Lada Granta Седан 2021 обзор, комплектации и цены, характеристики
Обзор Granta Седан
Держит слово
Моя сила не в блеске внешних украшений и вещей. Не в достижениях виртуальной жизни. Моя сила в том, что я выполняю обещания. Не меняю мировоззрение раз в полгода, а иду к цели и помогаю другим достичь ее.
Новое в знакомом
А ведь правда, мы становимся лучше, умнее, опытнее, сильнее. Мы радуемся, открывая что-то новое в себе и рядом с собой. Замечаем, когда меняется действительно что-то важное – стиль, комфорт, возможности любимого автомобиля.
- Новые диски 15»
Легкосплавные диски оригинального дизайна с чередующимися двухразмерными спицами и полированной поверхностью - Форсунки омывателя
перенесены с капота на облицовку ветрового окна — стильное и практичное решение - Современная форма кузова
Улучшенная аэродинамика автомобиля - Легкое открытие багажника
Наружная электрокнопка отпирания багажника — неотъемлемый атрибут современного комфорта и стиля - Большие зеркала
Гарантия отличной обзорности - Настройка сиденья водителя
Регулировка в диапазоне 40 мм
Забота о каждом
Что может сравниться с той радостью, когда дарят подарок, который ты давно хотел? Только радость человека, которому даришь то, о чем он давно мечтал.
Но потребности даже близких людей иногда понять непросто. Хорошо, что есть машина, умеющая учитывать самые разные запросы.
- Комфорт пассажиров
Перчаточный ящик с полочкой, два подстаканника и две ниши на облицовке тоннеля пола для мелких вещей и держателем для авторучки - Освещение салона
Функция задержки освещения салона после закрытия двери: освещение гаснет через 25 секунд или сразу после включения зажигания - «Проводи меня домой»
Функция задержки выключения света фар: забота о водителе и пассажирах даже после того, как они покидают машину
- Акустический комфорт
Дополнительная шумоизоляция улучшает виброакустику салона: мягкие подкрылки в арках колес – из специального материала, эффективно гасит «пескоструй» и удары гравия - Датчик дождя
Незаменимая опция, когда ваш автомобиль окатят мутной водой из соседней лужи и при мелком дожде в долгой поездке - Просторный 5-местный салон
Удобно и практично: задний диван легко складывается в пропорции 2/3.
Ограничители двери с функцией инерционного доводчика
Ограничители двери с функцией инерционного доводчикаЖизнь, приправленная мощностью
Гамма двигателей мощностью 87, 98 и 106 л.с. позволяет выбрать автомобиль в соответствии со своим стилем вождения.
Все моторы оснащены облегченной шатунно-поршневой группой, что улучшает характеристики и повышает ресурс.
- Рабочий объем
1596 см - Мощность
87 л.с. (64 кВт) при 5100 об/мин - Момент крутящий
140 Нм при 3800 об/мин - Топливо
Бензин, min 95
- Рабочий объем
- Мощность
98 л.с. (72 кВт) при 5600 об/мин - Момент крутящий
145 Нм при 4000 об/мин - Топливо
Бензин, min 95
- Рабочий объем
1596 см - Мощность
106 л.с. (78 кВт) при 5800 об/мин - Момент крутящий
148 Нм при 4200 об/мин - Топливо
Бензин, min 95
Ответственность и безопасность
Мир скоростей требует повышенного внимания.
И повышенной отдачи: я слежу не только за собой, но и помогаю близким. А технологии помогают мне – ощутимо и эффективно! Особенно когда это комплекс электронных помощников водителя.
Благодаря проработанной силовой структуре кузова и современным системам безопасности LADA Granta седан выполняет российские и европейские требования по защите водителя, пассажиров и пешеходов.
- Подушки безопасности
Две фронтальные подушки безопасности – необходимая защита водителя и пассажира - ЭРА-ГЛОНАСС
Система экстренного оповещения работает даже в случае отключения аккумулятора - Задние датчики парковки
Более надежная страховка при маневрировании задним ходом
- Система торможения (ABS+BAS)
Антиблокировочная система с усилителем экстренного торможения: сохранение устойчивости и управляемости автомобиля - Курсовая устойчивость (ESC)
Предотвращает занос автомобиля - Помощник на подъеме
Система HSA помогает при старте на подъёме. Ощущение уверенности при подъеме (доступно для комплектаций с АМТ)
Вождение с азартом
LADA Granta предлагает выбрать принципиально разные варианты трансмиссии. Для мегаполиса – «автомат». Для поселка – «механика».
Для абсолютно любых условий – автоматизированная трансмиссия (АМТ).
Механическая коробка передач
Надежность и четкость переключений. В LADA Granta применяется МТ с тросовым приводом: это улучшает виброкомфорт автомобиля. Благодаря немецкому механизму переключения передач четкость и информативность выведены на уровень европейских аналогов. В механической коробке передач для 8-клапанного мотора внедрено новое передаточное число главной пары: 3,9 вместо 3,7. Новая трансмиссия повышает динамику автомобиля и обеспечивает уверенное ускорение.
Автоматизированная механическая трансмиссия
Две коробки по цене одной. С АМТ возможно двигаться как в полностью автоматическом, так и в ручном режимах.
АМТ получила обновленные настройки, а также сокращенное время переключения передач. «Городской» режим позволяет легко двигаться в пробках. Функция зимнего режима обеспечивает комфортное трогание на скользких покрытиях. Спортивный режим – для уверенного и динамичного старта.
Автоматическая коробка передач
Обеспечивает классический функционал АТ, максимально комфортное переключение передач и движение в городском потоке.
Комплектации и цены
| Подушка безопасности водителя | |||
| Крепления для детских сидений ISOFIX | |||
| Блокировка задних дверей от открывания детьми | |||
| Иммобилайзер | |||
| Дневные ходовые огни | |||
| Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС | |||
| Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD) | |||
| Система вспомогательного торможения (BAS) | |||
Подголовники задних сидений 2 шт. | |||
| Подушка безопасности переднего пассажира | |||
| Подголовники задних сидений 3 шт. | |||
| Охранная сигнализация | |||
| Противотуманные фары | |||
| Система электронного контроля устойчивости (ESC) (в Comfort только для АТ) | |||
| Противобуксовочная система (TCS) (в Comfort только для AT) | |||
| Система помощи при трогании на подъеме (HSА) (только для АТ и АМТ) | |||
| Розетка 12V | |||
| Бортовой компьютер | |||
| Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ) | |||
| Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом | |||
| Воздушный фильтр салона | |||
| Легкая тонировка стекол | |||
| Аудиоподготовка | |||
| Электроусилитель рулевого управления | |||
| Регулируемая по высоте рулевая колонка | |||
| Центральный замок | |||
| Электростеклоподъемники передних дверей | |||
| Обогрев наружных зеркал | |||
| Кондиционер | |||
| Подогрев передних сидений | |||
| Электропривод и обогрев наружных зеркал | |||
| Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика | |||
| Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте | |||
| Сиденье водителя с регулировкой по высоте | |||
| Центральный замок с дистанционным управлением | |||
| Электростеклоподъемники задних дверей | |||
| Обогрев ветрового стекла | |||
| Климатическая система | |||
| Датчики парковки задние | |||
| Датчики дождя и света | |||
| 14» стальные диски | |||
| Запасное полноразмерное стальное колесо 14» | |||
| Колпаки колес декоративные | |||
| Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова | |||
| Наружные ручки дверей в цвет кузова | |||
| Молдинги боковых дверей | |||
| 15» легкосплавные диски | |||
| Запасное стальное колесо временного использования 14» | |||
Характеристики
| Расположение двигателя | |||
| Длина / ширина / высота, мм | |||
| База, мм | |||
| Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом. .. | |||
| Колесная формула / ведущие… | |||
| Тип кузова / количество… | |||
| Количество мест | |||
| Колея передних / задних колес,… | |||
| Дорожный просвет под силовым агрегатом (полная… | |||
| Тип двигателя | |||
| Система питания | |||
| Рабочий объем, куб. см | |||
| Код двигателя | |||
| Количество, расположение… | |||
| Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об…. | |||
| Максимальный крутящий момент, Нм / об…. | |||
| Рекомендуемое топливо | |||
| Максимальная скорость, км/ч | |||
| Время разгона 0-100 км/ч, с | |||
| Городской цикл, л/100 км | |||
| Загородный цикл, л/100 км | |||
| Смешанный цикл, л/100 км | |||
| Снаряженная масса, кг | |||
| Объем топливного бака, л | |||
Технически допустимая максимальная масса,. .. | |||
| Максимальная масса прицепа без тормозной системы /… | |||
| Тип трансмиссии | |||
| Передаточное число главной… | |||
| Передняя | |||
| Задняя | |||
| Рулевой механизм | |||
Фотографии
Экстерьер
Интерьер
LADA Granta в кузове седан – современный маневренный автомобиль, имеющий 4 двери и более просторный багажник, чем в лифт- и хэтчбек версиях. Стоимость базовой комплектации самая низкая, от 419 900р. По этим и другим причинам седан принимают за возможного фаворита линейки, купить и протестировать автомобиль покупатели могут уже с октября 2018 года в салонах дилера.
