эту награду можно получить еще чем однажды.

Награда Серебряного желудя: вручается молодежи, имеющей проявил энтузиазм и усилия в области искусства и науки.Эту награду можно получить еще чем однажды.


Награда Purple Fretty: аналогична Purple Fret, за службу филиалы, гильдии или другие организованные группы. Те группы, которых так почитают, могут знамя: Или пушисто-пурпурное, рядом с их знаменем.


Награда Зуба Дракона: , подобная Зубу Дракона, для групп кто преуспел в бою. Отряды, удостоенные такой чести, могут нести знамя: Argent, на танце между двумя сломанными зубами дракона вертится еще один серебристый.


Награда Полета Дракона: , похожая на Зубец Дракона, для групп кто преуспел в стрельбе из лука. Группы, удостоенные такой чести, могут нести знамя: Argent, a бледный vert чешуйчатый серебристый между четырьмя феонами vert.


Награда Рощи: вручается филиалам, гильдиям или другим организованным группы, продемонстрировавшие мастерство в искусстве и / или науках, или образцовые услуги в продвижении таких полей.Эти прославленные группы могут нести знамя: Per pale Or и серебристый, быстро пурпурный.

Награда Сапфира: вручается тем, кто проявляет вежливость, грацию и честь людям всех рангов, которые являются примером «воплощения мечты». Получатели могут поставить инициалы RSL (Получатель сапфирового света) после своего имени, и может носить медальон со значком: (без поля) Драгоценный камень лазурный . Личность может получить эту награду более одного раза.

Орден Королевского авангарда: вручается тем, кто служил короне как чемпион короля или королевы. Соратники по заказу могут разместить инициалы CRV. после их имен.

Орден Розы: вручается тем, кто служил Консортом в хотя бы одно полное правление. Членство автоматически после схождения на престол. Посередине Орден существует с целью поощрения рыцарских и вежливое поведение среди всех членов Общества.

Увеличений оружия вручаются Короной тем лицам, которые дали так много и такого качества, что награды и награды Царство не выражают в достаточной степени того уважения, которым они пользуются. Каждый аугментация — это особый заряд, добавляемый к геральдическим оружие. Эта честь предоставляется редко.


> Вернуться к Указателю наградных статей

Сайт Поднебесной


Эта колонка была составлена ​​на основе закона Среднего царства (апрель 2000 г.) и «The Почести Среднего Царства «, баронесса Грейдни ни Руайд, Помощь оказали лорд Торвальд Рэдхейр (главный вестник драконов), лорд Гвилим. ap Alun (Trillium Herald), лорд Алан Fairfax Aluricson (Fenris Herald), Графиня Женевьев дю Вент Арджент, мастер Гарет Танкред Уилфрет, лорд Бервин Этельбрихт из Экли, Гриммунд Чернокрыл, леди Гвендолинн ферч Элидир и госпожа Кейтлин Дэвис.Иллюстрации наградных значков были предоставил Михаил Любельский.

Хозяйка Джесса д’Авондейл (Марла Лесин) проживает в Восточном Королевстве. Она приглашает всех, у кого есть обновления или исправления к этой статье, в свяжитесь с ней.

Высокочувствительный гомогенный иммуноанализ, основанный на создании серебряных треугольных нанопластин-квантовых точек Система FRET

Улучшенный синтез STNP представлял собой метод роста, опосредованного семенами, в соответствии с нашим предыдущим методом 19 . Во-первых, соли серебра восстанавливали сильным восстановителем для получения затравочных частиц. После этого частицы затравки серебра немедленно облучали натриевой лампой (70 Вт) в течение 2 часов. Вкратце, треугольные нанопластинки с пиком поглощения плазмона при 613 нм были синтезированы с использованием цитратной кислоты в качестве поверхностного лиганда 19,21 . На рисунке S1 в вспомогательной информации схематически показан процесс роста очень однородных и неоднородных STNP. Высокооднородные STNP (см. FESEM на рис.2) были приготовлены дополнительным контролем ОН . Как показано на рисунке S2 в вспомогательной информации, малое увеличение FESEM и узкое распределение размеров STNP хорошо подтверждают высокое качество и высокую однородность подготовленных STNP. Без добавления OH полученные STNP имеют неоднородную морфологию, размер и широкое распределение по размерам (см. FESEM на рисунке S3), что подтверждается расширением полной ширины на полувысоте (fwhm) спектра поглощения плазмонного резонанса. (Рисунок S3 во вспомогательной информации).Очевидно, что значение fwhm может быть уменьшено со 117 нм до 83 нм после введения OH . Это связано с тем, что введение OH может равномерно подавить скорость генерации ионов серебра в сумме 19 . Мы действительно наблюдали, что окисление наночастиц серебра, очевидно, сдерживалось введением OH . Хотя световое облучение ускоряет процесс окисления небольших наночастиц серебра из-за повышения температуры, ионы OH , по-видимому, эффективно подавляют побочный эффект.Следовательно, введение OH может ингибировать окисление наночастиц серебра и замедлить скорость генерации ионов серебра, что благоприятно для кинетического контроля роста 19,21 . Как показано на рис. 2, длина стороны треугольных нанопластин составляет около 70 нм. В нашем случае настроенные по размеру красные КТ (λ em = 612 нм) были выбраны в качестве донора для HIA, потому что они хорошо совпадают с полосой поглощения локализованного плазмонного резонанса STNP.

Рис. 2: FE-SEM изображение STNP, полученное с помощью нашего метода, а также нормализованный спектр поглощения STNP и спектр PL квантовых точек.

Масштабная линейка составляет 200 нм.

Поскольку квантовые точки и STNP были закрыты отрицательно заряженными лигандами 3-меркаптопропионовой кислоты и лимонной кислоты, соответственно, таким образом, когда QD и STNP были смешаны вместе в одном сосуде, они не могли объединиться друг с другом из-за электростатического отталкивания. сила. Следовательно, ФЛ квантовых точек будет оставаться постоянной. Как показано на рис. 3 и 4а, когда объем СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ почти осталась постоянной.Однако, когда модифицированные этилендиамином STNP были добавлены в раствор QD, QD могли легко объединиться с STNP через мостиковую связь этилендиамина из-за электростатического взаимодействия. Следовательно, фотолюминесценция квантовых точек будет эффективно подавляться STNP из-за безызлучательного процесса FRET. Цифровые фотографии раствора КТ до и после добавления STNP, модифицированных этилендиамином, при возбуждении ультрафиолетовой лампой показаны на Рисунке S4 во вспомогательной информации.Невооруженным глазом можно наблюдать, что флуоресценция КТ резко гасится после введения модифицированных этилендиамином СТНЧ. Как показано на рис. 3 и 4b, когда объем модифицированных этилендиамином СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ сильно гасилась, и гашение приближалось к насыщению до тех пор, пока объем СТНП достигал около 160 мкл.

Рис. 3

Схема механизма тушения, основанная на FRET, от QD до STNP, модифицированных этилендиамином.

Рисунок 4

Изменение интенсивности ФЛ на пике эмиссии КТ после добавления различных объемов STNP ( a ) и STNP, модифицированных этилендиамином ( b ). Объем СТНП был увеличен с 5 до 10, 20, 40, 80 и 160 мкл. Концентрация квантовых точек была зафиксирована на уровне 14 нМ. На вставке — соответствующая эволюция спектров ФЛ квантовых точек.

Эффективность FRET можно оценить как Ф FRET = 1 — I DA / I D , предполагая, что другие механизмы гашения, такие как реабсорбция, незначительны, где I DA и I D представляют собой интенсивность флуоресценции донора FRET с и без присутствия акцептора FRET, соответственно 1,3 .Согласно спектрам ФЛ, показанным на рис. 4б, эффективность FRET могла достигать 98% для КТ в точке насыщения тушения. Такая высокая эффективность FRET демонстрирует синергетический эффект благодаря свойствам настоящей конструкции 3 . Во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усилить участки тушения и повысить эффективность тушения. Во-вторых, СТНП имеют большой коэффициент экстинкции. Коэффициент экстинкции СТНЧ составляет примерно 10 12 M -1 см -1 (подробности см. Во вспомогательной информации), что примерно на 2–3 порядка величины выше, чем у наночастиц золота, и даже на 7–8 на порядки выше, чем у флуоресцентных красителей.В-третьих, спектры STNP и QD идеально перекрываются благодаря рациональной перестройке спектров наших специально разработанных доноров QD и акцепторов STNP. Очевидно, что чем больше перекрываются спектры между донором и акцептором, тем выше будет эффективность FRET. Наконец, поглощение СТНЧ при возбуждении донора, например, 400 нм для квантовых точек, невелико, что максимально устранит неблагоприятное влияние эффекта FRET. Поскольку тушение PL QD коррелирует с дозировкой STNP, мы могли бы выполнить HIA на основе тушения флуоресценции QD, когда высокоэффективные и надежные QD функционировали как индикаторный агент обнаружения.

В этой работе был выбран вирус гепатита В для проведения ОВЗ на основе наноплатформы QDs-STNPs FRET. Схематический путь HIA HBsAg представлен на рис. 1. STNP, иммобилизованные с HBsAb1 на поверхности, используются в качестве акцепторов FRET. С другой стороны, излучающие красный цвет КТ (λ em = 612 нм), иммобилизованные HBsAb2 посредством ковалентного связывания (рис. S5 в вспомогательной информации), используются в качестве доноров FRET. Добавление аналита HBsAg к раствору HIA запускало иммунные реакции, индуцированные сэндвич-конструкцией, что приводило к коррелированным с концентрацией Ag процессам FRET.Перед тестом на обнаружение сначала смешивали STNP-Ab1 и QD-Ab2 в гомогенном растворе. Когда аналит Ag был добавлен в раствор, сэндвич-структура STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 будет формироваться из-за иммунных реакций, и FRET от QD до STNP будет происходить спонтанно.

Как показано на вставке к фиг. 5 и цифровой фотографии набора квантовых точек на фиг. 6, тушение ФЛ демонстрирует развивающийся процесс FRET по сравнению с увеличением концентрации HBsAg.Кривые обнаружения были получены путем вычитания интенсивности ФЛ контрольного образца QDs-Ab2 без Ag и сэндвич-структур STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 с Ag. На рис. 5а, б показаны спектры ФЛ системы HIA с различными концентрациями антигенов, когда дозовая концентрация QDs-Ab2 составляла 7 нМ и 0,35 нМ соответственно. Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции монотонно увеличивалась с постепенным увеличением концентрации Ag до 160 нг / мл -1 для более высокой концентрации QD и 8.1 нг мл -1 для более низкой концентрации КТ, соответственно. Следовательно, диапазон обнаружения HBsAg может достигать 160 нг / мл -1 для этого HIA. После линейной аппроксимации линейная калибровочная кривая может быть получена как Y = 86,0671X — 148,2 (5 ≤ X ≤ 40 нг мл -1 , R = 0,997) для более высоких доз HBsAg и Y = 1088,7X — 93,96 (0,3 ≤ X ≤ 2,7 нг / мл -1 , R = 0,999) для обнаружения HBsAg с более низкой дозировкой соответственно. Предел обнаружения (LOD) был определен как самая низкая концентрация обнаруженного образца, которая дает положительное значение вычитания интенсивности PL между контрольным и обнаруженным образцом 1,22 . Из фиг. 5b отчетливо видно, что вычтенная интенсивность PL все еще оставалась положительной, даже когда концентрации HBsAg были такими низкими, как примерно 300 пг / мл -1 для HIA, когда применялась более низкая дозированная концентрация. Таким образом, LOD этого HIA может достигать всего 300 пг / мл -1 . В результате мы можем выполнять чрезвычайно точное обнаружение в относительно широком диапазоне концентраций и требования к высокочувствительному обнаружению (например, 300 пг / мл -1 ~ 160 нг / мл -1 ).Здесь LOD в 27,7 раз ниже, чем предыдущий результат при использовании золотых наностержней (GNR) в качестве акцептора FRET (8,3 нг / мл -1 ) 1 , что связано с более высокой эффективностью FRET, как обсуждалось выше. Соответствующие параметры STNP и GNR показаны в таблице S1; сравнение объясняет причину более высокой эффективности FRET и более низкого LOD обнаружения антигена при использовании STNP. Одним словом, нельзя игнорировать две причины: во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усиливать участки тушения и повышать эффективность FRET. Во-вторых, СТНЧ имеют больший коэффициент экстинкции по сравнению с наночастицами золота. Теоретически, когда концентрация аналита Ag превышает насыщенную концентрацию меченого Ab, например, 320 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более высокой концентрацией Ag и 24,3 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более низкой концентрацией Ag , ответа на иммуноферментный анализ быть не должно. Фактически, кривая обнаружения немного снизилась. Это связано с тем, что добавление детектированного HBsAg к набору заменило сэндвич-Ag ​​и привело к восстановлению флуоресценции квантовых точек (рис.7).

Рис. 5

Обнаружение антигена на основе FRET с предоставленной концентрацией QDs-Ab 7 нМ ( a ) и 0,35 нМ ( b ). Связь между вычтенной интенсивностью PL (I 0 -I) QDs-HBsAb в присутствии STNPs-Ab1 и обнаруженным HBsAg с различными концентрациями. На вставке — соответствующее изменение спектров ФЛ квантовых точек.

Рис. 6

Цифровая фотография набора КТ до ( a ) и после ( b ) обнаружения антигена на основе FRET при возбуждении ультрафиолетовой лампой.Слева направо концентрация обнаруженного антигена увеличивается от 0 до 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 нг / мл. Каждая концентрация антигена определяется статистикой пяти параллельных образцов.

Рисунок 7

Схема механизма восстановления флуоресценции, вызванного перенасыщенным детектируемым Ag.

Специфичность иммунного обнаружения в основном зависит от иммунореактивности меченых моноклональных антител. Чтобы доказать высокую обнаруженную специфичность нашей ОВЗ на основе FRET, мы также выполнили некоторую неспецифическую диагностику.Для подтверждения специфичности был проведен контрольный тест с применением 1% раствора BSA в качестве образца аналита. Поскольку как структура, так и морфологические свойства HBeAg и HBsAg подобны друг другу, необходимо обнаруживать HBeAg для дальнейшего подтверждения специфичности HIA. Результаты показаны на фиг. 8, на которой интенсивность флуоресценции нормализована к значению обнаружения HBsAg с учетом специфичности HBsAg за 100%. Когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания HBeAg, может наблюдаться низкая интенсивность флуоресценции.Этот феномен означает, что имелось 8,6% неспецифического связывания HBeAg. Аналогичным образом, когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания образца BSA, при тех же условиях обнаружения наблюдается только небольшой сигнал PL. Это явление означает, что неспецифичность в отношении молекул BSA составляет лишь 5,6%. Очевидно, что HIA с использованием конъюгатов QDs-HBsAb очень специфичен для обнаружения HBsAg, поскольку специфичность превышает 90%. В результате наша HIA, основанная на наноплатформе FRET QDs to STNPs, заслуживает доверия и осуществима.

Рис. 8

Специфичность экспериментов по неспецифическому связыванию BSA (1%) и HBeAg с использованием гомогенного иммунного детектирования на основе FRET с учетом специфичности HBsAg как 100%.

Использование стабильно экспрессируемого биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов

Abstract

Многие противораковые препараты предназначены для уничтожения раковых клеток путем индукции апоптоза. Однако анализы активности, используемые для измерения биологической активности этих продуктов, обычно представляют собой анализы жизнеспособности клеток, которые не делают различий между гибелью клеток и ингибированием роста.Здесь мы описываем клеточный биосенсор с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), предназначенный для измерения биологической активности противораковых препаратов, вызывающих апоптоз. Биосенсор содержит голубой флуоресцентный белок (CFP), связанный через последовательности распознавания, специфичные для каспазы 3 и каспазы 8, с желтым флуоресцентным белком (YFP). При активации каспазы, как и в случае индукции апоптоза, линкер отщепляется, уничтожая клеточный сигнал FRET. Этот анализ точно отражает механизм действия противораковых лекарств в уничтожении раковых клеток и, следовательно, может использоваться в качестве теста на эффективность различных противораковых лекарств. Мы строго продемонстрировали это, охарактеризовав класс белков, нацеленных на рецепторы смерти. Одноэтапный анализ, по-видимому, превосходит другие анализы, основанные на апоптозе, благодаря своей простоте, удобству и надежности.

Образец цитирования: Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) Использование стабильно выраженного биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов. PLoS ONE 9 (9): e107010. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0107010

Редактор: Wei Xu, Университет Висконсина — Мэдисон, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 28 апреля 2014 г .; Дата принятия: 10 августа 2014 г .; Опубликовано: 4 сентября 2014 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях. Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все данные включены в статью.

Финансирование: Эта работа была поддержана Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центром оценки и исследований лекарственных средств, Фондом инициативы «Критический путь»; и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центр оценки и исследований лекарственных средств, Фонд Инициативы по медицинскому противодействию. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Эффективность — это мера активности лекарственного средства с точки зрения концентрации или количества, необходимого для достижения определенного биологического эффекта [1]. Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы максимально полно отразить механизмы действия лекарственного средства. Для онкогенных лекарств, которые предназначены для уничтожения раковых клеток, анализ активности может быть мерой цитотоксичности лекарства в отношении раковых клеток.Исторически многие химиотерапевтические агенты были идентифицированы путем высокопроизводительного скрининга библиотек соединений с использованием анализов жизнеспособности клеток с МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) или другими родственными красителями [2], [3]. Этот формат анализа получил широкое распространение в качестве теста на эффективность при разработке лекарств от рака. Однако анализы жизнеспособности клеток не могут различить эффекты гибели клеток и остановки роста, что оставляет оговорку в оценке истинной биоактивности противоракового лекарства.Поскольку цель терапии рака — убить раковые клетки, очень важно оценить способность лекарства вызывать гибель раковых клеток. Форма гибели клеток, наиболее часто связанная с лечением рака, как in vivo, и in vitro, — это апоптоз или запрограммированная гибель клеток.

Отличительным признаком апоптоза является активация протеаз каспаз, приводящая к расщеплению структурных белков и образованию апоптотических телец [4]. Существует два различных пути, а именно внутренний и внешний, которые приводят к активации каспазы в ответ на лекарственное лечение.Классические химиотерапевтические препараты, такие как этопозид, компактин, фторурацил (5-FU), таксол и камптотецин, вызывают активацию каспазы 3 р53-зависимым образом [5] — [7], что часто связано с митохондриальными изменениями. Напротив, новый класс белков, нацеленных на рецепторы смерти, экспрессируемые на поверхности клетки, находится в стадии разработки [8] — [11]. Эти белки включают варианты рекомбинантного фактора некроза опухоли человека (TNF), связанный с TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к рецепторам смерти. TRAIL связывается с рецептором смерти 4 и / или 5 (DR4 / 5) и впоследствии индуцирует сборку индуцирующего смерть сигнального комплекса (DISC), содержащего адаптерный белок, ассоциированный с Fas белок с доменом смерти (FADD) и прокаспазу 8. Внутри В DISC, прокаспаза 8 активируется путем саморасщепления и высвобождается в цитозоль, где активирует каспазу 3. В некоторых типах клеток передача апоптотических сигналов дополнительно усиливается через митохондрии в результате транслокации каспазы 8. опосредованное расщепление Bid (белок взаимодействующего домена Bh4).Таким образом, эффективность противоракового лекарства можно оценить, измерив величину активности каспазы в обработанных клетках. Одним из подходов к измерению активности каспаз было использование флуоресцентных зондов, содержащих субстраты каспаз, показывающих изменения интенсивности флуоресценции при активации каспазы [12] — [16]. В качестве альтернативы активные каспазы могут быть обнаружены с помощью иммуноблот-анализа с использованием антител, специфичных к расщепленной форме отдельного фермента [14], [17] — [19]. Однако эти анализы могут быть связаны с большой вариабельностью из-за сложных операционных процедур.В этом исследовании мы разработали клеточный FRET-анализ для проверки эффективности продуктов рака. Зонд FRET содержит последовательности распознавания как для каспазы 3, так и для каспазы 8, и было обнаружено, что он чувствителен к лекарствам от рака, которые действуют внутренними или внешними путями. В частности, со стабильно экспрессируемым зондом FRET, ответ, вызванный лекарством, непосредственно отслеживается на обработанных клетках без дополнительных этапов обработки. Более того, анализ FRET выявляет клетки, подвергающиеся апоптозу, с заметной чувствительностью и экспериментальной простотой, что делает его многообещающим анализом эффективности для оценки противораковых препаратов.

Материалы и методы

Клеточные линии и реагенты

Линия клеток рака молочной железы человека

MDA-MB-231 была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния). Плазмида pCMV6-AC для экспрессии слитого белка (552 аминокислоты), содержащего полноразмерный голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), связанные через последовательность распознавания каспазы, была приобретена у OriGene (Rockville, MD). Линкер между CFP и YFP содержит шестнадцать аминокислот, GSGDEVDGGIETDGSG, которые могут расщепляться активированной каспазой 3 при G ↓ DEVD или каспазой 8 при G ↓ IETD, где ↓ указывает сайт разрезания протеазы.Кодирующая последовательность кДНК (1656 пар оснований) слитого белка CFP-линкер-YFP была клонирована в вектор pCMV6-AC по сайтам рестрикции Sgf I и Mlu I, и правильность конструкции была проверена путем нуклеотидного секвенирования. Плазмиду трансфицировали в клетки MB231 с использованием реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). Трансфицированные клетки отбирали против неомицина (G418) в концентрации 1 мг / мл (Corning Cellgro, Manassas, VA). Клоны, устойчивые к G418, отбирали с использованием цилиндров для клонирования (Millipore, Temecula, CA) и тестировали на интенсивность флуоресценции и уровни экспрессии белка. Стабильный клон с наивысшими уровнями экспрессии зонда CFP-линкер-YFP, обозначенный как MB231_CFP-YFP, использовали в следующих анализах. Клетки поддерживали в среде DMEM / F-12 50/50 с добавлением 5% FBS, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0,4 мг / мл сульфата G418. Родительские клетки MB231 культивировали в той же среде без добавления сульфата G418. И рекомбинантный человеческий TRAIL (rhTRAIL, № по каталогу 375-TEC), и агонистическое моноклональное антитело (№ по каталогу MAB631), специфичное к рецептору смерти 5, были приобретены в R&D systems (Миннеаполис, Миннесота).RhTRAIL существует как гомотример, где каждый мономер состоит из аминокислот 114–281 нативного внеклеточного домена TRAIL человека. Стауроспорин был приобретен у ApexBio (Бостон, Массачусетс). Камптотецин и этопозид были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури). 5-ФУ был приобретен у Enzo Life Sciences (Фармингдейл, Нью-Йорк). Компактин был приобретен в Санта-Круз (Даллас, Техас). Таксол был приобретен у Calbiochem (Ла Хойя, Калифорния).

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с помощью колориметрического анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ), как описано ранее [20].Вкратце, 1,0–2,0 × 10 4 клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Затем клетки обрабатывали цитотоксическим агентом. После обработки лекарственным средством среду для культивирования клеток аспирировали, затем в каждую лунку добавляли МТТ (2 мг / мл в буфере PBS) и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. Затем супернатант аспирировали и нерастворимый формазан растворяли в ДМСО. Поглощение при окрашивании формазаном измеряли при 562 нм с использованием микропланшетного ридера SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния).Относительную OD 562 для каждой лунки наносили на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях. Значения EC 50 были определены путем подгонки кривой доза-ответ к уравнению 1, Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * HillSlope)), с использованием призмы GraphPad. программное обеспечение. X — это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y — измеренное значение оптической плотности. Каждая точка данных была повторена в трех экземплярах.

Проточная цитометрия

3.0 × 10 5 клеток культивировали в каждой лунке 6-луночного планшета. Клетки обрабатывали TRAIL или антителом против DR5. Затем клетки собирали, окрашивали аннексином-V-APC (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) и йодидом пропидия (PI, Сент-Луис, Миссури) и анализировали с использованием проточного цитометра BD Accuri C6 (BD, Franklin Lakes, NJ) [ 21].

Иммуноблот-анализ

Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [19]. Вкратце, клетки лизировали с использованием буфера RIPA [0,5 М трис-HCl (pH 7.4), 1,5 М NaCl, 2,5% дезоксихолевой кислоты, 10% NP-40, 10 мМ ЭДТА и коктейль ингибиторов протеазы] (EMD Millipore, Дармштадт, Германия). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и определяли общее количество белка с помощью анализа BCA (Pierce, Rockford, IL). Равное количество белка (30 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием NuPAGE 4–12% градиентных гелей Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) и переносили на мембраны PVDF. Антитела, специфичные к CFP и YFP, были от Covance (Гейтерсбург, Мэриленд), антитела, специфичные к каспазе 8 и каспазе 3, были от Cell Signaling (Данверс, Массачусетс), а антитела, специфичные к актину, были от Санта-Крус (Даллас, Техас).В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой антимышиные, антикроличьи или козьи антитела IgG. Обнаружение иммуноблота визуализировали с помощью Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) и системы камеры LAS-4000 CCD (Fujifilm, Эдисон, Нью-Джерси).

Анализ цитотоксичности FRET на основе клеток

1,8–5,4 × 10 4 клеток MB231_CFP-YFP культивировали в каждой лунке черного 96-луночного микропланшета. После того, как клетки выращивали в течение ночи, среду для культивирования клеток аспирировали и буфер PBS, содержащий цитотоксический агент (TRAIL, антитело против DR5 или стауроспорин), добавляли к прикрепленным клеткам на указанные временные точки. Из-за необходимости более длительного периода инкубации для обработки камптотецином клетки обрабатывали средой DMEM, содержащей цитотоксическое лекарственное средство, в течение 48 часов перед заменой среды буфером PBS и продолжением инкубации в течение дополнительных 24 часов. Эту процедуру также проводили для этопозида, компактина, 5-ФУ и таксола. После лекарственной обработки сигнал FRET каждого образца определяли с использованием флуоресцентного планшет-ридера FluoDia T70 (PTI, Эдисон, Нью-Джерси). Обработанные клетки возбуждали с помощью фильтра возбуждения 425 ± 10 нм.Для определения FRET после вычитания фона были рассчитаны коэффициенты испускания YFP (фильтр 530 ± 5 нм) и CFP (фильтр 486 ± 5 нм). Значения FRET нормализовали и наносили на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Значения EC 50 были определены путем подбора нелинейной кривой к уравнению 2, Y = 100 / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * Hill Slope)). X — это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y — нормализованное значение FRET.Каждую точку данных повторяли в трех экземплярах для одного эксперимента, и каждый эксперимент повторяли независимо, по крайней мере, дважды.

Биохимическая характеристика зонда FRET

Чтобы охарактеризовать экспрессию зонда CFP-линкер-YFP, экспрессированный белок выделяли с использованием антитела против CFP / YFP. Вкратце, 1,2 × 10 6 клеток MB231_CFP-YFP собирали и лизировали в 1 мл буфера для иммунопреципитации для лизиса Пирса. 25 мкл антитела против CFP / YFP, конъюгированного с сефарозой (Abcam, Cambridge, MA), вращали с лизатом клеток без остатков в течение 3 часов при 4 ° C.После промывания буфером для лизиса связанный зонд CFP-линкер-YFP FRET элюировали 50 мМ Трис-буфером (pH 8,5), содержащим 1 М NaCl. Сразу после элюирования белок разбавляли трис-буфером до конечной концентрации NaCl 300 мМ. Чистоту белка визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим, а также с помощью анализа иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных для CFP и YFP (описанных выше).

Для анализа in vitro FRET иммуноочищенный зонд CFP-линкер-YFP FRET инкубировали с активной каспазой 3, каспазой 8 или каспазой 2 (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота) в течение 3 часов при 25 ° C в Буфер PBS, содержащий 1 мМ DTT, с использованием черных 96-луночных микропланшетов.В качестве контроля к некоторым реакциям также был добавлен Z-VAD. FRET измеряли, как описано выше.

Конфокальная микроскопия

1,5 × 10 4 клеток MB231_CFP-YFP культивировали на 4-луночных системах боросиликатного покровного стекла (Nunc, Rochester, NY) за один день до эксперимента. Клетки обрабатывали различными концентрациями TRAIL (0-25 нг / мл) в течение 2,5 ч перед визуализацией. Клетки получали с помощью линзы объектива 63x и системы конфокального микроскопа с вращающимся диском Zeiss Cell Observer (Торнвуд, Нью-Йорк) с камерой окружающей среды PECON.Эффективность FRET определялась путем регистрации сенсибилизированного излучения [22], [23]. Лазерные линии возбуждения с длиной волны 458, 514 и 458 нм использовались для донорных каналов CFP, акцепторных YFP и FRET соответственно. Эмиссионный фильтр для CFP составлял 485/30, тогда как эмиссионный фильтр для YFP и FRET был 535/30. Дихроичный светоделитель для конфокальной сканирующей головки Yokogawa был RIFT 457/514/647 нм. После получения поправочных коэффициентов для отдельно выраженных CFP и YFP изображения клеток были получены для ячеек MB231_CFP-YFP через каналы CFP, YFP и FRET идентичным образом.Наборы данных из 9 изображений были сохранены в формате zvi для будущего количественного анализа. Программное обеспечение Zeiss Axiovision (версия 4.8.2) использовалось для измерения FRET сенсибилизированного излучения. Эффективность FRET была рассчитана на основе системы с тремя фильтрами, которая нормирована относительно интенсивностей доноров и акцепторов, что позволяет рассчитывать перекрестные помехи и проверять истинный сигнал FRET [24], [25]. Величина эффективности FRET рассчитывалась по формуле Ся [24]. Для каждого эксперимента были получены три случайно выбранных изображения.По этим изображениям была рассчитана эффективность FRET. От двух до трех областей интереса (ROI) были помещены для соответствующей ячейки, и от десяти до пятнадцати областей интереса были подвергнуты FRET-анализу.

Результаты

Создание клеточного биосенсора FRET

клеток рака молочной железы человека MB231 стабильно трансфицировали экспрессионной плазмидой, кодирующей слитый белок CFP-линкер-YFP (MB231_CFP-YFP), где CFP действует как донор, а YFP как акцептор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).Линкер содержит последовательности распознавания как каспазы 3, так и каспазы 8, DEVD и IETD соответственно, которые, как ожидается, будут чувствительны к лекарствам, функционирующим через , либо внутренние, либо внешние пути апоптоза. После активации каспазы после лечения лекарственным средством линкер, соединяющий CFP и YFP, будет расщеплен и впоследствии приведет к потере клеточного сигнала FRET. Эта методология позволяет использовать мощный биосенсор FRET, служащий маркером апоптоза (рис. 1А). Клеточная линия MB231 была выбрана в качестве клеточного субстрата, поскольку было показано, что она полностью чувствительна к целому ряду цитотоксических агентов, что подразумевает функциональную целостность аппарата апоптоза [3], [18].Ожидается, что такая клеточная платформа будет полезна для анализа эффективности различных противораковых препаратов.

Рис. 1. Клеточный биосенсор FRET.