Внешний вид
Седан Лада Гранта после рестайлинга смотрится совершенно иначе: новой стала передняя часть, капот, рельеф багажника, молдинги в отдельных комплектациях.
Появилась возможность заказать встраиваемые в зеркала повторители поворотов и ручки дверей в тон кузова. Обращая внимание на изменения в передней части:
- Перерисованная решетка радиатора с серебристой каймой
- Огни дневного света вписаны в ее верхние края
- Форсунки с омывающей жидкостью перенесены на фартук лобового стекла
- Зеркала стали шире и удобнее для обзора
- Диски получили новый дизайн звезды с двойными лучами разной ширины
Салон автомобиля
В зависимости от комплектации, выбирается интерьер нового седана. Базовой функцией стала поддержка головы с помощью анатомических подголовников и спины, за счет боковых валиков. Водитель может отрегулировать сиденье по высоте. Свет в салоне гаснет с 25-секундной задержкой.
Центральная панель LADA Granta 2018 уютная и наглядная, все кнопки упорядочены, как и информация на многополосном дисплее. Имеется кнопка открытия багажника, вызова экстренных служб, с повышением комплектации добавляются переключатели, такие как климат-контроль или подогрев передних сидений.
Двигатели и комплектации
Представлены моторы, уже знакомые водителям по ранним комплектациям: 1.6 объем для 87-сильного, 98-сильного и самого мощного двигателя в линейке со 106 л.с. Обновленные поршни с выемками под клапаны позволяют работать тише и надежнее, избегая загиба при разрыве ГРМ. Двигатели демонстрируют резвость на низких оборотах, при этом их шум сглаживается за счет хорошей изоляции салона.
Седан представлен в пяти комплектациях: Standard, Classic, Comfort, Luxe и Prestige. В младшей из них доступен только двигатель 87 л.с. и механическая коробка передач, старшая предоставляет широкий выбор комфортных опций: гибридную коробку передач, более мощный мотор, подушку безопасности для переднего пассажира, ассистент парковки и старта на подъеме, а также другие опции из длинного списка.
Руководства по эксплуатации
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 26.10.20
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 16.
07.20
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 24.03.20
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 09.01.20
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 29.10.19
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 10.10.19
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 04.09.19
Дополнение к руководству по эксплуатации LADA Granta Drive Active от 01.07.19
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 13.03.19
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 05.10.18
Руководство по эксплуатации LADA Granta от 20.08.18
Как узнать цвет автомобиля
У наших клиентов, желающих приобрести окрашенные детали для автомобилей Лада, часто возникает вопрос: как узнать точное наименование цвета? К примеру, у Лады Гранта существует 4 оттенка черного цвета.
Итак, для выяснения точного наименования цвета автомобиля Лада понадобится сервисная книжка автомобиля или гарантийный талон.
В свидетельство о регистрации смотреть не нужно, там МРЭО указывает цвет на свой вкус.
Наименование цвета кузова автомобилей Лада состоит из 3 цифр и названия цвета.
В сервисной книжке это выглядит так:
В гарантийном талоне вот так:
Название цвета после его цифрового обозначения может отличаться от заводского наименования цвета. К примеру, может быть указан цвет «691 серебристый». Заводское наименование этого цвета «691 Платина». Таким образом, при заказе деталей в цвет кузова вам нужно ориентироваться именно на цифровой код цвета.
Для автомобилей Датсун (Datsun) обозначение цветов отличается, на настоящий момент таблица соответствия цветов такова:
| Наименование цвета АвтоВАЗ | Наименование цвета Datsun |
| 240 Белое Облако | C04 или C04G (белый) |
| 413 Ледяной | C03 или C03G (серо-голубой) |
| 610 Рислинг | C02 или C02G (серебристый металлик) |
| 672 Пантера | C05 или C05G (черный) |
| 790 Кориандр | C01 или C01G (коричневый) |
Если у вас нет гарантийного талона или сервисной книжки на автомобиль, определить цвет возможно по дате выдачи паспорта транспортного средства (согласно плана покраски АвтоВАЗ).
Для определения цвета по дате выдачи паспорта транспортного средства надо перейти по ссылке http://avtosreda.ru/colorplans/2016/03.php , выбрать год и месяц выдачи ПТС, в таблице плана покраски выбрать модель автомобиля, и подобрать цвет. План покраски действителен только для автомобилей, собранных в г. Тольятти. По автомобилям, собранным в Ижевске, рекомендуем обращаться в систему обратной связи АвтоВАЗ.
Если у вас дубликат ПТС или цвет автомобиля не подобрать по плану покраски, вы можете задать вопрос о цвете автомобиля через систему обратной связи ПАО «АвтоВАЗ», указав VIN-номер автомобиля. Чтобы задать вопрос, перейдите по ссылке https://www.lada.ru/feedback/message.html
LADA Granta Cross – Обзор модели, фото – Первый Лада Центр, Краснодар.
1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Classic (21941-A1-X30)
• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиоподготовка
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
1.6 л 8-кл. (87 л.с.), 5МТ / Comfort (21941-A1-X31)
• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа.
Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
1.6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Comfort (21947-A1-X30)
• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Comfort (21947-A1-XR0)
• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Климатическая система
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5МТ / Luxe (21947-A2-X30)
• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
1. 6 л 16-кл. (106 л.с.), 5АМТ / Luxe (21947-A2-XR0)
• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Бортовой компьютер
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Обивка сидений комбинированная ткань/экокожа. Цвет (по выбору) оранжевый/серый
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V
• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика
• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в черном цвете
• Рейлинги
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»
| 102 | абрикос | + | серебристо-светло оранжевый | |
| 602 | авантюрин | + | серебристо-черный | |
| 425 | адриатика | синий | ||
| 204 | айсберг | белая-двухслойная | ||
| 243 | акапулько | ярко-желтый | ||
| 460 | аквамарин | + | серебристо-сине-зеленый | |
| 503 | аккорд | + | серебристо-коричневый | |
| 1018 | алмаз. серебро |
+ | (ИЖ) серебристый | |
| 660 | альтаир | + | серебристый светло-серый | |
| 355 | амазонка | ярко-зеленый | ||
| 145 | аметист | + | серебристый фиолетовый | |
| 371 | амулет | + | серебристо-темно-зеленый | |
| 425 | андриатика | голубой | ||
| 125 | антарес | + | темно-вишневый | |
| 277 | антилопа | + | серебристо-бежевый | |
| 286 | апатия | + | серебристый оранжевый | |
| 305 | аспарагус | + | серебристо-зеленый | |
| 490 | астероид | + | темно-сине-зеленый | |
| 440 | атлантика | светло-синий | ||
| 1158 | аустер | + | (GM) светло-серый | |
| 421 | афалина | + | серебристо-зелено-голубой | |
| 645 | базальт | + | серо-черный | |
| 107 | баклажан | темно-фиолетовый | ||
| 420 | балтика | темно-сине-зеленый | ||
| 353 | бальзам | зеленый | ||
| 235 | бежевый | бежевый | ||
| 240 | белое облако | белый | ||
| 201 | белый | белый | ||
| 302 | бергамот | + | серебристо-зеленый | |
| 451 | боровница | + | серебристо-серо-синий | |
| 480 | бриз | зелено-голубой | ||
| 262 | бронзовый век | + | бежево-коричневый | |
| 464 | валентина | серо-фиолетовый | ||
| 310 | валюта | + | серо-зеленый | |
| 655 | викинг | + | темно-серый | |
| 129 | виктория | + | серебристый ярко-красный | |
| 132 | вишн. сад |
темно-серебристо-красный | ||
| 127 | вишня | темно-бордовый | ||