(A) Схематическое изображение анализа FRET. Зонд FRET, CFP-линкер-YFP, экспрессируется как гибридный белок, содержащий CFP и YFP, связанные через пептидную последовательность из 16 аминокислот: GSGDEVDGGIETDGSG. Линкерная область содержит последовательности распознавания каспазы 3 (DEVD) и каспазы 8 (IETD), которые могут выборочно расщепляться соответствующими ферментами при индукции внутренних и / или внешних путей апоптоза.(B) Иммуноблот-анализ зонда CFP-линкер-YFP FRET, стабильно экспрессируемого в клетках MB231. (C) Клетки, экспрессирующие зонд CFP-линкер-YFP FRET, продуцировали значительный и стабильный сигнал FRET, клетки инкубировали в буфере PBS в течение 0-24 часов. (D) Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали иммуноочисткой из клеточного лизата MB231_CFP-YFP и визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (вверху) или с помощью анализа иммуноблоттинга (внизу). (E) Изменения FRET отслеживали, когда 100 нМ очищенного белка CFP-линкер-YFP инкубировали со 100 нМ рекомбинантной активной каспазой 3 (C3), каспазой 8 (C8) или каспазой 2 (C2) в течение 3 часов.Значения p определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g001

Сначала мы подтвердили экспрессию зонда CFP-линкер-YFP FRET с помощью анализа иммуноблоттинга, используя первичное антитело, которое распознает CFP и YFP. Сильная полоса, специфичная для интактного белка CFP-линкер-YFP (ожидаемая молекулярная масса 55 кДа), наблюдалась в лизате клеток MB231_CFP-YFP, но не в родительских клетках (рис. 1В). Затем мы определили, могут ли ячейки MB231_CFP-YFP обеспечивать приемлемый сигнал FRET.Чтобы исключить вывод из компонентов среды, среду для культивирования клеток аспирировали из клеток MB231_CFP-YFP, прикрепленных к 96-луночным микропланшетам. Буфер PBS был добавлен в каждую лунку, и сигнал FRET был рассчитан, взяв соотношение между эмиссией флуоресценции акцептора (530 ± 5 нм) и эмиссией флуоресценции донора (486 ± 5 нм), когда образцы возбуждали при 425 ± 10 нм с использованием флуоресценции. планшетный ридер. Действительно, в этих условиях значительный сигнал FRET был обнаружен для клеток MB231_CFP-YFP (рис. 1C).Примечательно, что зонд FRET оказался стабильным в клетках, погруженных в буфер PBS, на срок до 24 часов (рис. 1C). В качестве контроля параллельно анализировали нетрансфицированные родительские клетки MB231, которые не давали какого-либо значимого сигнала флуоресценции выше фонового шума при возбуждении на длине волны 425 ± 10 нм.

Иммунопреципитацию зонда CFP-линкер-YFP FRET проводили для подтверждения его селективности в отношении расщепления каспазой 3 и каспазой 8. Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали от клеточного лизата с использованием антитела против CFP / YFP, конъюгированного с шариками сефарозы.Связанный зонд FRET элюировали трис-буфером, содержащим 1 М NaCl. Изолированный зонд FRET был охарактеризован с помощью SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим (рис. 1D, вверху) и иммуноблот-анализом (рис. 1D, внизу). Для оценки специфичности каспазы очищенный зонд FRET инкубировали с рекомбинантными формами активной каспазы 3, каспазы 8 или каспазы 2. Изменения FRET отслеживали (рис. 1 E). Как и ожидалось, расщепление зонда FRET было специфичным для каспазы 3 и каспазы 8 и приводило к выраженному снижению сигнала FRET.Соответственно, расщепление зонда FRET полностью прекратилось, когда реакционную смесь инкубировали с ингибитором панкаспазы (Z-VAD). Напротив, при инкубации зонда CFP-линкер-YFP FRET с каспазой 2 практически не было обнаружено расщепление зонда FRET.

Квалификация биосенсора FRET для использования в тестировании активности для лечения рака, направленного на рецепторы смерти

С помощью стабильно трансфицированного зонда FRET мы сначала проверили его пригодность для измерения эффективности класса белков, которые индуцируют апоптоз, воздействуя на рецепторы смерти (DR). К ним относятся рекомбинантный человеческий TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к DR5, которые находятся в стадии разработки в многочисленных клинических испытаниях для лечения рака. Эти продукты действуют через DR4 и / или DR5, экспрессируемые на поверхности клеток-мишеней. После активации внутриклеточный домен смерти способствует сборке прокаспазы 8/10 и адапторного белка FADD в индуцирующий смерть сигнальный комплекс (DISC), что приводит к последовательной активации каспазы 8 и каспазы 3.Таким образом, эти агенты служат отличными зондами для тестирования сконструированного биосенсора FRET. Как ранее было показано для родительских клеток MB231 [18], клетки MB231_CFP-YFP сохраняли аналогичную чувствительность к TRAIL и антителам против DR5. Это было впервые продемонстрировано анализами жизнеспособности клеток на основе МТТ, когда клетки обрабатывали возрастающими концентрациями TRAIL или антитела против DR5. Аналогичная кривая доза-ответ и значение EC 50 были получены как для клеток parental_MB231, так и для клеток MB231_CFP-YFP при обработке TRAIL или антителом против DR5 (фиг. 2A и таблица 1).При анализе индукции апоптоза обе клеточные линии показали аналогичное дозозависимое увеличение апоптозных клеток после обработки TRAIL или антителом против DR5 (рис. 2В). Эти данные показывают, что трансфекция биосенсора FRET не влияла на клеточный ответ на терапию, направленную на DR. Стабильная линия клеток MB231_CFP-YFP, по-видимому, сохраняет интактный аппарат апоптоза, что поддерживает ее использование в качестве клеточного субстрата для тестирования цитотоксичности противораковых препаратов.

Рис. 2. Клетки MB231_CFP-YFP сохраняют чувствительность к TRAIL и антителам против DR5.

(A) Родительские клетки MB231 (закрашенные черным) и MB231_CFP-YFP (открытые прозрачные) обрабатывали TRAIL (0–100 нг / мл) в течение 2,5 ч или антителом против DR5 (0–200 мкг / мл) в течение 20 часов. ч при указанных концентрациях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализа. (B) Клетки обрабатывали, как в A, и анализировали на апоптоз проточной цитометрией после окрашивания аннексином-V-APC и йодидом пропидия (PI). p-значения были определены с использованием t-критерия Стьюдента. Значения EC 50 были определены с использованием аппроксимации нелинейной кривой, как описано в разделе «Материалы и методы».Для каждого значения EC 50 95% доверительные интервалы, отражающие статистическую точность, представлены в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g002

Затем мы оценили расщепление зонда FRET в ответ на лечение TRAIL или антителом против DR5. С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали TRAIL и антителом против DR5. Иммуноблот-анализ выявил корреляцию между активацией каспазы и расщеплением зонда CFP-линкер-YFP FRET при всех уровнях доз (рис. 3A и 3B).

Рисунок 3. Расщепление зонда FRET указывает на активацию каспазы.

Клетки обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов или (B) 0–50 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. Полученные клетки анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к каспазе 3 (C3), каспазе 8 (C8) и CFP / YFP.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g003

Для измерения FRET клетки MB231_CFP-YFP культивировали в 96-луночных планшетах в течение ночи в среде DMEM.Среду для культивирования клеток удаляли и буфер PBS, содержащий различные концентрации TRAIL или антитела против DR5, добавляли к прикрепленным клеткам на 2,5 часа и 20 часов соответственно. В указанные моменты времени сигналы FRET были непосредственно измерены на отдельных образцах с настройкой возбуждения 425 ± 10 нм и настройкой излучения 530 ± 5 нм для YFP и 486 ± 5 нм для CFP с использованием флуоресцентного ридера для планшетов. Дозозависимое снижение FRET было идентифицировано с увеличением концентрации TRAIL и антител против DR5 (фиг. 4A и 4B).Значения FRET были нормализованы и нанесены на график в зависимости от логарифмического значения TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (рис. 4A и 4B), что дало значения EC 50 после подгонки нелинейной кривой к уравнению 2 (таблица 1). Примечательно, что анализ FRET дал значения EC 50 , которые согласуются со значениями из обычных анализов (MTT, проточная цитометрия и анализ иммуноблоттинга). В совокупности эти данные подтверждают использование клеточного анализа FRET для анализа биологической активности терапии, нацеленной на DR.Конфокальная микроскопия также использовалась для оценки изменения клеточного FRET, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались TRAIL (рис. 4C). Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL с настройкой возбуждения = 458 нм.

Рис. 4. Клеточный биосенсор FRET обеспечивает поддающийся количественной оценке ответ на лечение рака, нацеленного на рецепторы смерти.

Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL для 2.5 часов и (B) 0–100 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. FRET был рассчитан и представлен в виде гистограмм в левой части панели. Значения ЕС 50 определяли путем подгонки нелинейной кривой к нормированным значениям FRET, построенным против логарифмических значений TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях (правая часть панели). (C) Изображения конфокальной микроскопии, показывающие изменения FRET в клетках MB231_CFP-YFP, обработанных 0-25 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов. Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL, с настройкой возбуждения = 458 нм.Статистический анализ проводился как на рис. 1 и 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g004

Применение клеточного FRET-анализа для оценки биологической активности химиотерапевтических средств против рака

Мы спросили, может ли сконструированный зонд FRET быть адаптирован для анализа низкомолекулярных лекарств, которые функционируют посредством модуляции внутренних сигнальных путей апоптоза. К этой категории относятся многие классические химиотерапевтические препараты. Сначала мы протестировали стауроспорин и камптотецин, поскольку оба они известны как мощные индукторы апоптоза в различных типах клеток [7], [26].С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали стауроспорином или камптотецином. Дозозависимое снижение FRET наблюдалось при увеличении концентрации каждого отдельного агента (рис. 5А). Аппроксимация нелинейной кривой дала значения EC 50 , которые, в частности, сравнимы со значениями, полученными с помощью МТТ-анализа (рисунок 5B, таблица 1). Мы расширили исследование, включив в него несколько других химиотерапевтических препаратов, включая этопозид, компактин, 5-ФУ и таксол. Эти препараты действуют через генотоксический и цитоскелетный стресс и приводят к последующему подавлению роста и / или апоптотической гибели клеток, в зависимости от условий эксперимента и целевых клеток [5] — [7].Соответственно, наблюдаемые изменения сигнала FRET были идентифицированы, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались каждым химиотерапевтическим агентом (рис. 5C). Однако их способность индуцировать апоптоз, зависящий от каспазы 3/8, оказалась намного ниже, чем у TRAIL или антител против DR5, что требует как высокой концентрации (100 мкг / мл), так и более длительных периодов инкубации (72 часа) по сравнению с эффективностью. TRAIL (EC50 ∼0,05–0,08 нМ) и анти-DR5 (EC50 ∼0,24–0,80 нМ). Эти данные демонстрируют способность клеточного зонда FRET количественно определять активность, индуцирующую апоптоз, как биологических, так и химиотерапевтических агентов.Путем точной настройки экспериментальных условий тесты FRET можно использовать для прямого сравнения биологической активности различных противораковых препаратов in vitro.

Рис. 5. FRET-анализ биоактивности химиотерапевтических агентов.

(A) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали 0–100 мкг / мл стауроспорина в течение 20 часов и 0–1,7 мкг / мл камптотецина в течение 72 часов. Дозозависимые изменения сигналов FRET определяли, как показано на рис. 4. (B) МТТ-анализ использовали для оценки жизнеспособности клеток в ответ на обработку клеток parental_MB231 (закрашено черным цветом) и MB231_CFP-YFP (открытое прозрачное) 0-25 мкг. / мл стауроспорина в течение 20 ч и 0–7.7 мкг / мл камптотецина в течение 72 ч соответственно. (C) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали химиотерапевтическими агентами (100 мкг / мл) в течение 72 часов. Измерение и анализ FRET выполняли, как показано на рис. 4. Статистический анализ выполняли, как на рис. 1 и 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g005

Обсуждение

Мы разработали клеточный биосенсор FRET для измерения активности препаратов, вызывающих апоптоз. Наш анализ FRET, по-видимому, превосходит другие обычно используемые анализы апоптоза, учитывая его простоту, стабильность, удобство и надежность.Мы ожидаем, что с учетом этих преимуществ, стабильно экспрессируемый зонд FRET может быть адаптирован для использования в будущих исследованиях по открытию и разработке соответствующих лекарств.

Целью лечения рака является уничтожение раковых клеток. Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы отразить механизм действия лекарственного средства, то есть индуцировать апоптоз или другие формы гибели клеток. Апоптоз — распространенная форма гибели клеток, связанная с лечением рака как in vitro , так и in vivo . Для обнаружения и измерения апоптоза доступно несколько методов, включая проточную цитометрию, микроскопию, иммуноблоттинг и анализы на основе каспазных субстратов [14], [27] — [29].Эти методологии являются мощными исследовательскими инструментами при изучении апоптоза, но каждый метод связан с присущими ему ограничениями, включая, помимо прочего, невозможность оптимизации с высокой пропускной способностью, изменчивость, связанную с проницаемостью клеток материалов, необходимых для сигнала считывания, требованием клетки лизис и высокий фоновый шум [17]. Из-за этих ограничений все еще существует потребность в стандартном и надежном анализе апоптоза. Хотя несколько групп сообщили о клеточной экспрессии слитого белка на основе GFP, который может действовать как субстрат каспазы и обнаруживать изменения в клеточном FRET при индукции апоптоза, методы обнаружения в этих случаях в первую очередь полагались на конфокальную микроскопию и проточную цитометрию [15], [15] [ 30] — [33]. Предоставляя ценную информацию, эта рабочая процедура не идеальна для надежного и высокопроизводительного анализа активности. Примечательно, что есть редкие сообщения, в которых используется формат планшетов с пропускной способностью [34], [35]. Наш клеточный FRET-анализ позволяет беспрецедентно определять активность каспазы 3 и каспазы 8 в формате микропланшета с использованием линии клеток рака груди человека. Эта комбинация каспаз позволяет охарактеризовать любой агент, который может индуцировать апоптоз внутренним или внешним путем, или обоими способами.Кроме того, наша методология была специально адаптирована для устранения фоновой автофлуоресценции, связанной со средой для культивирования клеток; это помогает достичь улучшенного отношения сигнал / шум и позволяет избежать сильного вычитания фона, что может усложнить вычисления FRET. Кроме того, наша работа строго сосредоточена на пригодности описанного анализа для функционирования в качестве теста на эффективность сложных белковых препаратов, нацеленных на рецепторы смерти, в то время как другие работы в основном сосредоточены на открытии низкомолекулярных лекарств.

Одно из ограничений нашего анализа связано с доступностью молекулярных мишеней в клетках MDA-MB-231 для конкретной молекулы лекарственного средства. Например, известно, что клетки MDA-MB-231 обладают недостаточной экспрессией рецептора Her2, что делает анализ непригодным для оценки моноклональных антител против HER2, одобренных для использования при лечении рака груди. Этот недостаток, однако, можно легко устранить либо путем экспрессии зонда CFP-YFP FRET в HER2-положительной линии клеток, либо путем трансфекции HER2 в линию клеток MB231_CFP-YFP.В принципе, стабильные клетки MB231_CFP-YFP могут служить в качестве матрицы, которая может быть сконструирована для экспрессии молекулярной мишени (мишеней) для конкретного лекарственного средства. Кроме того, зонд CFP-YFP FRET может быть включен в другие линии раковых клеток для тестирования соответствующих интересующих лекарств. Следует также отметить, что описанный зонд FRET не подходит для лекарств, которые убивают раковые клетки посредством независимых от каспаз механизмов, или лекарств, убивающих клетки посредством активации каспаз, отличных от каспазы 3 или 8, таких как апоптоз или некроптоз, опосредованный каспазой 2. Тем не менее, анализ FRET, описанный в этой работе, позволяет осуществлять одноэтапное обнаружение и измерение апоптоза для обработанных клеток, что делает его привлекательным подходом к быстрому и надежному анализу эффективности противораковых препаратов или лекарств-кандидатов, которые вызывают каспазозависимый апоптоз. Важно отметить, что платформа на основе FRET также позволяет различать препараты, вызывающие гибель клеток, и препараты, вызывающие ингибирование роста, что, в свою очередь, может определять выбор комбинированной терапии для лучшего результата лечения рака.

Благодарности

Мы благодарим докторов наук. Эми Розенберг и Серж Бокаж за критическое прочтение рукописи. Отказ от ответственности: комментарии и обсуждения в этой статье основаны на наших экспериментальных данных и обзоре соответствующих научных публикаций. Они не обязательно отражают официальную точку зрения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в отношении анализов активности для использования при оценке онкологических лекарственных препаратов.

Вклад авторов

Эксперименты задуманы и спланированы: БЖ.Проведены эксперименты: WB XD KT SP. Проанализированы данные: WB XD KT LR. Участвовал в написании рукописи: BZ WB XD LR.

Ссылки

  1. 1. Waldman SA (2002) Предсказывает ли потенция клиническую эффективность? Иллюстрация через антигистаминную модель. Ann Allergy Asthma Immunol 89: 7–11 S1081-1206 (10) 61904-7 [pii]; 10.1016 / S1081-1206 (10) 61904-7 [doi].
  2. 2. Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ и др. (1988) Возможность скрининга лекарств с панелями линий опухолевых клеток человека с использованием анализа тетразолия в микрокультурах.Cancer Res 48: 589–601.
  3. 3. Shoemaker RH (2006) Скрининг противоопухолевых препаратов линии опухолевых клеток человека NCI60. Nat Rev Cancer 6: 813–823 nrc1951 [pii]; 10.1038 / nrc1951 [doi].
  4. 4. Кремер Дж., Галлуцци Л., Ванденабил П., Абрамс Дж., Алнемри Е.С. и др. (2009) Классификация клеточной смерти: рекомендации Номенклатурного комитета по клеточной смерти 2009. Cell Death Differ 16: 3–11 cdd2008150 [pii]; 10.1038 / cdd.2008.150 [doi].
  5. 5. Хагг М., Бивен К., Уэно Т., Ридлендер Л., Бьорклунд П. и др.(2002) Новый тест с высокой пропускной способностью для скрининга проапоптотических препаратов. Инвестируйте новые лекарства 20: 253–259.
  6. 6. Ли Y, Yu J, DU D, Fu S, Chen Y и др. (2013) Участие посттранскрипционной регуляции FOXO1 с помощью HuR в 5-FU-индуцированном апоптозе в клетках рака молочной железы. Oncol Lett 6: 156–160 10.3892 / ol.2013.1352 [doi]; ol-06-01-0156 [pii].
  7. 7. Степчинска А., Лаубер К., Энгельс И.Х., Янссен О., Кабелиц Д. и др. (2001) Стауроспорин и обычные противоопухолевые препараты вызывают перекрывающиеся, но разные пути апоптоза и активации каспаз.Онкоген 20: 1193–1202 10.1038 / sj.onc.1204221 [doi].
  8. 8. Абдулгани Дж., Эль-Дейри В.С. (2010) Передача сигналов рецептора TRAIL и терапия. Мнение эксперта Ther Targets 14: 1091–1108 10.1517 / 14728222.2010.519701.
  9. 9. Zhou L, Wang W, Dicker DT, Humphreys RC, El-Deiry WS (2011) Прогнозирование проапоптотического противоракового терапевтического ответа in vivo на основе визуализации клеточной смерти и взаимодействия лиганд-рецептор смерти TRAIL. Cancer Biol Ther 12 335–348: 17174.
  10. 10.Walczak H (2013) Системы рецептор-лиганд смерти при раке, гибели клеток и воспалении. Колд-Спринг-Харб Perspect Biol 5: a008698 5/5 / a008698; 10.1101 / cshperspect.a008698.
  11. 11. Джонстон Р.В., Фрю А.Дж., Смит М.Дж. (2008) Путь апоптоза TRAIL в возникновении, прогрессировании и терапии рака. Nat Rev Cancer 8: 782–798, nrc2465; 10.1038 / nrc2465.
  12. 12. Smith GS, Voyer-Grant JA, Harauz G (2012) Мониторинг активности расщепленной каспазы-3 и апоптоза иммортализованных олигодендроглиальных клеток с использованием визуализации живых клеток и расщепляемых субстратов флуорогенного красителя после индуцированной калием деполяризации мембраны. J Vis Exp. 3422 [pii]; 10,3791 / 3422 [doi].
  13. 13. Prasuhn DE, Feltz A, Blanco-Canosa JB, Susumu K, Stewart MH, et al. (2010) Пептидные биосенсоры на квантовых точках для мониторинга протеолиза каспазы 3 и ионов кальция. ACS Nano 4: 5487–5497 10.1021 / nn1016132 [doi].
  14. 14. Kaufmann SH, Kottke TJ, Martins LM, Henzing AJ, Earnshaw WC (2001) Анализ активации каспаз во время апоптоза. Curr Protoc Cell Biol Глава 18: Единица. 10.1002 / 0471143030.cb1802s11 [doi].
  15. 15. Wu X, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE, et al. (2006) Измерение активности двух каспаз одновременно в живых клетках с помощью нового двойного флуоресцентного индикаторного зонда FRET. Cytometry A 69: 477–486 10.1002 / cyto.a.20300 [doi].
  16. 16. Wang ZQ, Liao J, Diwu Z (2005) N-DEVD-N’-морфолинкарбонил-родамин 110: новые флуорогенные субстраты каспазы-3 для клеточного анализа апоптоза. Bioorg Med Chem Lett 15: 2335–2338 S0960-894X (05) 00274-X [pii]; 10. 1016 / j.bmcl.2005.02.081 [doi].
  17. 17. Brunelle JK, Zhang B (2010) Анализы апоптоза для количественной оценки биоактивности противоопухолевых лекарственных препаратов. Обновление Drug Resist 13: 172–179 S1368-7646 (10) 00039-7 [pii]; 10.1016 / j.drup.2010.09.001 [doi].
  18. 18. Zhang Y, Zhang B (2008) TRAIL-резистентность клеток рака молочной железы связана с конститутивным эндоцитозом рецепторов смерти 4 и 5. Mol Cancer Res 6: 1861–1871 6/12/1861 [pii]; 10.1158 / 1541-7786.MCR -08-0313 [doi].
  19. 19. Zhang Y, Rivera Rosado LA, Moon SY, Zhang B (2009) Подавление D4-GDI ингибирует рост и инвазивное поведение в клетках MDA-MB-231 за счет активации Rac-зависимой передачи сигналов p38 и JNK. J Biol Chem 284: 12956-12965 M807845200 [pii]; 10.1074 / jbc.M807845200 [doi].
  20. 20. Zhang B, Zhang Y, Dagher MC, Shacter E (2005) Ингибитор диссоциации Rho GDP защищает раковые клетки от апоптоза, вызванного лекарствами. Cancer Res 65: 6054–6062 65/14/6054 [pii]; 10. 1158 / 0008-5472.CAN-05-0175 [doi].
  21. 21. Мастерс А., Харрисон П. (2013) Подсчет тромбоцитов с помощью проточного цитометра BD Accuri C6. Тромбоциты. 10.3109 / 09537104.2013.801947 [doi].
  22. 22. van RJ, Langeslag M, Jalink K (2004) Корректировка конфокального сбора для оптимизации отображения резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью сенсибилизированного излучения. Biophys J 86: 2517–2529 S0006-3495 (04) 74307-6 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (04) 74307-6 [doi].
  23. 23. Клегг Р.М. (1996) Флуоресцентный резонансный перенос энергии.В: X.F.Wang, B.Herman, редакторы. Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия. 179–252.
  24. 24. Xia Z, Liu Y (2001) Надежное и глобальное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов. Biophys J 81: 2395-2402 S0006-3495 (01) 75886-9 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (01) 75886-9 [doi].
  25. 25. Gordon GW, Berry G, Liang XH, Levine B, Herman B (1998) Количественные измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии с использованием флуоресцентной микроскопии. Biophys J 74: 2702–2713 S0006-3495 (98) 77976-7 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (98) 77976-7 [doi].
  26. 26. Nieves-Neira W, Pommier Y (1999) Апоптотический ответ на камптотецин и 7-гидроксистауроспорин (UCN-01) в 8 клеточных линиях рака груди человека из NCI Anticancer Drug Screen: многофакторные взаимосвязи с топоизомеразой I, протеинкиназой C, Bcl- 2, p53, MDM-2 и каспазные пути. Int J Cancer 82: 396–404 10.1002 / (SICI) 1097-0215 ​​(199

    ) 82: 3 <396 :: AID-IJC13> 3.0.CO; 2-Z [pii].

  27. 27. Демченко А.П. (2012) Изменение клеточных мембран при апоптозе: детекция флуоресценции. Опыт Онкол 34: 263–268. 3559 [pii].
  28. 28. Muppidi J, Porter M, Siegel RM (2004) Измерение апоптоза и других форм гибели клеток. Curr Protoc Immunol Глава 3: Блок. 10.1002 / 0471142735.im0317s59 [doi].
  29. 29. Крыско Д.В., Ванден Берге Т., Д’Херде К., Ванденабеле П. (2008) Апоптоз и некроз: обнаружение, различение и фагоцитоз.Методы 44: 205–221 S1046-2023 (08) 00002-9 [pii]; 10. 1016 / j.ymeth.2007.12.001 [doi].
  30. 30. He L, Wu X, Meylan F, Olson DP, Simone J и др. (2004) Мониторинг активности каспаз в живых клетках с использованием флуоресцентных белков и проточной цитометрии. Am J Pathol 164: 1901–1913 S0002-9440 (10) 63751-0 [pii]; 10.1016 / S0002-9440 (10) 63751-0 [doi].
  31. 31. Kawai H, Suzuki T, Kobayashi T., Sakurai H, Ohata H, et al .. (2005) Одновременное обнаружение в реальном времени активации инициатора и эффекторной каспазы с помощью анализа переноса энергии двойного флуоресцентного резонанса.J Pharmacol Sci 97: 361–368. JST.JSTAGE / jphs / FP0040592 [pii].
  32. 32. Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2001) Применение метода флуоресцентного резонансного переноса энергии для изучения динамики активации каспазы-3 во время УФ-индуцированного апоптоза в живых клетках HeLa. Biochem Biophys Res Commun 283: 1054-1060 10.1006 / bbrc.2001.4896 [doi]; S0006-291X (01) 94896-X [pii].
  33. 33. Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2003) Измерение динамики активации каспазы-8 в одной живой клетке HeLa во время апоптоза, индуцированного TNFalpha. Biochem Biophys Res. Commun. 304: 217–222. S0006291X0300559X [pii].
  34. 34. Jones J, Heim R, Hare E, Stack J, Pollok BA (2000) Разработка и применение внутриклеточного анализа каспазы GFP-FRET для скрининга лекарств. J Biomol Screen 5: 307–318.
  35. 35. Zhu X, Fu A, Luo KQ (2012) Анализ апоптоза эндотелиальных клеток на основе высокопроизводительного флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и его применение для скрининга агентов, разрушающих сосуды. Biochem Biophys Res Commun 418: 641–646 S0006-291X (12) 00100-3 [pii]; 10.1016 / j.bbrc.2012.01.066 [doi].

(PDF) Резонансный перенос энергии Форстера (FRET) с донорно-акцепторной системой, адсорбированной на серебряных или золотых наноостровках

с 300 нм (сплошная линия). Перекрытие между флуоресцентным излучением

и полосой рассеяния подложки с покрытием из серебра

отличное. Напротив, спектр покрытой золотом подложки

полностью отстроен от излучения флуорофора.

22

Следовательно, серебро представляется лучшим выбором, в то время как золото

может оказать пагубное влияние на работу соединения 1

.

Выводы

Мы изучили FRET-свойства SAM новой

ковалентно связанной донорно-акцепторной пары D – A, состоящей из

двух нафталиновых групп, действующих как доноры, и бензофуразановой группы

, действующей как акцептор и адсорбированной на Ag и Au

NIF. Спектроскопия SERS подтвердила его адсорбцию на металле

даже без какой-либо конкретной функционализации и предоставила

информацию о природе хемосорбции. Для обоих металлов

мы наблюдали хорошо разрешенный эффект FRET, характеризуемый

интенсивным сигналом флуоресценции в зеленой области спектра

, который был вдвое более интенсивным в случае НИФ Ag

.Хотя наши тесты не могут помочь дать окончательное объяснение этого результата

, тем не менее наш АСМ-анализ и спектроскопия экстинкции

показывают, что ценный вклад в

флуоресцентного излучения антенны на серебре можно отнести к резонансам рассеяния. , что согласуется с моделью излучающего плазмона

. В этом кадре мы можем заключить, что

процесс автоорганизации, используемый для создания металлических структур нано-

, более благоприятен для путей радиационного распада на

AgNIF по сравнению с AuNIF.

Такие открытия могут помочь в разработке подходящих металлических подложек

, которые эффективно преобразуют передачу энергии, которая происходит внутри молекулы

, в излучение. Перспективным применением

является разработка флуоресцентных хемосенсоров.

23

Например, предварительные испытания показали, что контакт

SAM соединения 1 на Ag с водными растворами

, содержащими следы Cu

2+

, вызывает чистое и избирательное тушение

Флюоресценция.В этом смысле будущая работа

будет сосредоточена на разработке SAM новых систем D – A, содержащих

групп D, поглощающих в видимой области электромагнитного спектра

, где доступны дешевые источники в виде лазерных диодов.

Возможность работы с видимыми длинами волн

также откроет путь к использованию распространения поверхностных плазмонов

на границах раздела серебро / хромофор, что представляет собой мощную

альтернативу использованию локализованных поверхностных плазмонов для эффективного усиления

финальной флуоресценции.

24

Благодарности

Финансирование от итальянского FIRB 2004 «Молекулярные соединения

и гибридные наноструктурированные материалы с резонансными и не

резонансными оптическими свойствами для фотонных устройств» (номер контракта

RBNE033KMA) и от PRIN 2007 Подтвержден договор «Металлоорганические плазмонные наноструктуры

для сенсоров» №1 2007LN873M_002

.

Список литературы

1 А. Андронов и Дж. М. Фреше

´

т, Chem.Commun., 2000, 1701;

F. V. R. Neuwahl, R. Righini, A. Andronov, P. R. Malenfant и

J. M. Freche

´

t, J. Phys. Chem. В, 2001, 105, 1307; A. Bar-Haim,

J. Klafter и R. Kopelman, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119,

6197; A. W. Freeman, S. C. Koene, P. R. L. Malenfant,

M. E. Thompson и J. M. Freche

´

t, J. Am. Chem. Soc., 2000,

,

, 122, 12385; В. Бальзани, П. Черони, М. Маэстри, К.Саудан и

В. Вичинелли, верх. Curr. Chem., 2003, 288, 159; V. Balzani,

P. Ceroni, M. Maestri и V. Vicinelli, Curr. Opin. Chem. Биол.,

2003, 7, 657; D. W. Brousmiche, J. M. Serin, J. M. J. Fre

´

chet,

G. S. He and R. Kannan, J. Phys. Chem. B, 2004, 108, 8592.

2 L. Basabe-Desmonts, D. N. Reinhoudt и M. Crego-Calama,

Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 993; К. Э. Сапсфорд, Л. Берти и

И.Л. Мединц, Angew. Chem., Int. Ed., 2006, 45, 4562.

3 A. B. Doust, X. Yang, T. E. Dykstra, K. Koo and G. D. Scholes,

Appl. Phys. Lett., 2006, 89, 213505.

4 PL Gentili, M. Mugnai, L. Bussotti, R. Righini, P. Foggi,

S. Cicchi, G. Ghini, S. Viviani and A. Brandi, J Photochem.

Photobiol. A: Chem., 2006, 18, 209.

5 (a) G. Calzaferri, H. Li, Proc. SPIE, 2008,7002,

700202-1–700202-7; (b) А.З. Руис, Х. Ли и Г.Calzaferri, Angew.

Chem., Int. Ed., 2006, 45, 5282; (c) Х. Спанггаард, Ф. К. Кребс,

М. Йоргенсен, Н. Розлосник, Н. Б. Ларсен и О. Хагеманн, Proc.