| 313 | водолей | + | серо-зеленый | |
| 488 | галактика | + | темно-фиолетовый | |
| 423 | гейзер | + | серо-голубой | |
| 481 | голубой | голубой | ||
| 180 | гранат | темно-бордовый | ||
| 150 | дефиле | серебристо-серо-коричневый | ||
| 285 | джем | + | оранжево-коричневый | |
| 502 | дыня | + | серебристо-желтый | |
| 321 | дюшес | + | серебристо-молочно-зеленый | |
| 203 | жасмин | бело-желтый | ||
| 230 | жемчуг | + | серебристо-бело-молочный | |
| 307 | защитный | зеленый | ||
| 257 | звездная пыль | + | бежево-сиреневый | |
| 307 | зел. сад |
темно-зеленый | ||
| 963 | зеленый | + | зеленый | |
| 1012 | зеленый авокадо | (ИЖ) темно-зеленый | ||
| 1901 | зол.звезда | + | (GM) бежево-золотистый | |
| 331 | зол.лист | + | золотистый темно-зеленый | |
| 245 | золотая нива | + | серебристо-желто-зеленый | |
| 109 | золотисто-бежевый | + | (ИЖ) золотисто-бежевый | |
| 347 | золото инков | + | золотистый темно-зеленый | |
| 311 | игуана | + | серебристо-ярко-зеленый | |
| 515 | изабелла | + | темно-филетовый | |
| 385 | изумруд | + | серебристо-зеленый | |
| 441 | индиго | темно-синий | ||
| 406 | ирис | фиолетовый | ||
| 128 | искра | + | красный | |
| 358 | кайман | + | темно-зеленый | |
| 104 | калина | + | ярко-красный | |
| 190 | калифор. мак |
+ | золотисто-красный | |
| 453 | капри | + | темно-сине-зеленый | |
| 212 | капучино | светлый серо бежевый | ||
| 101 | кардинал | ярко-красный | ||
| 118 | кармен | красный | ||
| 630 | кварц | + | темно-серый | |
| 352 | кедр | серо-зеленый | ||
| 381 | кентавр | + | темно-зеленый | |
| 322 | колумб. зелень |
+ | золотисто-оливковый | |
| 116 | коралл | + | серебристый темно-красный | |
| 798 | корица | + | коричневый | |
| 370 | корсика | + | серебристый болотно-зеленый | |
| 665 | космос | + | черный | |
| 1017 | красн.перец | + | (ИЖ) серебристо-вишневый | |
| 1013 | красный порту | (ИЖ) вишневый | ||
| 281 | кристалл | + | светло-серый | |
| 435 | ла-манш | + | серебристо-фиолетовый | |
| 675 | лаванда | серебристо-коричневый | ||
| 487 | лагуна | + | серебристо-синий | |
| 445 | лазурит | + | фиолетово-синий | |
| 498 | лазурно-синий | + | серебристый темно-синий | |
| 495 | лунный свет | + | светло-голубой | |
| 410 | магеллан | темно-синий | ||
| 133 | магия | + | серебристо-ярко-фиолетовый | |
| 120 | майя | + | серебристый темно-бордовый | |
| 428 | медео | голубой | ||
| 234 | медовый | + | желто-золотой | |
| 317 | меридиан | зеленый | ||
| 1014 | мерц. синий |
+ | (ИЖ) серебристо-темно-синий | |
| 217 | миндаль | + | серебристо-бежево-розовый | |
| 280 | мираж | + | серебристый-желто-зеленый | |
| 606 | млеч. путь | + | серебристо-серо-графитовый | |
| 626 | мокр.асф | + | серебристый стальной | |
| 403 | монте-карло | ярко-синий | ||
| 325 | морск. пучина |
темно-зеленый | ||
| 458 | мулен руж | ярко-фиолетовый | ||
| 377 | мурена | сине-зеленый | ||
| 620 | мускат | + | серебристо-серо-золотистый | |
| 223 | нарцисс | желтый | ||
| 304 | наутилус | темно-зеленый | ||
| 239 | невада | + | серебристо-серо-бежевый | |
| 628 | нептун | + | серебристо-темно-серо-синий | |
| 270 | нефертити | + | серебристый-бежевый | |
| 383 | ниагара | + | серебристо-серо-голубоватый | |
| 1001 | озеро тахо | + | (УАЗ)темно-серо-зеленый | |
| 449 | океан | темно-синий | ||
| 345 | оливин | + | золотисто-зеленый | |
| 340 | оливковый | желто-зеленый | ||
| 1121 | олимпия | + | (GM) ярко-синий | |
| 419 | опал | + | серебристо-голубоватый | |
| 308 | осока | + | зелено-голубой | |
| 387 | папирус | + | серебристо-серо-зеленоватый | |
| 152 | паприка | + | серебристо-красно-оранжевый | |
| 404 | петергоф | серо-зеленоватый | ||
| 795 | пирано | + | красно-коричневый | |
| 417 | пицунда | зелено-синий | ||
| 615 | полюс мира | + | серо-коричневый | |
| 192 | портвейн | + | ||
| 406 | посейдон | + | темно-синий | |
| 342 | прерия | + | серебристо-серо-зеленый | |
| 605 | престиж | + | серебристо-темно-синий | |
| 276 | приз | + | серебристо-бежевый | |
| 210 | примула | светло-желтый | ||
| 448 | рапсодия | + | серебристо-ярко-синий | |
| 412 | регата | + | серебристо-темно-синий | |
| 122 | реклама | ярко-красный | ||
| 499 | ривьера | + | сине-фиолетовый | |
| 610 | рислинг | + | серебристо-бледно-серый | |
| 1002 | ричмо | + | (УАЗ) темно-коричневый | |
| 391 | робин гуд | + | тёмно-зелёный | |
| 182 | романс | темно-красный | ||
| 110 | рубин | красный | ||
| 442 | садко | темно-голубой | ||
| 1005 | салатовый | + | салатовый | |
| 670 | сандал | + | бежево-красный | |
| 446 | сапфир | + | серебристый сине-фиолетовый | |
| 215 | сафари | светло-бежевый | ||
| 671 | светло-серый | светло-серый | ||
| 301 | сер. ива |
+ | серебристый-зеленовато-серый | |
| 640 | серебристый | + | серебристый | |
| 236 | серо-бежевый | серо-бежевый | ||
| 233 | серо-бел | серо-белый | ||
| 427 | серо-голуб | серо-голубой | ||
| 373 | серо-зеленый | серо-зеленый | ||
| 1019 | серое олово | + | (ИЖ) серый серебристый | |
| 1011 | синий калипсо | (ИЖ) темно-синий | ||
| 447 | синяя полночь | синий | ||
| 483 | сириус | + | серо-синий | |
| 478 | слива | + | серебристо-ярко-синий | |
| 295 | сливочно-белый | сливочно-белый | ||
| 690 | сн. королева |
+ | серебристый | |
| 650 | совиньон | + | серебристо-серый | |
| 791 | солярис | + | темно коричневый | |
| 360 | сочи | + | серебристо-серо-зеленоватый | |
| 399 | табачный | + | серебристый коричнево-зеленый | |
| 206 | талая вода | + | светло-серый | |
| 509 | темно-бежевый | темно-бежевый | ||
| 793 | темно-коричневый | темно-коричневый | ||
| 456 | темно-синий | темно-синий | ||
| 170 | торнадо | красный | ||
| 100 | триумф | + | серебристо-красный | |
| 475 | тундра | + | серебристо-зеленоватый | |
| 1020 | ультрамарин | (ИЖ) сине-зеленый | ||
| 1115 | феерия | + | (GM) ярко-красный | |
| 416 | фея | + | серебристо-сиреневый | |
| 105 | франкония | + | темно-вишнево-малиновый | |
| 430 | фрегат | цвет морской волны | ||
| 363 | цунами | + | темно-зеленый | |
| 228 | чайная роза | светло-желтый | ||
| 408 | чароит | + | серебристый темно-фиолетовый | |
| 162 | черешня | темно-алый | ||
| 482 | черника | + | темно-синий | |
| 601 | черный | черный | ||
| 1021 | черный графит | + | (ИЖ) серебристо-серо-графитовый | |
| 513 | черный жемчуг | + | серебристо-коричневый | |
| 651 | черный трюфель | + | черный | |
| 637 | черный шоколад | + | темно-коричневый | |
| 415 | электрон | + | темно-серый | |
| 290 | южный крест | + | серо-бежевый | |
| 473 | юпитер | + | серебристо-голубоватый | |
| 202 | ярко-бел | ярко-белый | ||
| 140 | яшма | темно-вишневый |
LADA 219020, LADA GRANTA, год изготовления 2013, VIN ХТА219020D0124935, тип ТС легковой, модель, № двигателя 21126, 3136817, кузов ХТА219020D0124935, цвет кузова серебристый, мощность двигателя, л.
с. (кВт) 97,9 л.с. (72.0 кВт), рабочий объем двигателя 1596 куб.см., разрешенная мах масс, кг 1560 | Ульяновская область Порядок оформления участия в торгах, перечень документов участника и требования к оформлению:
Заявки на участие в торгах подаются в электронной форме посредством системы электронного документооборота на сайте в сети Интернет по адресу: http://bankrupt.etpu.ru/
Порядок и критерии определения победителя торгов:
Право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения, который представил в установленный срок заявку на участие в торгах, содержащую предложение о цене имущества должника, которая не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, при отсутствии предложений других участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения. В случае, если несколько участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения представили в установленный срок заявки, содержащие различные предложения о цене имущества должника, но не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов, предложившему максимальную цену за это имущество.