SPIE – Int.Soc.Opt.Eng., 2005, 5938,59380V; (d) M.Sakomura,

T. Takagi, H. Nakayama, R. Sawada и M. Fujihira, Colloids

Surf., A, 2002,198–200 769.

6 Э. Джорджетти, М. Мунис-Миранда, Г. Маргери, А. Джусти,

С. Соттини, М. Аллоизио, К. Куниберти и Г. Деллепиане, Лангмюр,

2006,

22, 1129 .

7 J. R. Lakowicz, Anal. Biochem., 2005, 337, 171.

8 M. P. Kreuzer, R. Quidant, J. P. Salvador, M. P. Marco и

G. Badenes, Anal. Биоанал. Chem., 2008, 391, 1813.

9 Н. Т. Ким, З. Розенцвейг, Anal. Chem., 2002, 74, 741624.

10 WS Rasband, ImageJ, Национальные институты здравоохранения США,

Bethesda, Мэриленд, США, http://rsb. info.nih.gov/ij/, 1997.

11 I. Horcas, R. Ferna

´

ndez, JM Go

´

mez-Rodrı

´

guez and J.Colchero,

Rev. Sci. Instrum., 2007, 78, 13705.

12 H. Morawitz, M. R. Philpott, Phys. Ред. B: Конденс. Matter

Mater. Phys., 1974, 10, 4863.

13 Х. Беккер, С. Э. Бернс, Р. Х. Френд, Phys. Ред. B: Конденс.

Matter Mater. Phys., 1997, 56, 1893.

14 J. Zhang, Yi. Fu, J. R. Lakowicz, J. Phys. Chem. C, 2007,

111 (1), 50.

15 K. LanceKelly, E. Coronado, Lin Lin Zhao и G.C.Shatz,

J.Phys. Chem. B, 2003, 107, 668.

16 H. Heberer and H. Matschiner, J. Prakt. Chem., 1986, 328, 261.

17 A. M. Schwartzberg, C. D. Grant, A. Wolcott, C. E. Talley,

T. R. Huser, R. Bogomolni и J. Z. Zhang, J. Phys. Chem. B,

2004, 108, 19191.

18 К. Дж. Аддисон и А. Г. Броло, Langmuir, 2006, 22, 8696.

19 С. К. Гош и Т. Пал, Chem. Rev., 2007, 107, 4797.

20 A. A. Lazarides, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. В, 2000, 104, 460.

21 KH Su, QH Wei, X. Zhang, JJ Mock, DR Smith и

S. Schultz, Nano Lett., 2003, 3, 1087.

22 Y. Chen, K. Munechika и DS Ginger, Nano Lett., 2007,

7 (3), 690.

23 M. Arduini, S. Marcuz, M. Montolli, E. Rampazzo, F. Mancin,

S. Gross, L. Armelao, P. Tecilla and U. Tonellato, Langmuir, 2005,

21, 9314.

24 T. Neumann, ML Johansson, D. Kambhampati and W. Knoll,

Adv. Funct.Матер.

, 2002, 12, 575.

Рис. 8 Спектры экстинкции AgNIF с 1 покрытием (пунктирная линия),

AuNIF с покрытием 1 (штриховая линия) и флуоресцентное излучение раствора этанола

из 1 для возбуждения с 300 нм (сплошная линия).

Номер этого журнала:

c

Общества владельцев 2009 Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11, 9798–9803 | 9803

Флуоресцентный резонансный перенос энергии между квантовыми точками углерода и наночастицами серебра: применение для зондирования ионов ртути

Основные моменты

Флуоресцентные квантовые точки углерода (C-точки) были синтезированы с использованием лимонной кислоты и диметилглиоксима.

Флуоресцентное излучение C-точек было уменьшено наночастицами Ag посредством процесса FRET.

Уменьшение интенсивности флуоресценции FRET было восстановлено в присутствии иона Hg (II).

Новый флуоресцентный датчик включения / выключения был сконструирован для определения следовых количеств иона Hg (II).

Метод был использован для оценки содержания ионов Hg (II) в воде, промышленных сточных водах и образцах чая.

Abstract

Процесс резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в качестве практической и конкурентной стратегии зондирования был использован между квантовыми точками углерода (C-точки) и наночастицами серебра (НЧ Ag) для определения ионов ртути. Новые синтезированные C-точки с квантовым выходом 84% действовали как донор, а наночастицы Ag действовали как акцептор в процессе FRET, приводя к тушению флуоресценции C-точек. В присутствии ионов Hg (II) подавленное FRET излучение флуоресценции системы C-точки – НЧ Ag восстанавливалось за счет окисления НЧ Ag ионами Hg (II), так что интенсивность флуоресценции при включении непосредственно определялась. пропорциональна концентрации ионов Hg (II).Соответственно, комбинация системы FRET с окислительно-восстановительной реакцией была впервые использована для создания инновационного флуоресцентного датчика выключения / включения для количественного определения иона Hg (II). Градуировочный график был линейным в диапазоне концентраций 0,5–500,0 нмоль л –1 с коэффициентом детерминации ( R 2 ) 0,9965. Предел обнаружения и предел количественного определения составляли 0,10 и 0,35 нмоль л -1 , соответственно, согласно определению IUPAC.Этот метод применялся для определения иона Hg (II) в озерной воде, сточных водах и образцах чая, и для образцов с добавками были получены соответствующие относительные извлечения (98,0–104,0%). Этот метод имеет высокий потенциал для диагностики следовых количеств ионов ртути в реальных образцах с высокой чувствительностью и воспроизводимостью.

Ключевые слова

Ион ртути

Квантовые точки углерода

Наночастицы серебра

Флуоресцентный резонансный перенос энергии

Редокс-реакция

Флуоресцентный датчик

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Просмотреть полный текст

© 2020 Elsevier B.V. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Свитки Среднего Царства

Все тексты, перечисленные на эта страница соответствует рекомендациям, изложенным в 3-е издание Писца Среднего царства Справочник. Моя цель предложить как минимум два версии текста прокрутки для каждой награды, но это трудоемкий проект, так что терпите меня. Если у вас есть уникальный текст, который вы хотели бы поделитесь и добавили сюда, не стесняйтесь отправить его по электронной почте Бесс @ denevell. com.
  • Для дополнительной помощи с нестандартными текстами следующие эти веб-сайты.

Индекс наград Поднебесной


Оружейная награда , неизвестное устройство — из 3 rd издания Писец Справочник стр. 27

Провозгласить на всем протяжении царство, которое мы <имя государя>, король <королева> Поднебесной, и наша королева , передай привет и благодарность от наших <место проведения мероприятия>.Знай, что мы в знак признания добрых дел и поступков <имя получателя>, особенно по <конкретной причине>, стремятся сделать ему / ей и награда за оружие. Мы дарим он / она имеет право на ношение оружия, как должным образом зарегистрировано в обществе и все права и обязанности, переданные повышением в этом звании без позволения или препятствий со стороны кого-либо из этого день вперед. Совершено нашими руками в <день> <месяца> Anno Societatis <год> из нашего <места события>.

Award of Arms , короткая версия Бесс

Воистину Мы <король и королевы name> Regnum Mediterranae уважаем его / ее <причина награждения> наградить <получатели name> Оружейная награда. Дано нашими руками это <день> из <месяца> А.С. <год> в нашем <месте дано>.

Оружейная награда , титул, именной герб & эмблема Bess

Да будет известно всем добрые джентльмены во всем нашем королевстве, которых Мы <имя государь> король <королева> по праву герба Поднебесной и наши самые великолепная Королева <Король> любви и красоты, имеющая хорошо взвесил дела и труды нашего доброго субъект <имя получателя> в <причина награждения> в знак признания его / ее достижений, разумных наложить на него / ее и награду за оружие.Таким образом, мы передать лорду / леди <имя получателя> <полный герб> как показано на полях для оружия в пределах Общество, без позволения и препятствий со стороны кого-либо, и все сопутствующие права и обязанности при таком возвышении в этом звании с этого дня вперед. Награжден нашей рукой в ​​ день <месяц> Anno Societatis <год общества>, в нашем <место происшествия> в свидетельских показаниях поставить нашу руку и печать.

Вернуться к началу


Королевский Аугментация оружия — с 3-го рд издание Scribal Handbook стр. 27

Провозгласим всей земле, что <имя государя> Король, <королева> по праву герба Поднебесной и <имя супруги>, наша королева <король>, были свидетелями службы, с которой <имя получателя> проиллюстрировал идеалы, которые мы стремимся отстаивать, и поэтому мы хотим признать его / ее подходящим и приличным образом с некоторым видимым знаком нашего уважения.Мы хочет дать ему / ей Королевское увеличение Оружие в знак признания его деяний. Это будет конкретное обвинение, означающее нашу признательность и поощрение в соответствии с обоими его / ее пожеланиями и Правилами Коллегии вооружений Knowne World. Совершено нашими руками <дата> день <месяц>, Anno Societatis <год>, в нашем <местонахождении событие>.

К началу


Kingdom Augmentation of Arms — из 3 rd издание Scribal Handbook стр. 27

** В связи с особым характером этой награды офис Dragon Herald предпочитает писца получить конкретную формулировку от их величеств на время переуступки **

Формулировка Kingdom Augmentation of Arms, используемая для Мастер Дафидд Блейд (просмотреть прокрутить здесь)

Знаем все, что мы, Вальхарик и Алис, король и Королева Поднебесной настоящим заявляет, что Дафид Блейд отдал свое сердце и душу через его долгое и преданное служение Нашему царству. Он отдал свое время, свою энергию и части своей личной жизни, чтобы обеспечить всех граждан MidRealm с электронным информационным сайтом. За его самоотверженное создание, поддержку и предоставление этого сайта, различных списков и ссылок, и испытания и невзгоды, связанные с усилия такого масштаба, хотим ли мы признать его видимым знаком нашего уважения и признательность всего Королевства. Мы поэтому даруй ему Увеличение Царства Оружие, дающее ему право носить серебряный бледный красный в целом дракон верт, в его объятия в в соответствии с его пожеланиями и правилами Колледж оружия. Совершено 26 мая Анно Societatis XXXVII, сидя на наших тронах в наш Шир Миннида Серена.

К началу


Заказать Королевского Авангарда — из 3 ряд издание Scribal Handbook стр.27

Пусть все люди в нашем Царстве услышат провозглашение, что мы <имя государя> король <королева> по праву оружия Поднебесной, и <имя супруги>, — изложила наша королева <король>. Знать что с учетом его / ее выдающихся услуги в качестве чемпиона наших королей / королевы настоящим сделать <имя получателя> Сподвижником нашего Ордена Королевский авангард.Мы отдаем ему / ей все права и обязанности, связанные с этим Орден и право ношения нагрудного знака Ордена: Бесполевой, безудержный серебряный полудракон. Сделано наши руки в этот <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год> in out <место происшествия>.

К началу


Премия Сапфир — из 3 выпуска rd Писец Справочник стр.27

Провозгласить всему нашему Царству, что мы <имя государь>, король <королева> по праву герба Поднебесной, и <имя супруга>, наш Королева <король>, передай сердечный привет. Знай, что это одно из удовольствий короны узнавать люди, которые проявляют большую вежливость, грацию и честь людям всех рангов, и которые служат примером это значит быть воплощением Мечты. Таким образом, мы намерены сделать <имя получателя> Награда Сапфир. Мы дарим на нем / ней все права и обязанности связаны с Сапфиром и правом обнажать значок: Fieldless — лазурный драгоценный камень ступенчатой ​​огранки. Совершено нашими руками <дата> день <месяца> А.С. <год> в нашем <месте проведения мероприятия>.

Награда Sapphire — от Bess

Все добрые дворяне и дворяне знают Срединное царство, которое мы <имя государя> и <имя консорта> Regnum Mediterranae, пришлите вам наши самые сердечные приветствия. Это один из великих радость короны узнавать людей, которые проявлять вежливость, изящество и честь ко всем людям разряды и которые наглядно демонстрируют, что значит быть воплощение Мечты. Поэтому в знак признания из этих прекрасных характеристик мы настоящим сделать <имя получателя> Премию Сапфир. Мы передаем ему / ей все права и обязанности, связанные с The Sapphire и право носить значок: Без поля ступенчатый разрез драгоценный камень лазурный.С большим удовольствием это было подтверждено царскими руками, сидя на нашем троны этот <дата> день <месяца> А.С. <год>, в наше самое очаровательное <место проведения мероприятия>.

К началу


Премия Сокровища Дракона — из бывшего печатка сайт

Кому эти подарки приходят знать, что Мы, <<Король>>, Король по праву оружия, и <>, Наша Королева любви и красавица, передаю привет.Как известно, сокровище царства лежит в его будущих лидерах, мы тоже знай, что такое сокровище перед Нами в человеке <> и в знак признания его / ее хорошего служение Поднебесной, уместно, что Мы честь <>, назвав его / ее драконом Сокровище. Поскольку он / она украсил корону Срединное царство до сих пор, так что он / она будет продолжать сделать это в наших сердцах.Совершено в <> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Премия Дубинка — предоставлена ​​леди Айкико Кэтрин О’Брайен из справочника писцов

Всем, кому достаются эти подарки, известно, что мы (имя Государя), Король (Королева) по праву руки Поднебесной и (имя Консорта), наша Королева (король) передает привет.Как известно на сокровище королевства лежит в
своих будущих лидеров, поэтому знаем ли мы, что такой человек перед нами в (имя получателя) и в признание его / ее достижений в боевые искусства (можно указать конкретный поступок), это соответствует тому, что мы чтим (имя получателя)
назвав его / ее дубинкой. Как он / она украсил Корона Среднего Царства до сих пор, так что он / она продолжить
сделать это в наших сердцах. Совершено ____ дня ____ г. Anno Societatis __, в нашем (место проведения).

К началу


Присуждение Серебряный желудь — Бесс

Да будет известно, что королева <имя королевы>, покровительница искусств и наук и , наш Кинг хорошо знает прекрасную молодежь, у которой есть продемонстрировал энтузиазм и усилия, которые <имя получатель> отображается в <причина награды>. Мы желаем всем знать, что она высоко ценится Мы заботимся о Себе, ради чего ей Награда Серебряного Желудь. Дано нашим передает этот <дата> день <месяца> А.С. <год> пока сидя в нашем <месте происшествия> для дачи показаний на что мы поставили царскую руку и печать.

К началу


Премия Роща — с бывшего сайта печатей

Да будет известно, что королева <<Имя>>, покровительница Искусство и Науки и Король <<Имя>> хорошо осведомлены об усилиях и успехах народа << Название группы >> в художественном и / или научном зона << Художественная / научная зона >>. Мы желаем всем знать, что они высоко ценятся Сами, с этой целью Мы даруем им Премия Рощи. << Название группы >> может украсить их устройство с: Per pale Or и argent, a hurst purpure, знак этой награды. Дано Нашими руками this <> день <>, A.S. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать.

К началу


Премия Полета Дракона — из бывшей печатки сайт

Объявите всем, что Мы, <<Король>>, Король право оружия Поднебесной, и <<Королева>>, Наша королева любви и красоты, желаю воздать должное превосходные навыки и услуги << Название группы >> Корпус Лучников Поднебесной.Мы настроены на наградить их наградой полета дракона, со всеми правами и обязанностями, связанными с это звание и право ношения нагрудного знака: Серебряный, бледный, чешуйчатый, серебристый, между четырьмя феонами, без позволения и препятствий со стороны любого человека. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, A. S. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать.

К началу


Присуждение Зубы Дракона — с бывшего веб-сайта с печаткой

Знай по этим подаркам, что Мы, <Король>, Король, право оружия Поднебесной, и <<Королева>>, Наша королева любви и красоты, правильно помнящая драматические поступки и навыки, которыми обладает << Название группы >> отображается на поле боя, особенно << Конкретные дела >>, помните, чтобы дать им Награда Зуба Дракона.Мы даем им все права и обязанности, связанные с этим награды и право ношения нагрудного знака: Argent, на танец между двумя сломанными зубами дракона и другой серебристый, без позволения и препятствий со стороны какого-либо человека. Совершено в <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили Свою руку и печать.

К началу


Присуждение Purple Fretty — из бывшей печатки сайт

Да будет известно, что Мы, <<Король>>, Король по праву герб Среднего царства и <>, Наша Королева любви и красоты, слышали об образцовых услугу, которую << Название группы >> оказал Поднебесной, а именно <<Служба>>. . Мы делаем здесь публично хвалить их и пожалуйста одарить на них награда Purple Fretty. Мы дарим им все права и обязанности сопутствуют на эту награду и право на ношение значка: Или, раздраженная пурпурная чистота, без препятствий ни от каких человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Орден Розы — с бывшего сайта печатки

«Провозгласите всем кротким и знатным, что Мы, <>, король по праву герба Срединного Королевство и <>, Наша Королева любви и красавица, прекрасно знающая грацию и достоинство с который <> служил Среднему царству как Королева, готовы оказать ей честь.Поэтому мы признать ее Леди Розы со всеми права, привилегии, знаки отличия и обязанности к этому относящийся. Совершено в <> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы поставили Нашу руку и печать ».

К началу


Заказать White Chamfron — из бывшей печатки сайт

Пусть знают, что Мы, << Имя Правителя >> сильные и просто, и << Имя супруги >> изящное и мудрый, Regnum Mediterranae, видел умение, преданность и поддержка, которые <> проявил в дисциплина верховой езды.Поэтому мы с намерением сделать его / ее членом Нашего Ордена Белого Шамфрона и должным образом награждает его / ее относящиеся к правам и сопутствующие обязанности что он / она может выполнять свои новые обязанности перед Корона. Совершено в <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать.

К началу


Заказать Кавендишского узла — из бывшей печатки сайт

Пусть знают, что Мы, << Имя Правителя >> сильные и просто, и << Имя супруги >> изящное и мудрый, Regnum Mediterranae, видел умение, преданность и поддержка, которые <> проявил в дисциплина боя на рапирах. Поэтому мы с намерением сделать его / ее членом Нашего Ордена Кавендишского узла и должным образом возложить на него / ее относящиеся к правам и сопутствующие обязанности что он / она может выполнять свои новые обязанности перед Корона. Он / она может носить как знак этого нового членский значок: Четыре узла Кавендиша соединились в поперечном верт. Совершено в <> день <>, В ВИДЕ. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать.

К началу


Заказ Барб Дракона — из бывшей печатки сайт

Вся знать, знайте по этим подаркам, что Мы, <>, король по праву герба Срединного Королевство и <>, Наша Королева любви и красавица, будет рада почтить <> за его / ее превосходное мастерство в стрельбе из лука и служение Лучнику Корпус Поднебесной.Мы стремимся создавать он / она Соратник Ордена Дракона Барб, и тем самым наделяет его / ее всеми правами и обязанности, сопутствующие этому званию, и право носить значок: Хвост дракона бледный, колкость начальнику, в пределах и выпустить из аннулета Vert чешуйчатый серебристый, без препятствий ни от каких человек. Совершено в <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать.

К началу


Заказ the Red Company — с бывшего веб-сайта с печаткой

Во всех армиях в истории было много воинов, которые сражались и вели изнутри чины, поднявшись до почетных должностей. Воин обладает многими достоинствами, такими как умение обращаться с оружием, лидерство на поле и обучение боевым искусствам. Поэтому Мы, <<Король>> и <<Королева>>, Король и Королева Среднего Царства настоящим признает <<Имя>> как член Ордена Красной Компании.Он / Она может назвал себя Сержантом этого благородного ордена, и может иметь свой значок: Gules, две булавы в saltire Argent, в кантоне на его / ее щите. Сделанный this <> день <>, A.S. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать.

К началу


Заказ Зуб Дракона — из бывшей печатки сайт

Всем и единственным, кому эти подарки Приди, знай, что Мы, <<Король>>, Король по праву оружия Поднебесной и <<Королева>>, наша королева любовь и красота, помня о драматических деяниях и навыки, которые <> проявил на поле битвы, старайтесь сделать его / ее Товарищ нашего ордена Зуба Дракона. Мы предоставить ему / ей все права и обязанности сопровождающий в этом звании, и право носить значок: Верт, на бледном Или, три клыка верт, без пусть или помеха от любого человека. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, сидя на Наши престолы в Нашем << Названии места >> в свидетельстве к которому Мы приложили руку и печать.

К началу


Присуждение The Doe’s Grace — с бывшего веб-сайта с печаткой

Смотрите, читайте, слушайте и поймите эти подарки что Мы, Королева Поднебесной, и <<Король>> Наш король, помня о высоком уважении в котором <> принадлежит Нашему Королевству и Мы сами (и в знак признания <<Завершение>>,) рады даровать ему / ей этот знак благосклонности Королевы, Награда Лань Милость.Мы передаем ему / ей все права и обязанности, связанные с этим рангом, и право носить значок Лазурный, собственно меч украшенный венком из цветов серебра, поскользнулся и покинул Или, без позволения или препятствия со стороны кого-либо. Совершено в <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили Свою руку и печать.

Награда Милости Лани — Бесс

Мы поем на просторах этого славный MidRealm милосердие и красота, которые дана жизнь словами нашей королевы <королевы имя> и <имя короля> ее король. Хорошо зная широко распространенное восхищение, в котором <имя получателя> удерживаемых населением и нами и в подтверждение <указанная причина> рады покажите ему / ей этот знак благосклонности Королевы Награда Лани Милости.Со всем сопутствующим такая честь дается право ношения нагрудного знака: Лазурный, собственно меч, украшенный венком из цветов. серебристый, поскользнулся и оставил Или, не давая или помеха со стороны любого человека. Сделано в <> день из <<Месяца>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Присуждение Королевская чаша — из бывшей печатки сайт

Смотрите, читайте, слушайте и поймите эти подарки что Мы, <<Король>> Король Среднего Царства, и <<Королева>> Наша королева, помня о высоком уважение, которым <> пользуется Наше Королевство и Сами и в знак признательности подлинность в <<выполнение>>, рады наградить его / ее Наградой Королевской Чаши. Мы предоставляем ему / ей все права и обязанности, сопутствующие этому званию, и право носить значок награды без разрешения или помеха со стороны любого человека. Совершено в <> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Присуждение Purple Fret — с бывшего веб-сайта с печаткой

Провозгласить повсюду царство, которое Мы, <<Король>>, Король по праву оружия Поднебесной и <<Королева>>, наша королева любовь и красота, признайте образцовую службу что <<Имя>> отдал Среднему Царству, в частности <<Служба>>.. Мы делаем здесь публично похвалите его / ее и прошу подарить ему / ей Награда Purple Fret. Мы даем его / ее все права и обязанности сопровождающего на это звание и право носить значок: Или, раздражение пурпурное, без препятствий ни от каких человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Орден Willow — с бывшего сайта с печаткой

Всем и единственным, кому эти подарки придет, знай, что Мы, <Королева> Королева Поднебесной и покровительница искусств, а также <> Наш король, хорошо помня навыки в который <> проявил в искусстве <>, хочу признать его / ее своим товарищем нашего Ордена Ивы.Мы даем ему / ей все права и обязанности, связанные с этим звание и право ношения нагрудного знака: Purpure, a Ива уничтожена Или без всяких препятствий от любого человека. Дано Нашими руками это <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, сидя на Наши престолы в Нашем << Названии места >> в свидетельстве к которому Мы приложили руку и печать.

Орден Ивы — адаптировано из Чартер сэру Уолтеру Рэли от Bess

<Имя королевы> Королева Поднебесной, Право оружия нашего Короля, и защитник веры и т. д. Всем людям, кому я эти подарки придут, привет. Знай, что нашей особой милости, достоверной науки и простого движение, которое мы даровали, и этими подарками для мы, наши наследники и преемники, мы идем и нашим доверенное лицо и доброжелательный слуга <имя получателя>, за мастерство, которое они проявили в искусстве <>, чтобы они стали компаньонами наших Орден Ивы. Со всеми прерогативами, товары, юрисдикции, роялти, привилегии, франшизы и преимущественные права на них или около того, что бы мы своими письмами ни даровали Предоставлено всегда, и наша воля и удовольствие, и Дай сделать настоящим Дай это В наши руки эту <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, сидя на Наши троны в Нашем << Названии места >>.

К началу


Заказ Silver Oak — с бывшего сайта с печаткой

Всем и единственным, кому эти подарки придет, знай, что Мы, <Королева> Королева Среднее царство и покровительница наук, а также <> Наш король, хорошо помня навыки в который <> проявил в науке о <>, хочу признать его / ее своим товарищем нашего Ордена Серебряного Дуба.Мы даем его / ее все права и обязанности сопровождающего на это звание и право ношения нагрудного знака: Purpure, дуб, очищенный и уничтоженный серебром, плодоносит Или без всяких препятствий или препятствий. человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A. S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Оружие для великих государственных служащих — с бывшего сайта с печаткой

Объявите всем, кому эти подарки что Мы, <<Король>>, Король по праву герб Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в рассмотрение отличного обслуживания, которое <> отдал Поднебесной как << название офиса >>, намерены сделать ему / ей Грант оружия.Мы Настоящим подтверждаю предоставлением права на <> и право носить на гербе Дракона << конкретное описание герба дракона, если указано >> как знак его / ее служения Нашему Королевству. Дано Наши руки в этот <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать.

К началу


Грант Оружие для других — с бывшего сайта с печаткой

Объявите всем, кому эти подарки что Мы, <<Король>>, Король по праву герб Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в рассмотрение отличного обслуживания, которое <> отдал Поднебесной как << название офиса >>, намерены дать ему / ей Оружие, которое мы Настоящим подтверждаю предоставлением права на <>, (и право носить в качестве герба << конкретный герб, не связанный с драконом, если он есть >>) << герб. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Компания Бронзового кольца — с бывшего сайта печатки

Всем и единственное, кому эти подарки будут доставлены, знайте что Мы, <Король> и <Королева>, король и королева MidRealm, правильно помня о своем начальнике навыки, лидерство и образцовое служение Рапирные Легионы Нашего Королевства признают настоящим <<Имя>> как соратник нашей бронзовой роты Звенеть.Совершено в <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать.

Компания Бронзового кольца — адаптирована из Текст Atlantian White Scarf от Бесс

Да будет это известно всем людям к настоящему моменту писаний, где бы их ни читали, ни слушали или осмысленны, и особенно для всех видов офицеры под властью наших страшных властителей, <имя> и <имя>, монархи Среднего царства, такие как бароны, сенешал, рыцари-маршалы и их заместители, удостоверяя им этим письмом что это нравится нашим указанным договорам, с их самый уважаемый советник принять <имя получателя > в качестве Хранителя Бронзового кольца. Знай, что у него есть доказанное право достойно чести и заслуги суфизиантская хитрость и умение проявлять гражданские бой и показал это на испытаниях оружием с наши легионы Rapier. Прежде всего, знайте, что мы находим он благородный кавалер, которому мы доверяем воспитание и бережное отношение к Благородному искусству защиты в этом нашем Среднем Царстве, доверяя ему предложить хорошее наставление для всех, кто его ищет, советуйтесь в хороший сезон, и что он немедленно возьмет действие, чтобы защитить честь этого королевства, путем кто бы это ни оспаривал.Мы даем ему право носить нагрудный знак: Gules, две рапиры в салазках серебро в кольце Или и гордо показать все символы Ордена беспрепятственно и беспрепятственно человек. В свидетельство чего Мы приложили руку к этому <дата> день <месяца> Anno Societatis <год> в Нашей <ветка>, в <событие>.

К началу


Компания Белого копья — с бывшего сайта с печаткой

Как во время войны, так и в мирное время неустрашимые наездники оттачивали свои боевые навыки в турниры по подготовке всадника и коня к защиты Нашего славного царства. У наездника есть многие достоинства, такие как навыки верховой езды, верховая езда точность в обращении и обучение искусствам конный спорт; Истинное лидерство проявляется, когда все достигнуть высшей точки в симбиозе лошади и всадника, чтобы приведи их к победе. Следовательно, Мы, <<Король>> и <>, король и королева Среднего Царства настоящим признаем <<Имя>> Спутником Наших Компания Белого Копья.Совершено в <Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

К началу


Орден Компании Гринвуд — От Заказ Сайт

Во всех армиях в истории было лучников, которые стреляли и учили изнутри чины, поднявшись до почетных должностей.An у лучника много достоинств, таких как умение обращаться с луком, лидерство на линии, а также преподавание искусств и науки о стрельбе из лука. Следовательно, Мы, <государи имя> и <имя супруги>, король и королева Срединное царство, настоящим признаем <имя получатель> как член Ордена Гринвуда Компания. Он / она может называть себя лесником. благородного ордена и может иметь нагрудный знак: Бесполевой среди сосен Верт, Феон перевернутый Или в кантоне на его / ее щите.Сделано Наши руки в этот <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год>, в Нашем <месте события>

К началу


Орден Золотая булава — из 3 выпуска rd Писец Справочник стр. 32

Смотри, слушай и читай слова <имя государь>, король <королева> по праву герба Среднее Королевство и <имя супруги>, королева <король> Среднего царства.Руководство и обучение наших воинов имеет важное значение для силы армии, и мы стали свидетелями такого превосходства в нашей subject <имя получателя>. Поэтому мы желаем признать его / ее Сподвижником Нашего Ордена Золотая Булава. Мы предоставляем ему / ей все права и обязанности, сопутствующие этому рангу, с право называться капитаном Орден Красной компании.Впредь он / она может иметь нагрудный знак Ордена, должным образом зарегистрированный в Колледж Вестников. Сделано нашими руками это <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год> в нашем <место проведения мероприятия>.

К началу


Орден Evergreen — автор Bess

Пойте хвалу и дайте знать всему необъятность царства, которое мы <имя Консорта, Королевская покровительница искусств и <имя государя> наш король, хорошо осведомлены о совершенстве и умелое обучение, осуществленное <имя получатель> в <искусство / наука / исследования> <причина для награды>.Поэтому мы хотим, чтобы все знали о с большим уважением, с которым мы относимся к нему / к ней, и поэтому мы стремятся сделать его / ее Спутником Орден Вечнозеленых растений. Мы даем ему / ей все права и обязанности, связанные с этим звание и право ношения нагрудного знака: [Без поля] A сосна бледно-пурпурная и ор. Дано нашим передает этот <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год> в нашем <месте проведения мероприятия>.

К началу


Заказ Сердце Дракона — из бывшей печатки сайт

Вся знать, знайте по этим подаркам, что Мы, <>, король по праву герба Срединного Королевство и <>, Наша Королева любви и красоту, помним о времени, труде и любви что <<Имя>> щедро дал Среднему Царство << конкретными делами >>, и Мы стремимся к сделать его / ее Соратником Ордена Сердце Дракона. Мы наделяем его / ее всеми правами и обязанности, связанные с этим званием и право ношения нагрудного знака: Argent, a heart vert чешуйчатый серебристый, без каких-либо препятствий человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы поставили Нашу руку и печать

К началу


Барон (эсс) суда — с бывшей печатки

Всем нежным и благородным, да будет известно всем что Мы, <<Король>>, Король по праву герб Поднебесной и <<Королева>>, наша королева, пошлите приветствие.Поскольку это привилегия Корона, чтобы признать определенное благородство, и у нас есть такое благородство видел в <>, в частности, у << конкретные дела >>, мы рады одарить ему / ей право называть себя бароном / эссом Нашего двора. И хотя барон / судья не обладает властью или властью, чтобы командовать, но он / она оказал такую ​​честь и уважение, как подобает человек большой ценности и вежливости. Мы подтверждаем и признать ему / ей все права и обязанности, сопутствующие этому рангу, без пусть или помеха от любого человека. Отныне он / она должен быть известен его / ее короной из серебра украшен жемчугом. Мы подтверждаем это нашими передает этот <> день <>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Нашем << Месте >>.