В случае, если несколько участников торгов по продаже имущества должника посредством публичного предложения представили в установленный срок заявки, содержащие равные предложения о цене имущества должника, но не ниже начальной цены продажи имущества должника, установленной для определенного периода проведения торгов, право приобретения имущества должника принадлежит участнику торгов, который первым представил в установленный срок заявку на участие в торгах по продаже имущества должника посредством публичного предложения.
Срок и порядок подписания договора купли — продажи:
В течение пяти дней с даты подписания протокола о результатах проведения торгов финансовый управляющий направляет победителю торгов предложение заключить договор купли-продажи с приложением проекта данного договора в соответствии с представленным победителем торгов предложением о цене имущества. В случае отказа или уклонения победителя торгов от подписания договора купли-продажи в течение пяти дней с даты получения от финансового управляющего предложения о заключении договора и проекта данного договора внесенный задаток победителю торгов не возвращается, а финансовый управляющий вправе заключить договор купли-продажи с участником торгов, которым предложена наиболее высокая цена имущества по сравнению с ценой имущества, предложенной другими участниками торгов, за исключением победителя торгов.
Сроки уплаты покупной цены по итогам проведения торгов:
Оплата по договору купли-продажи должна быть осуществлена в течение 30 дней с даты заключения договора купли-продажи на расчетный счет Организатора торгов — Гридяев Виктор Николаевич, счет № – 40817810772003445966, Банк получателя – Сбербанк России, БИК – 047501602, Корр. счет – 30101810700000000602
орденов и наград Среднего царства
ордена и награды Среднего царства Из статьи, первоначально опубликованной в Tournament Illuminated # 110, Spring 1994.последнее обновление: 23 июня 2009 г.
от госпожи Джессы д’Авондейл
Среднее царство, третье царство Общества творческого анахронизма, была основана в A.S. IV. +
Герб королевства — Argent, бледно-красный, в целом проход дракона.
Верт, в первую очередь древняя корона Или в собственно лавровом венке. Драконы (или их части) включены во многие имена и
жетоны наград королевства.
Патенты на оружие
Уходящие короли и королевы не получают патентов на оружие. Однако в середине Королевский Орден Первенства, Герцоги / Герцогини и Графы / Графини указаны перед обладатели патентов на оружие (рыцари, лавры и пеликаны).Гранты вооружений
По усмотрению Короны любому лицу может быть предоставлено оружие. благодаря выдающимся достижениям в любой области.Великие офицеры королевства, получившим Грант, разрешено использовать герб дракона при отображении их руки. Другие держатели Грантов могут использовать Герб в соответствии с указаниями Короны.Следующие награды несут с собой Грант оружия, если получатели еще не есть они:
Орден Сердца Дракона: вручается тем, кто выполнил
услуги от имени королевства сверх того, что обычно ожидается.Соратники ордена могут поставить инициалы CDH после своих имен, и
может носить медальон со знаком ордена: Argent, a heart vert
чешуйчатый серебристый.
Орден Золотой Булавы: вручается соратникам Ордена Красного. Компания, показавшая мастерство и лидерство в рукопашном бою и / или турнирах. бой, и кто обучил других этим навыкам. Соратники ордена могут ставьте инициалы CGM после их имен.Те, кто не принадлежит к рыцарству можно именовать «лейтенантами Красной роты».
Орден компании Greenwood: награжден за превосходство в двух из трех
области стрельбы из лука: искусство, обслуживание, искусство и наука. Спутники
заказ может помещать инициалы CGC после их имен и может стилизовать
себя как Лесники Зеленолесья. Значок заказа: (Без поля).
На ветке сосен феон перевернул Or.
Компания Бронзового кольца: вручается тем, кто проявил превосходство и
лидерство в рапирном бою, и кто обучил других этим навыкам.
Соратники по приказу могут поставить инициалы ЦБ РФ после своих имен и могут
называют себя Хранителями Бронзового Кольца.
Рота Белого Копья: вручается тем, кто проявил превосходство в два из трех направлений конной деятельности; мастерство, сервис, искусство и наука.Соратники отряда могут размещать инициалы CWL после своих имен.
Орден Вечнозеленых растений: вручается тем, кто учил и проявлял превосходство в одном или нескольких из искусств, наук или в исследованиях. Соратники заказа могут разместить инициалы CE после их имен. Знак заказа: (Бесполе) Сосна бледно-пурпурного цвета и Ор.
Оружейные награды
Звания придворного барона и баронессы присвоены усмотрение Короны признать благородство тех, кто был отличная услуга короне или королевству.Придворные бароны также обычно присуждается территориальным баронам и баронессам, когда они уходят в отставку. Согласно Корпорация, титул сопровождается Оружейной наградой, однако в середине Королевский Орден старшинства, придворные бароны и баронессы указаны перед обладатели грантов вооружений.
Награда за оружие может быть вручена по усмотрению Короны в качестве отдельная награда или в сочетании со следующими наградами и орденами:
Орден Ивы: вручается тем, кто демонстрирует навыки, но еще не
мастерство в одном или нескольких искусствах.Соратники заказа могут разместить
инициалы CW после их имен и могут носить медальон с изображением ордена
знак: Purpure, ива уничтоженная Ор.
Орден Серебряного Дуба: вручается тем, кто проявляет мастерство, но не
все же мастерство в одной или нескольких науках или исследованиях. Спутники
орден может размещать инициалы CSO после их имен и может носить медальон
со знаком ордена: Purpure, дуб взорванный и уничтоженный.
серебристый фруктовый Or.
Награда Purple Fret: вручается физическим лицам за долгое и долгое время.
преданное служение своей группе, офису или царству.
Получатели награды
может ставить инициалы APF после своего имени и может носить медальон
с нагрудным знаком заказа: Или пурпурный лад. Эту награду можно получить более одного раза.
Награда Милости Лани (ранее — Благосклонность Королевы): вручается тем, кто
продемонстрировали вежливость и благородство на поле или за его пределами, а также
доброта к окружающим.Человек может получить эту награду более одного раза,
и получатели могут носить медальон со значком ордена: Azure, a
меч собственно enfiled венка цветов серебра, скольжения и листьев Or. Оригинальная награда была учреждена во времена первого правления герцогини Эйслинн.
Пациент (на геральдическом гербе которого изображена лань), имя изменено на честь
ее как памятник.
Награда Королевской Чаши: вручаются тем
которые в глазах Государя проявили превосходство и подлинность в
выбранное ими поле.Получатели могут поставить инициалы RKC после своих имен.
An
человек может получить эту награду более одного раза,
Жетон представляет собой медальон со знаком ордена.
Орден Зуба Дракона: вручается тем, кто выполнил
драматические подвиги в боевых искусствах от имени королевства, сверх того и за его пределами
что обычно ожидается. Часто вручается
поле в то время, когда дело было засвидетельствовано. Соратники ордена могут
поместите инициалы CDT после их имен и можете носить клык, подвешенный на
цепь или медальон со знаком ордена: Argent, на бледной вершине
три клыка Или.
Орден Зуба Дракона: вручается тем, кто демонстрирует мастерство
поле для стрельбы из лука, или образцовая служба в продвижении стрельбы из лука. Спутники
орден может размещать инициалы CDB после их имен и может носить медальон
со знаком ордена: Хвост дракона, бледный, зазубренный перед вождем, внутри
и исходящий из кольцевой верт, чешуйчатый серебристый.
Орден Кавендишского узла: вручается тем, кто демонстрирует мастерство
область боя на рапирах или образцовая служба в продвижении боя на рапирах. Соратники ордена могут размещать инициалы CCK после своих имен.
и может носить медальон со знаком ордена: четыре кавендишских узла
соединены крестом, верт.
Орден Белого Шамфрона: вручается тем, кто проявил мастерство в сфере конного спорта или образцовой заслуги в продвижении в этой сфере. Соратники ордена могут размещать инициалы CWC после своих имен. и может носить медальон со знаком ордена: (Бесполевой) Chamfron argent.
Орден Красной роты: за лидерство в бою. Члены
Орден, известный как Сержанты Красной Роты, должен быть опытными бойцами
в ближнем бою, разбирается во многих стилях оружия, и лидеры своим примером как на, так и на
вне поля битвы, работая, чтобы служить военным усилиям королевства и обучая
и обучение других. Их поведение должно быть примером вежливости и чести.
Знак ордена: Gules, две булавы с отбортовкой из серебра.
Орден открытой раны: вручается тем, кто на поле боя
дрался, получил травму, потребовавшую хирургического вмешательства или другого госпитального ухода
Соратники отряда могут ставить инициалы CGW после своих имен.