К началу


Территориальный Барон (ess) — с бывшего сайта с печаткой

Вся знать, по этим дарам знай, что Мы, <>, король по праву герба Срединного Королевство и <Королева>, Наша Королева, услышав прошение от Баронства << Имя Баронства >> и хорошо довольны обслуживанием Нашего субъекта <> добыты, чтобы создать его / ее Барон / Баронесса Нашего Баронства << Имя баронства >>, чтобы иметь и поддерживать для Нас и Наши преемники верны и чтят вышеупомянутых земли.Мы также даем ему / ей все права и относящиеся к ним обязанности и право использовать, пусть или с помехой, все символы и украшения этой позиции с этого времени и далее в том числе право на герб << Герб баронства оружие >>. Впредь он / она будет известен своим корона из золота, украшенная жемчугом. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать.

К началу


Рыцари рыцарства: рыцарь или магистр оружия
Клятва рыцаря

«Я клянусь в верности и кланяюсь
в Корону Среднего Царства:
Быть хорошим рыцарем и верным,
Благоговейный и щедрый,
Щит слабых,
Послушный моему сеньору,
Передовой в бою,
Всегда вежливый,
Защитник права и добра.
Клянусь, сэр <<Имя>> «

Орден рыцарства — из бывшей печатки сайт

Да будет известно, что Мы, <<Король>>, Король по праву герб Среднего царства и <>, Наша Королева любви и красоты, учитывая его / ее вежливость, рыцарство и умение как на самом деле, так и вне его. поле битвы, делай Нашей особой благодати и определенные знания распознают <> как Рыцарь / Мастер по оружию Общества творчества Анахронизм, быть во всех почетных местах пронумерован Пэр Нашего Царства и член ордена Рыцарство, все права, привилегии, знаки отличия, приоритет и ответственность за него принадлежащий. И, кроме того, подтверждаем ему / ей на основании патентной грамоты право на ношение <> как оружие внутри Общества без позволения или помеха со стороны любого человека. Совершено в <> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.

Рыцарский орден — с пропиской герб адаптирован из Английский патент около 1576 г., автор Bess .

ДЛЯ ВСЕХ И ОТДЕЛЬНЫХ, а также для дворян и неевреев как и другие, кому эти подарки достанутся <имя Дракона> псевдоним Дракон главный здесь король оружия всего Царства Среднего Царство посылает приветствие нашего Повелителя вечный <имя Повелителя> и <имя consort> его королева, ПОСКОЛЬКУ давным-давно из начиная отважные и энергичные поступки достойных люди пришли в мир с Сондри памятники и воспоминания о там добрых пустынях делают Нашей особой благодати и определенных знаний распознать << Имя получателя >> как Рыцарь / Мастер по оружию Общества творчества Анахронизм, быть во всех почетных местах пронумерован Пэр Нашего Царства и член ордена Рыцарство, все права, привилегии, знаки отличия, приоритет и ответственность за него принадлежащий. Среди которых самые главные и самые Обычно все носят знаки в шильдах под названием Armes, которые являются явной демонстрацией prowes и valoir, которые предусмотрительно разработано вначале, чтобы расшевелить и найти в сердцах людей подражание vertue и noblenes Так же есть Бен и но постоянно до конца соблюдается, что, например, оказали достойную услугу своему королю или контри либо в войне, либо в мире оба могут получить должную честь в своей жизни и получают то же самое последовательно до там постерити навеки И ТРЕБУЕТСЯ <имя получателя> в <имя получателя локального группа> джентльмен, после чего я произвел поиск соответственно и обнаруживаем, что саид <имя получатель> может носить эти оружие в соответствии с Патентным письмом ЧТО СКАЗАТЬ <получатели зарегистрированного герба>, и Я сказал, Дракон, каждую его часть и каждую частичку. Король оружия властью и властью в моем офисе приложен и предоставлен в виде буквенного патента в соответствии с большая печать MidRealm подтверждаю ратификацию и разрешить и для указанного <имя получателя с новым названием> джентльмен к своему потомству с должным разница в соответствии с Lawe Armes и то же самое иметь и наслаждаться вечно без препятствий позволение или вмешательство любого лица или лиц В СВИДЕТЕЛИ ЧЕГО в нашей горе <местонахождение даже> установить здесь королевскую руку и печать Офиса <дата> день <месяца> и в <год> год нашего Общество.