Этот
заказ был закрыт, чтобы подчеркнуть безопасное поведение в списках.
Награды без оружия
Следующие награды не означают оружия или превосходства:
Награда «Сокровище Дракона»: вручается молодежи, имеющей
оказал образцовую службу королевству.Эту награду можно получить еще
более одного раза, и получатели могут носить гербовую накидку или медальон с наградой
знак: Драконья игра, стоящая в вертикальном положении, поддерживающая заряженный серебряный медальон.
с бледно-красным цветом.
Награда Бантона: вручается молодежи, имеющей проявил рыцарство и энтузиазм в боевых искусствах. Эту награду можно получить еще чем однажды.
Награда Серебряного желудя: вручается молодежи, имеющей проявил энтузиазм и усилия в области искусства и науки.Эту награду можно получить еще чем однажды.
Награда Purple Fretty: аналогична Purple Fret, за службу
филиалы, гильдии или другие организованные группы. Те группы, которых так почитают, могут
знамя: Или пушисто-пурпурное, рядом с их знаменем.
Награда Зуба Дракона: , подобная Зубу Дракона, для групп
кто преуспел в бою. Отряды, удостоенные такой чести, могут нести знамя: Argent,
на танце между двумя сломанными зубами дракона вертится еще один серебристый.
Награда Полета Дракона: , похожая на Зубец Дракона, для групп
кто преуспел в стрельбе из лука. Группы, удостоенные такой чести, могут нести знамя: Argent, a
бледный vert чешуйчатый серебристый между четырьмя феонами vert.
Награда Рощи: вручается филиалам, гильдиям или другим организованным
группы, продемонстрировавшие мастерство в искусстве и / или науках, или образцовые
услуги в продвижении таких полей.Эти прославленные группы могут нести знамя: Per pale Or
и серебристый, быстро пурпурный.
Награда Сапфира: вручается тем, кто проявляет вежливость, грацию и честь людям всех рангов, которые являются примером «воплощения мечты». Получатели могут поставить инициалы RSL (Получатель сапфирового света) после своего имени, и может носить медальон со значком: (без поля) Драгоценный камень лазурный . Личность может получить эту награду более одного раза.
Орден Королевского авангарда: вручается тем, кто служил короне как чемпион короля или королевы. Соратники по заказу могут разместить инициалы CRV. после их имен.
Орден Розы: вручается тем, кто служил Консортом в хотя бы одно полное правление. Членство автоматически после схождения на престол. Посередине Орден существует с целью поощрения рыцарских и вежливое поведение среди всех членов Общества.
Увеличений оружия вручаются Короной тем лицам, которые
дали так много и такого качества, что награды и награды
Царство не выражают в достаточной степени того уважения, которым они пользуются. Каждый
аугментация — это особый заряд, добавляемый к геральдическим
оружие. Эта честь предоставляется редко.
> Вернуться к Указателю наградных статей
Сайт Поднебесной
Эта колонка была составлена на основе закона Среднего царства (апрель 2000 г.) и «The Почести Среднего Царства «, баронесса Грейдни ни Руайд, Помощь оказали лорд Торвальд Рэдхейр (главный вестник драконов), лорд Гвилим. ap Alun (Trillium Herald), лорд Алан Fairfax Aluricson (Fenris Herald), Графиня Женевьев дю Вент Арджент, мастер Гарет Танкред Уилфрет, лорд Бервин Этельбрихт из Экли, Гриммунд Чернокрыл, леди Гвендолинн ферч Элидир и госпожа Кейтлин Дэвис.Иллюстрации наградных значков были предоставил Михаил Любельский.
Хозяйка Джесса д’Авондейл (Марла Лесин) проживает в Восточном Королевстве. Она приглашает всех, у кого есть обновления или исправления к этой статье, в свяжитесь с ней.
Высокочувствительный гомогенный иммуноанализ, основанный на создании серебряных треугольных нанопластин-квантовых точек Система FRET
Улучшенный синтез STNP представлял собой метод роста, опосредованного семенами, в соответствии с нашим предыдущим методом 19 . Во-первых, соли серебра восстанавливали сильным восстановителем для получения затравочных частиц. После этого частицы затравки серебра немедленно облучали натриевой лампой (70 Вт) в течение 2 часов. Вкратце, треугольные нанопластинки с пиком поглощения плазмона при 613 нм были синтезированы с использованием цитратной кислоты в качестве поверхностного лиганда 19,21 . На рисунке S1 в вспомогательной информации схематически показан процесс роста очень однородных и неоднородных STNP. Высокооднородные STNP (см. FESEM на рис.2) были приготовлены дополнительным контролем ОН — . Как показано на рисунке S2 в вспомогательной информации, малое увеличение FESEM и узкое распределение размеров STNP хорошо подтверждают высокое качество и высокую однородность подготовленных STNP. Без добавления OH — полученные STNP имеют неоднородную морфологию, размер и широкое распределение по размерам (см. FESEM на рисунке S3), что подтверждается расширением полной ширины на полувысоте (fwhm) спектра поглощения плазмонного резонанса. (Рисунок S3 во вспомогательной информации).Очевидно, что значение fwhm может быть уменьшено со 117 нм до 83 нм после введения OH — . Это связано с тем, что введение OH — может равномерно подавить скорость генерации ионов серебра в сумме 19 . Мы действительно наблюдали, что окисление наночастиц серебра, очевидно, сдерживалось введением OH — . Хотя световое облучение ускоряет процесс окисления небольших наночастиц серебра из-за повышения температуры, ионы OH — , по-видимому, эффективно подавляют побочный эффект.Следовательно, введение OH — может ингибировать окисление наночастиц серебра и замедлить скорость генерации ионов серебра, что благоприятно для кинетического контроля роста 19,21 . Как показано на рис. 2, длина стороны треугольных нанопластин составляет около 70 нм. В нашем случае настроенные по размеру красные КТ (λ em = 612 нм) были выбраны в качестве донора для HIA, потому что они хорошо совпадают с полосой поглощения локализованного плазмонного резонанса STNP.
Масштабная линейка составляет 200 нм.
Поскольку квантовые точки и STNP были закрыты отрицательно заряженными лигандами 3-меркаптопропионовой кислоты и лимонной кислоты, соответственно, таким образом, когда QD и STNP были смешаны вместе в одном сосуде, они не могли объединиться друг с другом из-за электростатического отталкивания. сила. Следовательно, ФЛ квантовых точек будет оставаться постоянной. Как показано на рис. 3 и 4а, когда объем СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ почти осталась постоянной.Однако, когда модифицированные этилендиамином STNP были добавлены в раствор QD, QD могли легко объединиться с STNP через мостиковую связь этилендиамина из-за электростатического взаимодействия. Следовательно, фотолюминесценция квантовых точек будет эффективно подавляться STNP из-за безызлучательного процесса FRET.
Цифровые фотографии раствора КТ до и после добавления STNP, модифицированных этилендиамином, при возбуждении ультрафиолетовой лампой показаны на Рисунке S4 во вспомогательной информации.Невооруженным глазом можно наблюдать, что флуоресценция КТ резко гасится после введения модифицированных этилендиамином СТНЧ. Как показано на рис. 3 и 4b, когда объем модифицированных этилендиамином СТНЧ, добавленных в раствор КТ, был увеличен с 5 до 10, 20, 40 мкл и выше, интенсивность ФЛ КТ сильно гасилась, и гашение приближалось к насыщению до тех пор, пока объем СТНП достигал около 160 мкл.
Схема механизма тушения, основанная на FRET, от QD до STNP, модифицированных этилендиамином.
Рисунок 4 Изменение интенсивности ФЛ на пике эмиссии КТ после добавления различных объемов STNP ( a ) и STNP, модифицированных этилендиамином ( b ). Объем СТНП был увеличен с 5 до 10, 20, 40, 80 и 160 мкл.
Концентрация квантовых точек была зафиксирована на уровне 14 нМ. На вставке — соответствующая эволюция спектров ФЛ квантовых точек.
Эффективность FRET можно оценить как Ф FRET = 1 — I DA / I D , предполагая, что другие механизмы гашения, такие как реабсорбция, незначительны, где I DA и I D представляют собой интенсивность флуоресценции донора FRET с и без присутствия акцептора FRET, соответственно 1,3 .Согласно спектрам ФЛ, показанным на рис. 4б, эффективность FRET могла достигать 98% для КТ в точке насыщения тушения. Такая высокая эффективность FRET демонстрирует синергетический эффект благодаря свойствам настоящей конструкции 3 . Во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усилить участки тушения и повысить эффективность тушения. Во-вторых, СТНП имеют большой коэффициент экстинкции. Коэффициент экстинкции СТНЧ составляет примерно 10 12 M -1 см -1 (подробности см.
Во вспомогательной информации), что примерно на 2–3 порядка величины выше, чем у наночастиц золота, и даже на 7–8 на порядки выше, чем у флуоресцентных красителей.В-третьих, спектры STNP и QD идеально перекрываются благодаря рациональной перестройке спектров наших специально разработанных доноров QD и акцепторов STNP. Очевидно, что чем больше перекрываются спектры между донором и акцептором, тем выше будет эффективность FRET. Наконец, поглощение СТНЧ при возбуждении донора, например, 400 нм для квантовых точек, невелико, что максимально устранит неблагоприятное влияние эффекта FRET. Поскольку тушение PL QD коррелирует с дозировкой STNP, мы могли бы выполнить HIA на основе тушения флуоресценции QD, когда высокоэффективные и надежные QD функционировали как индикаторный агент обнаружения.
В этой работе был выбран вирус гепатита В для проведения ОВЗ на основе наноплатформы QDs-STNPs FRET. Схематический путь HIA HBsAg представлен на рис. 1. STNP, иммобилизованные с HBsAb1 на поверхности, используются в качестве акцепторов FRET. С другой стороны, излучающие красный цвет КТ (λ em = 612 нм), иммобилизованные HBsAb2 посредством ковалентного связывания (рис. S5 в вспомогательной информации), используются в качестве доноров FRET. Добавление аналита HBsAg к раствору HIA запускало иммунные реакции, индуцированные сэндвич-конструкцией, что приводило к коррелированным с концентрацией Ag процессам FRET.Перед тестом на обнаружение сначала смешивали STNP-Ab1 и QD-Ab2 в гомогенном растворе. Когда аналит Ag был добавлен в раствор, сэндвич-структура STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 будет формироваться из-за иммунных реакций, и FRET от QD до STNP будет происходить спонтанно.
Как показано на вставке к фиг. 5 и цифровой фотографии набора квантовых точек на фиг. 6, тушение ФЛ демонстрирует развивающийся процесс FRET по сравнению с увеличением концентрации HBsAg.Кривые обнаружения были получены путем вычитания интенсивности ФЛ контрольного образца QDs-Ab2 без Ag и сэндвич-структур STNPs-Ab1 / Ag / QDs-Ab2 с Ag. На рис. 5а, б показаны спектры ФЛ системы HIA с различными концентрациями антигенов, когда дозовая концентрация QDs-Ab2 составляла 7 нМ и 0,35 нМ соответственно. Было обнаружено, что интенсивность флуоресценции монотонно увеличивалась с постепенным увеличением концентрации Ag до 160 нг / мл -1 для более высокой концентрации QD и 8.1 нг мл -1 для более низкой концентрации КТ, соответственно. Следовательно, диапазон обнаружения HBsAg может достигать 160 нг / мл -1 для этого HIA. После линейной аппроксимации линейная калибровочная кривая может быть получена как Y = 86,0671X — 148,2 (5 ≤ X ≤ 40 нг мл -1 , R = 0,997) для более высоких доз HBsAg и Y = 1088,7X — 93,96 (0,3 ≤ X ≤ 2,7 нг / мл -1 , R = 0,999) для обнаружения HBsAg с более низкой дозировкой соответственно. Предел обнаружения (LOD) был определен как самая низкая концентрация обнаруженного образца, которая дает положительное значение вычитания интенсивности PL между контрольным и обнаруженным образцом 1,22 . Из фиг. 5b отчетливо видно, что вычтенная интенсивность PL все еще оставалась положительной, даже когда концентрации HBsAg были такими низкими, как примерно 300 пг / мл -1 для HIA, когда применялась более низкая дозированная концентрация. Таким образом, LOD этого HIA может достигать всего 300 пг / мл -1 . В результате мы можем выполнять чрезвычайно точное обнаружение в относительно широком диапазоне концентраций и требования к высокочувствительному обнаружению (например, 300 пг / мл -1 ~ 160 нг / мл -1 ).Здесь LOD в 27,7 раз ниже, чем предыдущий результат при использовании золотых наностержней (GNR) в качестве акцептора FRET (8,3 нг / мл -1 ) 1 , что связано с более высокой эффективностью FRET, как обсуждалось выше. Соответствующие параметры STNP и GNR показаны в таблице S1; сравнение объясняет причину более высокой эффективности FRET и более низкого LOD обнаружения антигена при использовании STNP. Одним словом, нельзя игнорировать две причины: во-первых, STNP имеют большую площадь поверхности и отсутствие кривизны, что может усиливать участки тушения и повышать эффективность FRET. Во-вторых, СТНЧ имеют больший коэффициент экстинкции по сравнению с наночастицами золота. Теоретически, когда концентрация аналита Ag превышает насыщенную концентрацию меченого Ab, например, 320 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более высокой концентрацией Ag и 24,3 нг / мл -1 для HBsAg в иммуноанализе с более низкой концентрацией Ag , ответа на иммуноферментный анализ быть не должно. Фактически, кривая обнаружения немного снизилась. Это связано с тем, что добавление детектированного HBsAg к набору заменило сэндвич-Ag и привело к восстановлению флуоресценции квантовых точек (рис.7).
Обнаружение антигена на основе FRET с предоставленной концентрацией QDs-Ab 7 нМ ( a ) и 0,35 нМ ( b ). Связь между вычтенной интенсивностью PL (I 0 -I) QDs-HBsAb в присутствии STNPs-Ab1 и обнаруженным HBsAg с различными концентрациями. На вставке — соответствующее изменение спектров ФЛ квантовых точек.
Цифровая фотография набора КТ до ( a ) и после ( b ) обнаружения антигена на основе FRET при возбуждении ультрафиолетовой лампой.Слева направо концентрация обнаруженного антигена увеличивается от 0 до 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 и 320 нг / мл. Каждая концентрация антигена определяется статистикой пяти параллельных образцов.
Рисунок 7Схема механизма восстановления флуоресценции, вызванного перенасыщенным детектируемым Ag.
Специфичность иммунного обнаружения в основном зависит от иммунореактивности меченых моноклональных антител. Чтобы доказать высокую обнаруженную специфичность нашей ОВЗ на основе FRET, мы также выполнили некоторую неспецифическую диагностику.Для подтверждения специфичности был проведен контрольный тест с применением 1% раствора BSA в качестве образца аналита. Поскольку как структура, так и морфологические свойства HBeAg и HBsAg подобны друг другу, необходимо обнаруживать HBeAg для дальнейшего подтверждения специфичности HIA.
Результаты показаны на фиг. 8, на которой интенсивность флуоресценции нормализована к значению обнаружения HBsAg с учетом специфичности HBsAg за 100%. Когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания HBeAg, может наблюдаться низкая интенсивность флуоресценции.Этот феномен означает, что имелось 8,6% неспецифического связывания HBeAg. Аналогичным образом, когда конъюгаты QDs-HBsAb используются для обнаружения неспецифического связывания образца BSA, при тех же условиях обнаружения наблюдается только небольшой сигнал PL. Это явление означает, что неспецифичность в отношении молекул BSA составляет лишь 5,6%. Очевидно, что HIA с использованием конъюгатов QDs-HBsAb очень специфичен для обнаружения HBsAg, поскольку специфичность превышает 90%. В результате наша HIA, основанная на наноплатформе FRET QDs to STNPs, заслуживает доверия и осуществима.
Специфичность экспериментов по неспецифическому связыванию BSA (1%) и HBeAg с использованием гомогенного иммунного детектирования на основе FRET с учетом специфичности HBsAg как 100%.
Использование стабильно экспрессируемого биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов
Abstract
Многие противораковые препараты предназначены для уничтожения раковых клеток путем индукции апоптоза. Однако анализы активности, используемые для измерения биологической активности этих продуктов, обычно представляют собой анализы жизнеспособности клеток, которые не делают различий между гибелью клеток и ингибированием роста.Здесь мы описываем клеточный биосенсор с резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET), предназначенный для измерения биологической активности противораковых препаратов, вызывающих апоптоз. Биосенсор содержит голубой флуоресцентный белок (CFP), связанный через последовательности распознавания, специфичные для каспазы 3 и каспазы 8, с желтым флуоресцентным белком (YFP). При активации каспазы, как и в случае индукции апоптоза, линкер отщепляется, уничтожая клеточный сигнал FRET. Этот анализ точно отражает механизм действия противораковых лекарств в уничтожении раковых клеток и, следовательно, может использоваться в качестве теста на эффективность различных противораковых лекарств.
Мы строго продемонстрировали это, охарактеризовав класс белков, нацеленных на рецепторы смерти. Одноэтапный анализ, по-видимому, превосходит другие анализы, основанные на апоптозе, благодаря своей простоте, удобству и надежности.