К началу


Орден Лавр ,
Laurel Oath
Я здесь клянусь верностью и служением
К короне Среднего царства.
Чтобы навсегда обогатить Crown
С моими талантами и способностями.
Для продвижения разнообразного искусства,
Чтобы продолжить наставления моего иждивенцы,
Чтобы увеличить славу Поднебесной,
И быть достойным Венка, который ношу.
Клянусь, (Name).
Текст Клятвы можно найти в других языки здесь http://www.midlaurel.com/reference.shtml
Орден Лавра , именной герб, эмблема и титул Бесс. Текст на основе SCA Патент на оружие http://www.virtue.to/articles/laurel/scroll.html
Настоящие письма всем знатным и знатным людям. читать, слышать или видеть
<имя Дракона> как Главный герольд дракона и король оружия Посланник Среднего Царства с должной и скромной похвалой и приветствие. Справедливость воля и разум орданет чтобы люди добродетельные и благородные заслуги и известность вознаграждаются не только их дела, но быть помещенным с честью с другими признанный, принятый и уважаемый, принятый некоторыми ансамбли и демонстрации чести и знати, которые значит пэрство королевства и герб Патентными письмами. И поскольку <имя получатель>, джентльмен / женщина, рекомендуется для нее безграничная преданность и преподавание искусства в поля <специальности>, и поскольку упомянутый лорд / леди встретил большое одобрение со стороны члены нашего Ордена Лавра имеют свои величайшие величества <имя короля и королевы> хотел, чтобы я, упомянутый Дракон, посвятил и подтвердил он / она сказал, что оружие впредь будет нести эти буквы Патент, подтвержденный его / ее квалифицированными специалистами. работает и манера поведения и подобает пэру Общество.И поэтому я по их просьбе и ответственный властью и властью присоединенной, приписывались, давались и даровались мне и моим офис Dragon Herald выраженными словами под отличная печать MidRealm ратифицирована, подтверждена и изложил ей оружие таким образом, как далее следует, то есть: , как более ясно изображено на этом поле. К иметь и придерживаться указанного <name>, он / она будучи в настоящее время признанным в его / ее должном станцию ​​пэром нашего царства и достойным товарищем нашего Ордена Лавра и оружия этими буквами и поручает нести во веки веков.В свидетели из-за чего я, упомянутый Дракон, подписал эти подарки рукой и поставил на нем печать MidRealm Armes. Выдается и предоставляется на <название события> в <место дано> в <дата> день <месяца> года <Общественный год> Общества по суверену <King's имя> по праву герба Король Среднего и его прекрасная королева <имя королевы>. </h5> <hr/> <h5> </h5><b> Заказать Пеликан </b> </h5> <h5><span class="ez-toc-section" id="i-44"> Клятва Пеликана </span></h5> <p> «Я здесь клянусь и поклоняюсь <br/> К короне Поднебесной <br/> Во всем служить короне <br/> Помнить вежливость и доброту <br/> Ценить справедливость выше личной выгоды <br/> Трудиться на общее благо <br/> Чтобы обогатить Королевство и Общество <br/> Так что они могут процветать и расти <br/> И быть достойным звания Пеликан.<img src='/800/600/https/a.d-cd.net/c6e8d95s-960.jpg' /> <br/> Вот, клянусь честью, моя рука <br/> и сердцем клянусь, <<Имя>>. «</p> <h5> </h5><b> Орден Пеликана </b> — из бывшей печатки сайт </h5> <p> Всем благородным и знатным известно, что Мы, <Король>, Король по праву оружия Поднебесной, и <<Queen>>, Наша Королева любви и красоты, в рассмотрение исключительных благородных добродетелей и отличное обслуживание, вежливость и честь как терпение и труд, <<Name>> создают и продвинуть его / ее до звания и степени Магистр / Хозяйка самого благородного Ордена Пеликан, быть на всех почетных местах пронумерован Пэр Нашего Царства, со всеми правами, привилегиями, знаки отличия, старшинство и ответственность за них принадлежащий.И, кроме того, подтверждаем ему / ей на основании патентной грамоты право на ношение <<Blazon>> как оружие внутри Общества без позволения или помеха со стороны любого человека. Совершено в <<Date>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать.<img src='/800/600/https/i-a.d-cd.net/c0AAAgEEqOA-1920.jpg' /> </p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Виконт (эсс) </b> для правителя оружия — с бывшего сайта-печатки </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева любви и красоту, памятуя о доблестных усилиях в битва и мудрость в совете, данном <<Name>> и в знак признания его службы Нашему Королевству в качестве Князь <<княжества>>, очень доволен признать его виконтом.И хотя виконт не обладает властью или властью, чтобы командовать, но он должен получить такую ​​честь и уважение, как подобает человеку большой ценности и вежливости. Он должен быть известен его серебряная корона в боевой готовности и его советник будет взвешен, как подобает тому, кто вынес корона княжества в Поднебесной. Совершено в <<Date>> день <<Month>>, A.S. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили Свою руку и печать.</p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Viscount (ess) для consort </b> — с бывшего сайта с печаткой </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева любви и красота, помнящая изящество и благородство который <<Имя>> одолжил Короне <<Principality>>, прекрасно зная тяжелый труд и терпение, с которым она служила Царству, очень приятно признать ее виконтессой.<img src='/800/600/https/a.d-cd.net/cEAAAgCedOA-1920.jpg' /> А также хотя Виконтесса не имеет полномочий или полномочий командование, но она должна быть удостоена такой чести и уважение, как и положено человеку большой ценности и учтивость. Она будет известна своей короной серебро, в бой, и ее совет будет взвешен как и положено тому, кто носит корону Княжество в составе Поднебесной. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать. </p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Граф (ess) </b> для лица, которое служило государь — с бывшего сайта печатки </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в законное правопреемство << Предыдущему Суверену >> и << Предыдущий супруг >>, помня о прекрасном способ, которым <<Name>> служил Среднему Королевство, отдавая свои отважные усилия в битвах и его мудрости в совете, очень рады признать его графом.Он будет известен по его корона из золота в боевой готовности, и его советник будет весил, как подобает тому, кто нес Корону Поднебесная. Совершено в <<Date>> день <<Month>>, В ВИДЕ. <<Год>>, сидя на Наших престолах в Наших << Название места >>, в свидетельство чего Мы установили Наше рука и печать. </p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Счетчик (ess) для consort </b> — с бывшего сайта с печаткой </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, помня о благодать и благородство, которыми <<Имя>> одолжил Корона Среднего Царства, и хорошо зная труд и терпение, с которыми она служила Королевство, очень рады признать ее как Графиня.Она будет известна своей золотой короной, сражался, и она будет стоять на глазах у всех, как та честь, ради которой существует рыцарство. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать. </p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Герцог (Герцогиня) </b> для лица, служившего соверен — с бывшего сайта печатки </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в законное правопреемство << Предыдущему Суверену >> и << Предыдущий супруг >>, помня о прекрасном способ, которым <<Name>> дважды служил Среднему Королевство, отдавая свои отважные усилия в битвах и его мудрости в совете и суде, очень довольны признать его герцогом.Он будет известен по его венчик, украшенный листьями клубники, и его советник должен быть взвешен, как подобает тому, кто дважды Несла корону Среднего царства. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, а сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в свидетельство чего Мы поставили руку и печать. </p> <p align="center"> К началу </p> <hr/> <h5> </h5><b> Герцог (Герцогиня) для консорта </b> — от бывшей печатки сайт </h5> <p> По этим подаркам знают все знатные и знатные люди что Мы <<King>>, Король по праву герба Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, помня о благодать и благородство, которыми <<Имя>> одолжил Корона Среднего Царства, и хорошо зная труд и терпение, с которыми она дважды служили Царству, очень рады признать ее как герцогиня.Она будет известна своей короной, украшенная клубничными листьями, и она стоять для всех как та честь, за которую Рыцарство существует. Совершено в <<Date>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего Мы установили Свою руку и печать. </p> <p align="center"> К началу </p> </td> </table> <h2><span class="ez-toc-section" id="_12"> Гитары из стали на 12 ладов | Гитары мечты </span></h2><div class="advv"> <ins class="adsbygoogle" style="display:inline-block;width:336px;height:280px" data-ad-client="ca-pub-1812626643144578" data-ad-slot="9935184599"></ins> <script> (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({}); </script> </div> <p> Найти бренды Акустическое изображение Усилители AER Альберико, Фабрицио Альберт и Мюллер Перегонный куб Альгамбра гитары Альтман Альварес Яри Эмбридж, Саймон Амейенда, Ариэль Американский Archtop, Дейл Унгер Чемоданы Ameritage Андерсен, Стивен Андерсон Гитары Андерсон, Р.М. Эпплгейт, Брайан Арнольд, Джон Артингер Ашер Гитары Astrand Аудио Звездочки Аудирак, Жерар Гитары Авалон Компания Bacon & Day Banjo Бэггс, LR Бейли Гитары Бейкер Мяч Бамбург Банкетти, Париж Бараник Барба, Франсиско Барон Гитары Бартелл, Джон Питер Башкин Михаил Медведь, Г. Борода, Пол Бирдселл, Аллен Борегар, Марио Бейтель, К. Беллидо, Хосе Лопес Беллуччи Бенедетто Бенето, Марк Берковиц Бернабе, Паулино Гитары Big Hollow Счета, Том Бишлин Банджос Блэкшер, Том Бланшар, Марк Блейзер и Хенкес Блюз Крик Боаз Гитары Боаз / Майковски Богданович, Я.С. Borges Гитары Borghino Гитары Boswell Бушеро Буржуазный Баун, Ральф Бозо Бозунг (CB Guitars) Брандт, Грег Breedlove Бреснан Гитары Брондель, Лоран Браун, Эдди Ли Браун, Ларри Браун, Тэд Буэндиа Гитары Burchette Burguet Бускарино, Джон Кейсы Calton Канин, Гленн Плотский, Гил Каррильо, Винсенте Carrington Каррут, Алан Карунчо, Андрес Карвалью, Самуэль Чехлы Caseadillo Casimi Guitars Катон, Кевин Сервантес, Алехандро Шантус (Уильям Кинг) Чепмен, Алан Char Чарис (Билл Уайз) Chasson Чинг, Дуглас Чаббак Circa (Джон Слобод) Клэкстон, Эд Коэн, Брайан Collings Коллинз Гитары Чехлы на футляры Colorado Конде Херманос Конли Коннор, Стефан Контрерас I, Мануэль Контрерас II, Мануэль Кордова, Мигель Гитары Cornerstone Cumpiano гитары Кампиано, Билл и Миллард, Майкл Д’Ависто, Джеймс Л.Daily, Дэвид С. Инструменты Dammann на заказ Данэлектро Дэйв Англии Дэвис, Мервин де Йонге, Джошиа де Йонге, Сергей де Люсия, Пако Диринг Банджо Гитарная компания Дехрадун Деларю, Доминик Дельгадо, Томас Десмонд Гитары DeTemple Гитары DeVine Дево, Лестер Dion Guitars Добро Банджо Дока Дорр, Том Доминелли, Маркус Дулин, Майк Гитары мечты DT Гитары Dudenbostel, Линн Дамбл Dunwell гитара Dupont Guitars Красильщик Эбата Этидзен, Рёхей Эдвард Виктор Дик Струнные инструменты Eggle Гитары Ehlers Эйхельбаум Эко Эллиотт Эллис Мандолинс Ensor Guitars EVD (Эдвард Виктор Дик) Эверетт Фэй Крыло Фернандес, Херонимо Пена Fibenare Guitars Прекрасная Резофоника Фишер, Пол Фишер, Стив Фламманг Флета Фоли Форстер, Н.К. Фокс, Чарльз Франклин Гитары Фрэнкс, MJ Фраулини Фредель, Густав Лягушачье дно Fujii гитары Гитары Fylde G7 Гитары Gaffney Галлахер Galloup Studios Гемза, Бела Немецкий Гибсон Гиффин Гилберт, Джон Джуссани, Джоакино Годин Гонсалес, Хуан Мигель Goodall Грейс Дизайн Грин, Аарон Гринфилд, Майкл Gretsch Greven Случаи Хранителя Гидри, Сэм Гильдия Го Юйлун Густавссон Гитары Gutmeier Халь, Стефан Haight Гитары Halland Хэмблин, Кент Хамер Хаузер, Герман III Hayotuk Хейнонен, Т.Рисовал Хендерсон, Э. Хендерсон, Уэйн Хенкес, Блейзер Henriksen, Inc. Наследство Эрнандес Гитаррас Hickler Banjos Хилл, Кенни Hippner Хискокс Дела Чехол для кофе Хоффман Hofner Холкомб, К.Ф. Holst Хопф, Дитер Как Хауэлл и Форсайт Усилители Хамфри Хамфри, Томас Хасс и Далтон Имаи, Юичи Indian Hill Иванов Гитары Якобсон, Пол Джеймс Мэй Инжиниринг Янг, Исаак Гитары JGS K&K Sound Карура Кейсы Кауфман, Стив Кехлет Кейт, Мартин Келдей, Билл Келлер, Майкл Керман, Арик Струнные инструменты Keystone Хомячков Кингстон, Британская Колумбия Киннэрд, Джон Киннэрд, Стивен Кляйн и Кауфман Кобрле Koentopp Guitars Коно Колая Коно Копп, Кевин Костал, Ясон Кумридис Kragenbrink Краут, Раймонд Кронбауэр Lakewood Ламбе, Уэс Хромая лошадь Лангежанс, Дел ЛаПланте, Дэвид Larrivée Guitars Братья Ларсон Ласкин, Грит Лавуа, Бенуа Лич, Харви Леманн и Коул Струнные инструменты Lehmann Кожа Леви Льюис, Майкл LHT Гитары Lipton Лориенте, Антонио Lospennato Lowden Лозано Лукас, Рэнди MacCubbin гитары Макдональд, С.Б. Майнгард, Марк Мальдонадо, Педро Манзер, Линда Маркионе Марикопа Марин, Пако Сантьяго Мартин Гитары Марзал, Иисус Мацуда, Мичихиро Маттингли, Роберт Mauel Guitars Mayes Макалистер Макколлум, Лэнс МакКоннелл, Иордания Маккарди МакЭлрой Макгилл, Пол Макилрой МакИнтурфф, Терри Пикапы McIntyre Макнайт Макферсон Мелвилл Мендель, Джо Mermer Меррилл, Джим Мишо Сделано Гитары Micheletti Milburn Молл Монрад, Эрик Монтелеоне Монтеро, Антонио Марин Лунный камень Морейра, Родриго Морено, Рафаэль Морган Гитары Mountain Song Мейдерман, Кевин Musselwhite Musser Guitars Мустапик Мут, Р.С. Myka Mönch, Эдгар Нэшвилл Гитарная Компания Национальный Национальный Резофонический Новая эра Никерсон благородный Ноэми Гитары Northwood Novax Оберг Олсон, Джеймс Ome Орибе, Хосе Орискани Остхофф, Джон Овация Оксвуд ручной работы Гитары Pagelli Paldacci Гитары Пален Гитары Парк Пол Рид Смит Пиви Педерсон Педрегоса, Хосе Руис Гитары Pellerin Перри, Дэрил Петрос Гитары Филлипс, Р. Феникс (Рольфе Герхард) Пиментель Pinkham, Ron Woodsound Studios Планета Волны Плазуэло, Хосе Марин Погреба Опрос Портер, Стив Пош, Лев Pre-War Guitars Co.Прингл, Дуглас Радиальная инженерия Гитары Rainsong Рамирес, Хосе Расмуссен, Ларс Раух, Отто Редгейт, Джим Королевские гитары Рейн, Томас Ретроградные гитары Реюньон Блюз Рейес, Мануэль Гитары Ribbecke Рикенбакер Риттер, Йенс Риверо Роббинс Гитары Робинсон Rockbridge Родригес и Хиос, Мануэль Родригес, Мануэль Родригес, Томас Ромеро, Х. Банджос Росснер, Хайнц Ротель (Рётель, Йохен) Розас, Игнасио М. Рубио, Г.В. Рак, Роберт Rugiere Гитары Running Dog (Рик Дэвис) Райан, Кевин Сахлин, Эрик Сакураи, Масаки Санчис, Рикардо Сэнд, Кирк Сандерс, Эшли Санта Круз Гитары Scheerhorn Шенк Шнайдер, Ричард Гитары Schoenberg Шварц, Шелдон Серрачини Сексауэр, Брюс Шанти Шелтон-Фарретта Шеппард Шубб Капо Гитары Sifel Creek Сигурдсон Симпсон Skytop гитары Смоллмен, Грег Смит, К.Б. Собелл, Стефан Твердые наземные стойки Соломон Сомоги, Эрвин Саутвелл Гитары Инструменты Spalt Гитары Spohn Гитары Steinegger Стеллинг Банджо Стюарт, С. С. Банджос Stotzel Guitars Striebel Гитары Стромберг Sussone Гитары Tacchi Тейлор Гитары Тейлор, Р. Тезанос, М. Тезанос-Перес, С.С. Темза, Майкл Гитарная компания Америки Томпсон, Престон Томпсон, Т. Торелл Гитары Threet Типпин, Билл Том Андерсон Guitarworks ToneRite Toone, Рик Трафаген, Дэйк Трауготт, Джефф Триггс Гитары Trinity Настоящий север (Деннис Сканнелл) Труссар, Джеймс Тернер Ван Линге Вейлетт, Джо Веласкес, Дон Мануэль Вайнс, Тони Чехлы Visesnut Уокер, Джон Уокер, Ким Уокер, Скотт Уолтер, Стивен Washburn Уэббер Гитары Вебер Вехтер, Эйб Weissenborn Белый, Андрей Уайт, Пегги Wilborn Guitars Уильямс, Лори Уилсон, Д.Л. Вингерт, Кэти Вуд, Рэнди Вудфилд, Филипп Woolson Yague Ярон, Гил Ён Жемайтис Зимницкий 52 Instrument Co. (Джереми Кларк) </p> .<div class='yarpp-related yarpp-related-none'> <p>No related posts.</p> </div> </div><!-- .entry-content --> <div class="entry-meta entry-footer-meta"> </div><!-- .entry-meta --> <footer class="entry-footer"> </footer><!-- .entry-footer --> </article><!-- #post-## --> <nav class="navigation post-navigation" role="navigation" aria-label="Записи"> <h2 class="screen-reader-text">Навигация по записям</h2> <div class="nav-links"><div class="nav-previous"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/nov-2/dvuhtaktnyj-benzinovyj-dvigatel-dvuhtaktnyj-benzinovyj-dvigatel-os-max-gt55-dlya-samolyotov.html" rel="prev"><span class="meta-nav">Предыдущая запись</span> <span class="post-title">Двухтактный бензиновый двигатель: Двухтактный бензиновый двигатель OS Max GT55 для самолётов</span></a></div><div class="nav-next"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/raznoe-2/renault-logan-2019-foto-renault-logan-2021-kupit-novyj-reno-logan-v-moskve-u-oficzialnogo-dilera-avtogermes.html" rel="next"><span class="meta-nav">Следующая запись</span> <span class="post-title">Renault logan 2019 фото: Renault Logan 2021 — купить новый Рено Логан в Москве у официального дилера АвтоГЕРМЕС</span></a></div></div> </nav> <div id="comments" class="comments-area"> <div id="respond" class="comment-respond"> <h2 id="reply-title" class="comment-reply-title">Добавить комментарий <small><a rel="nofollow" id="cancel-comment-reply-link" href="/raznoe-2/lada-granta-serebristaya-lada-granta-sedan-fotogalereya-oficzialnyj-sajt-lada.html#respond" style="display:none;">Отменить ответ</a></small></h2><form action="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-comments-post.php" method="post" id="commentform" class="comment-form" novalidate><p class="comment-notes"><span id="email-notes">Ваш адрес email не будет опубликован.</span> Обязательные поля помечены <span class="required">*</span></p><p class="comment-form-comment"><label for="comment">Комментарий</label> <textarea id="comment" name="comment" cols="45" rows="8" maxlength="65525" required="required"></textarea></p><p class="comment-form-author"><label for="author">Имя <span class="required">*</span></label> <input id="author" name="author" type="text" value="" size="30" maxlength="245" required='required' /></p> <p class="comment-form-email"><label for="email">Email <span class="required">*</span></label> <input id="email" name="email" type="email" value="" size="30" maxlength="100" aria-describedby="email-notes" required='required' /></p> <p class="comment-form-url"><label for="url">Сайт</label> <input id="url" name="url" type="url" value="" size="30" maxlength="200" /></p> <p class="form-submit"><input name="submit" type="submit" id="submit" class="submit" value="Отправить комментарий" /> <input type='hidden' name='comment_post_ID' value='8812' id='comment_post_ID' /> <input type='hidden' name='comment_parent' id='comment_parent' value='0' /> </p></form> </div><!-- #respond --> </div><!-- .comments-area --> </main><!-- #main --> </div><!-- #primary --> <aside id="secondary" class="widget-area" role="complementary"> <section id="search-2" class="widget widget_search"> <form role="search" method="get" class="search-form" action="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/"> <label> <span class="screen-reader-text">Поиск для:</span> <input type="search" class="search-field" placeholder="Введите ключевое слово" value="" name="s"> </label> <button type="submit" class="search-submit"> <i class="fa fa-search"></i> <span class="screen-reader-text">Поиск</span> </button> </form> </section><section id="categories-3" class="widget widget_categories"><h2 class="widget-title">Рубрики</h2> <ul> <li class="cat-item cat-item-3"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/raznoe">Автолюбителям</a> </li> <li class="cat-item cat-item-12"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/vidy-2">Виды</a> </li> <li class="cat-item cat-item-5"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/luchsh">Ликбез</a> </li> <li class="cat-item cat-item-16"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/luchsh-3">Лучш</a> </li> <li class="cat-item cat-item-13"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/luchsh-2">Лучшее</a> </li> <li class="cat-item cat-item-14"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/nov-2">Нов</a> </li> <li class="cat-item cat-item-8"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/vidy">Новинки</a> </li> <li class="cat-item cat-item-4"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/nov">Новости</a> </li> <li class="cat-item cat-item-11"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/raznoe-2">Разное</a> </li> <li class="cat-item cat-item-10"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/remont">Ремонт</a> </li> <li class="cat-item cat-item-9"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/test-drajv">Тест драйв</a> </li> <li class="cat-item cat-item-7"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/uaz">Уаз</a> </li> <li class="cat-item cat-item-15"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/xarakteristik-2">Характеристик</a> </li> <li class="cat-item cat-item-6"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/xarakteristik">Характеристики</a> </li> </ul> </section><section id="custom_html-4" class="widget_text widget widget_custom_html"><div class="textwidget custom-html-widget"><style>iframe,object{width:100%;height:480px}img{max-width:100%}</style><script type="text/javascript">jQuery(document).ready(function($){$('.mylink').replaceWith(function(){return'<a href="'+$(this).attr('data-url')+'" title="'+$(this).attr('title')+'">'+$(this).html()+'</a>'})});new Image().src="//counter.yadro.ru/hit?r"+escape(document.referrer)+((typeof(screen)=="undefined")?"":";s"+screen.width+"*"+screen.height+"*"+(screen.colorDepth?screen.colorDepth:screen.pixelDepth))+";u"+escape(document.URL)+";h"+escape(document.title.substring(0,150))+";"+Math.random();</script> </div></section></aside><!-- #secondary --> </div> <!-- Content-row --> </div><!-- #content --> </div><!-- #site-content-wrap --> <footer id="colophon" class="site-footer" role="contentinfo"> <div class="site-info"> <div class="container"> <div class="site-copyright clearfix"> <div class="advik-blog-lite-col-4 advik-blog-lite-columns copyright c_about"> <h4>ПОСЛЕДНЕЕ ОБНАВЛЕНИЕ 30.05.2018.</h4> <p>Сайт не является публичной офертой.</p> <p>Для информации по актуальным ценам необходимо связаться по телефону 58-72-67 для Оренбурга или 89534587267 для области.</p> </div> <div class="advik-blog-lite-col-4 advik-blog-lite-columns copyright"> <div class="copy">2019 © Все права защищены.</div> </div> <div class="advik-blog-lite-col-4 advik-blog-lite-columns copyright"> <div class="email">E-mail: uazmarket56@yandex.ru</div> </div> </div> <div class="sitemap clearfix"> <div class="advik-blog-lite-col-12 advik-blog-lite-columns copyright"> <a href="/sitemap.xml" class="c_sitemap">Карта сайта</a> </div> </div> </div><!-- .site-info --> </div> </footer><!-- #colophon --> </div><!-- #page --> <nav class="mobile-navigation mobile-menu" role="navigation"> <div class="mobile_close_icons"><i class="fa fa-close"></i></div> <div class="mobile-menu-container"><ul><li class="menu-item menu-item-type-taxonomy menu-item-object-category menu-item-2116"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/raznoe">Автолюбителям</a></li> <li class="menu-item menu-item-type-taxonomy menu-item-object-category menu-item-2117"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/vidy">Новинки</a></li> <li class="menu-item menu-item-type-taxonomy menu-item-object-category menu-item-2118"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/luchsh">Ликбез</a></li> <li class="menu-item menu-item-type-taxonomy menu-item-object-category menu-item-2119"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/test-drajv">Тест драйв</a></li> <li class="menu-item menu-item-type-taxonomy menu-item-object-category menu-item-2120"><a href="https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/category/remont">Ремонт авто</a></li> </ul></div> <div class="mobile-menu-social-icon"></div> </nav> <a href="#" class="scroll-to-top hidden"><i class="fa fa-angle-up"></i></a> <link rel='stylesheet' id='yarppRelatedCss-css' href='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/yet-another-related-posts-plugin/style/related.css?ver=5.8' type='text/css' media='all' /> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-includes/js/imagesloaded.min.js?ver=4.1.4' id='imagesloaded-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-includes/js/masonry.min.js?ver=4.2.2' id='masonry-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-includes/js/comment-reply.min.js?ver=5.8' id='comment-reply-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/themes/advik-blog-lite/assets/js/owl.carousel.min.js?ver=1.0' id='jquery-owl-slider-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/themes/advik-blog-lite/assets/js/custombox.min.js?ver=1.0' id='jquery-custombox-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/themes/advik-blog-lite/assets/js/public.js?ver=1.0' id='advik-blog-lite-public-js-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-includes/js/wp-embed.min.js?ver=5.8' id='wp-embed-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/easy-table-of-contents/vendor/smooth-scroll/jquery.smooth-scroll.min.js?ver=1.5.5' id='jquery-smooth-scroll-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/easy-table-of-contents/vendor/js-cookie/js.cookie.min.js?ver=2.0.3' id='js-cookie-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/easy-table-of-contents/vendor/sticky-kit/jquery.sticky-kit.min.js?ver=1.9.2' id='jquery-sticky-kit-js'></script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/easy-table-of-contents/vendor/waypoints/jquery.waypoints.min.js?ver=1.9.2' id='jquery-waypoints-js'></script> <script type='text/javascript' id='ez-toc-js-js-extra'> /* <![CDATA[ */ var ezTOC = {"smooth_scroll":"1","visibility_hide_by_default":"","width":"auto","scroll_offset":"30"}; /* ]]> */ </script> <script type='text/javascript' src='https://xn--56-6kcazkwo1bwd.xn--p1ai/wp-content/plugins/easy-table-of-contents/assets/js/front.min.js?ver=1.7' id='ez-toc-js-js'></script> </body> </html>