Образец цитирования: Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) Использование стабильно выраженного биосенсора FRET для определения эффективности противораковых препаратов. PLoS ONE 9 (9): e107010. https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0107010
Редактор: Wei Xu, Университет Висконсина — Мэдисон, Соединенные Штаты Америки
Поступила: 28 апреля 2014 г .; Дата принятия: 10 августа 2014 г .; Опубликовано: 4 сентября 2014 г.
Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, модифицировать, надстраивать или иным образом использовать в любых законных целях.
Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.
Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все данные включены в статью.
Финансирование: Эта работа была поддержана Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центром оценки и исследований лекарственных средств, Фондом инициативы «Критический путь»; и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, Центр оценки и исследований лекарственных средств, Фонд Инициативы по медицинскому противодействию. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
Эффективность — это мера активности лекарственного средства с точки зрения концентрации или количества, необходимого для достижения определенного биологического эффекта [1].
Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы максимально полно отразить механизмы действия лекарственного средства. Для онкогенных лекарств, которые предназначены для уничтожения раковых клеток, анализ активности может быть мерой цитотоксичности лекарства в отношении раковых клеток.Исторически многие химиотерапевтические агенты были идентифицированы путем высокопроизводительного скрининга библиотек соединений с использованием анализов жизнеспособности клеток с МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) или другими родственными красителями [2], [3]. Этот формат анализа получил широкое распространение в качестве теста на эффективность при разработке лекарств от рака. Однако анализы жизнеспособности клеток не могут различить эффекты гибели клеток и остановки роста, что оставляет оговорку в оценке истинной биоактивности противоракового лекарства.Поскольку цель терапии рака — убить раковые клетки, очень важно оценить способность лекарства вызывать гибель раковых клеток. Форма гибели клеток, наиболее часто связанная с лечением рака, как in vivo, и in vitro, — это апоптоз или запрограммированная гибель клеток.
Отличительным признаком апоптоза является активация протеаз каспаз, приводящая к расщеплению структурных белков и образованию апоптотических телец [4]. Существует два различных пути, а именно внутренний и внешний, которые приводят к активации каспазы в ответ на лекарственное лечение.Классические химиотерапевтические препараты, такие как этопозид, компактин, фторурацил (5-FU), таксол и камптотецин, вызывают активацию каспазы 3 р53-зависимым образом [5] — [7], что часто связано с митохондриальными изменениями. Напротив, новый класс белков, нацеленных на рецепторы смерти, экспрессируемые на поверхности клетки, находится в стадии разработки [8] — [11]. Эти белки включают варианты рекомбинантного фактора некроза опухоли человека (TNF), связанный с TNF лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к рецепторам смерти.
TRAIL связывается с рецептором смерти 4 и / или 5 (DR4 / 5) и впоследствии индуцирует сборку индуцирующего смерть сигнального комплекса (DISC), содержащего адаптерный белок, ассоциированный с Fas белок с доменом смерти (FADD) и прокаспазу 8. Внутри В DISC, прокаспаза 8 активируется путем саморасщепления и высвобождается в цитозоль, где активирует каспазу 3. В некоторых типах клеток передача апоптотических сигналов дополнительно усиливается через митохондрии в результате транслокации каспазы 8. опосредованное расщепление Bid (белок взаимодействующего домена Bh4).Таким образом, эффективность противоракового лекарства можно оценить, измерив величину активности каспазы в обработанных клетках. Одним из подходов к измерению активности каспаз было использование флуоресцентных зондов, содержащих субстраты каспаз, показывающих изменения интенсивности флуоресценции при активации каспазы [12] — [16]. В качестве альтернативы активные каспазы могут быть обнаружены с помощью иммуноблот-анализа с использованием антител, специфичных к расщепленной форме отдельного фермента [14], [17] — [19]. Однако эти анализы могут быть связаны с большой вариабельностью из-за сложных операционных процедур.В этом исследовании мы разработали клеточный FRET-анализ для проверки эффективности продуктов рака. Зонд FRET содержит последовательности распознавания как для каспазы 3, так и для каспазы 8, и было обнаружено, что он чувствителен к лекарствам от рака, которые действуют внутренними или внешними путями. В частности, со стабильно экспрессируемым зондом FRET, ответ, вызванный лекарством, непосредственно отслеживается на обработанных клетках без дополнительных этапов обработки. Более того, анализ FRET выявляет клетки, подвергающиеся апоптозу, с заметной чувствительностью и экспериментальной простотой, что делает его многообещающим анализом эффективности для оценки противораковых препаратов.
Материалы и методы
Клеточные линии и реагенты
Линия клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния).
Плазмида pCMV6-AC для экспрессии слитого белка (552 аминокислоты), содержащего полноразмерный голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), связанные через последовательность распознавания каспазы, была приобретена у OriGene (Rockville, MD). Линкер между CFP и YFP содержит шестнадцать аминокислот, GSGDEVDGGIETDGSG, которые могут расщепляться активированной каспазой 3 при G ↓ DEVD или каспазой 8 при G ↓ IETD, где ↓ указывает сайт разрезания протеазы.Кодирующая последовательность кДНК (1656 пар оснований) слитого белка CFP-линкер-YFP была клонирована в вектор pCMV6-AC по сайтам рестрикции Sgf I и Mlu I, и правильность конструкции была проверена путем нуклеотидного секвенирования. Плазмиду трансфицировали в клетки MB231 с использованием реагента Lipofectamine 2000 в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, Carlsbad, CA). Трансфицированные клетки отбирали против неомицина (G418) в концентрации 1 мг / мл (Corning Cellgro, Manassas, VA). Клоны, устойчивые к G418, отбирали с использованием цилиндров для клонирования (Millipore, Temecula, CA) и тестировали на интенсивность флуоресценции и уровни экспрессии белка.
Стабильный клон с наивысшими уровнями экспрессии зонда CFP-линкер-YFP, обозначенный как MB231_CFP-YFP, использовали в следующих анализах. Клетки поддерживали в среде DMEM / F-12 50/50 с добавлением 5% FBS, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0,4 мг / мл сульфата G418. Родительские клетки MB231 культивировали в той же среде без добавления сульфата G418. И рекомбинантный человеческий TRAIL (rhTRAIL, № по каталогу 375-TEC), и агонистическое моноклональное антитело (№ по каталогу MAB631), специфичное к рецептору смерти 5, были приобретены в R&D systems (Миннеаполис, Миннесота).RhTRAIL существует как гомотример, где каждый мономер состоит из аминокислот 114–281 нативного внеклеточного домена TRAIL человека. Стауроспорин был приобретен у ApexBio (Бостон, Массачусетс). Камптотецин и этопозид были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури). 5-ФУ был приобретен у Enzo Life Sciences (Фармингдейл, Нью-Йорк). Компактин был приобретен в Санта-Круз (Даллас, Техас). Таксол был приобретен у Calbiochem (Ла Хойя, Калифорния).
Анализ жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток определяли с помощью колориметрического анализа 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ), как описано ранее [20].Вкратце, 1,0–2,0 × 10 4 клеток высевали в каждую лунку 96-луночного микропланшета. Затем клетки обрабатывали цитотоксическим агентом. После обработки лекарственным средством среду для культивирования клеток аспирировали, затем в каждую лунку добавляли МТТ (2 мг / мл в буфере PBS) и инкубировали в течение 2 ч при 37 ° C. Затем супернатант аспирировали и нерастворимый формазан растворяли в ДМСО. Поглощение при окрашивании формазаном измеряли при 562 нм с использованием микропланшетного ридера SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния).Относительную OD 562 для каждой лунки наносили на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях. Значения EC 50 были определены путем подгонки кривой доза-ответ к уравнению 1, Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * HillSlope)), с использованием призмы GraphPad.
программное обеспечение. X — это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y — измеренное значение оптической плотности. Каждая точка данных была повторена в трех экземплярах.
Проточная цитометрия
3.0 × 10 5 клеток культивировали в каждой лунке 6-луночного планшета. Клетки обрабатывали TRAIL или антителом против DR5. Затем клетки собирали, окрашивали аннексином-V-APC (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) и йодидом пропидия (PI, Сент-Луис, Миссури) и анализировали с использованием проточного цитометра BD Accuri C6 (BD, Franklin Lakes, NJ) [ 21].
Иммуноблот-анализ
Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [19]. Вкратце, клетки лизировали с использованием буфера RIPA [0,5 М трис-HCl (pH 7.4), 1,5 М NaCl, 2,5% дезоксихолевой кислоты, 10% NP-40, 10 мМ ЭДТА и коктейль ингибиторов протеазы] (EMD Millipore, Дармштадт, Германия). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием и определяли общее количество белка с помощью анализа BCA (Pierce, Rockford, IL).
Равное количество белка (30 мкг) разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием NuPAGE 4–12% градиентных гелей Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) и переносили на мембраны PVDF. Антитела, специфичные к CFP и YFP, были от Covance (Гейтерсбург, Мэриленд), антитела, специфичные к каспазе 8 и каспазе 3, были от Cell Signaling (Данверс, Массачусетс), а антитела, специфичные к актину, были от Санта-Крус (Даллас, Техас).В качестве вторичных антител использовали конъюгированные с пероксидазой антимышиные, антикроличьи или козьи антитела IgG. Обнаружение иммуноблота визуализировали с помощью Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) и системы камеры LAS-4000 CCD (Fujifilm, Эдисон, Нью-Джерси).
Анализ цитотоксичности FRET на основе клеток
1,8–5,4 × 10 4 клеток MB231_CFP-YFP культивировали в каждой лунке черного 96-луночного микропланшета. После того, как клетки выращивали в течение ночи, среду для культивирования клеток аспирировали и буфер PBS, содержащий цитотоксический агент (TRAIL, антитело против DR5 или стауроспорин), добавляли к прикрепленным клеткам на указанные временные точки.
Из-за необходимости более длительного периода инкубации для обработки камптотецином клетки обрабатывали средой DMEM, содержащей цитотоксическое лекарственное средство, в течение 48 часов перед заменой среды буфером PBS и продолжением инкубации в течение дополнительных 24 часов. Эту процедуру также проводили для этопозида, компактина, 5-ФУ и таксола. После лекарственной обработки сигнал FRET каждого образца определяли с использованием флуоресцентного планшет-ридера FluoDia T70 (PTI, Эдисон, Нью-Джерси). Обработанные клетки возбуждали с помощью фильтра возбуждения 425 ± 10 нм.Для определения FRET после вычитания фона были рассчитаны коэффициенты испускания YFP (фильтр 530 ± 5 нм) и CFP (фильтр 486 ± 5 нм). Значения FRET нормализовали и наносили на график в зависимости от логарифмического значения концентрации цитотоксического агента в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Значения EC 50 были определены путем подбора нелинейной кривой к уравнению 2, Y = 100 / (1 + 10∧ ((LogEC 50 -X) * Hill Slope)).
X — это логарифм молярной концентрации цитотоксического агента, а Y — нормализованное значение FRET.Каждую точку данных повторяли в трех экземплярах для одного эксперимента, и каждый эксперимент повторяли независимо, по крайней мере, дважды.
Биохимическая характеристика зонда FRET
Чтобы охарактеризовать экспрессию зонда CFP-линкер-YFP, экспрессированный белок выделяли с использованием антитела против CFP / YFP. Вкратце, 1,2 × 10 6 клеток MB231_CFP-YFP собирали и лизировали в 1 мл буфера для иммунопреципитации для лизиса Пирса. 25 мкл антитела против CFP / YFP, конъюгированного с сефарозой (Abcam, Cambridge, MA), вращали с лизатом клеток без остатков в течение 3 часов при 4 ° C.После промывания буфером для лизиса связанный зонд CFP-линкер-YFP FRET элюировали 50 мМ Трис-буфером (pH 8,5), содержащим 1 М NaCl. Сразу после элюирования белок разбавляли трис-буфером до конечной концентрации NaCl 300 мМ. Чистоту белка визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим, а также с помощью анализа иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных для CFP и YFP (описанных выше).
Для анализа in vitro FRET иммуноочищенный зонд CFP-линкер-YFP FRET инкубировали с активной каспазой 3, каспазой 8 или каспазой 2 (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота) в течение 3 часов при 25 ° C в Буфер PBS, содержащий 1 мМ DTT, с использованием черных 96-луночных микропланшетов.В качестве контроля к некоторым реакциям также был добавлен Z-VAD. FRET измеряли, как описано выше.
Конфокальная микроскопия
1,5 × 10 4 клеток MB231_CFP-YFP культивировали на 4-луночных системах боросиликатного покровного стекла (Nunc, Rochester, NY) за один день до эксперимента. Клетки обрабатывали различными концентрациями TRAIL (0-25 нг / мл) в течение 2,5 ч перед визуализацией. Клетки получали с помощью линзы объектива 63x и системы конфокального микроскопа с вращающимся диском Zeiss Cell Observer (Торнвуд, Нью-Йорк) с камерой окружающей среды PECON.Эффективность FRET определялась путем регистрации сенсибилизированного излучения [22], [23]. Лазерные линии возбуждения с длиной волны 458, 514 и 458 нм использовались для донорных каналов CFP, акцепторных YFP и FRET соответственно.
Эмиссионный фильтр для CFP составлял 485/30, тогда как эмиссионный фильтр для YFP и FRET был 535/30. Дихроичный светоделитель для конфокальной сканирующей головки Yokogawa был RIFT 457/514/647 нм. После получения поправочных коэффициентов для отдельно выраженных CFP и YFP изображения клеток были получены для ячеек MB231_CFP-YFP через каналы CFP, YFP и FRET идентичным образом.Наборы данных из 9 изображений были сохранены в формате zvi для будущего количественного анализа. Программное обеспечение Zeiss Axiovision (версия 4.8.2) использовалось для измерения FRET сенсибилизированного излучения. Эффективность FRET была рассчитана на основе системы с тремя фильтрами, которая нормирована относительно интенсивностей доноров и акцепторов, что позволяет рассчитывать перекрестные помехи и проверять истинный сигнал FRET [24], [25]. Величина эффективности FRET рассчитывалась по формуле Ся [24]. Для каждого эксперимента были получены три случайно выбранных изображения.По этим изображениям была рассчитана эффективность FRET.
От двух до трех областей интереса (ROI) были помещены для соответствующей ячейки, и от десяти до пятнадцати областей интереса были подвергнуты FRET-анализу.
Результаты
Создание клеточного биосенсора FRET
клеток рака молочной железы человека MB231 стабильно трансфицировали экспрессионной плазмидой, кодирующей слитый белок CFP-линкер-YFP (MB231_CFP-YFP), где CFP действует как донор, а YFP как акцептор для резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).Линкер содержит последовательности распознавания как каспазы 3, так и каспазы 8, DEVD и IETD соответственно, которые, как ожидается, будут чувствительны к лекарствам, функционирующим через , либо внутренние, либо внешние пути апоптоза. После активации каспазы после лечения лекарственным средством линкер, соединяющий CFP и YFP, будет расщеплен и впоследствии приведет к потере клеточного сигнала FRET. Эта методология позволяет использовать мощный биосенсор FRET, служащий маркером апоптоза (рис. 1А). Клеточная линия MB231 была выбрана в качестве клеточного субстрата, поскольку было показано, что она полностью чувствительна к целому ряду цитотоксических агентов, что подразумевает функциональную целостность аппарата апоптоза [3], [18].Ожидается, что такая клеточная платформа будет полезна для анализа эффективности различных противораковых препаратов.
Рис. 1. Клеточный биосенсор FRET.
(A) Схематическое изображение анализа FRET. Зонд FRET, CFP-линкер-YFP, экспрессируется как гибридный белок, содержащий CFP и YFP, связанные через пептидную последовательность из 16 аминокислот: GSGDEVDGGIETDGSG. Линкерная область содержит последовательности распознавания каспазы 3 (DEVD) и каспазы 8 (IETD), которые могут выборочно расщепляться соответствующими ферментами при индукции внутренних и / или внешних путей апоптоза.(B) Иммуноблот-анализ зонда CFP-линкер-YFP FRET, стабильно экспрессируемого в клетках MB231. (C) Клетки, экспрессирующие зонд CFP-линкер-YFP FRET, продуцировали значительный и стабильный сигнал FRET, клетки инкубировали в буфере PBS в течение 0-24 часов.
(D) Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали иммуноочисткой из клеточного лизата MB231_CFP-YFP и визуализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (вверху) или с помощью анализа иммуноблоттинга (внизу). (E) Изменения FRET отслеживали, когда 100 нМ очищенного белка CFP-линкер-YFP инкубировали со 100 нМ рекомбинантной активной каспазой 3 (C3), каспазой 8 (C8) или каспазой 2 (C2) в течение 3 часов.Значения p определяли с использованием t-критерия Стьюдента.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g001
Сначала мы подтвердили экспрессию зонда CFP-линкер-YFP FRET с помощью анализа иммуноблоттинга, используя первичное антитело, которое распознает CFP и YFP. Сильная полоса, специфичная для интактного белка CFP-линкер-YFP (ожидаемая молекулярная масса 55 кДа), наблюдалась в лизате клеток MB231_CFP-YFP, но не в родительских клетках (рис. 1В). Затем мы определили, могут ли ячейки MB231_CFP-YFP обеспечивать приемлемый сигнал FRET.Чтобы исключить вывод из компонентов среды, среду для культивирования клеток аспирировали из клеток MB231_CFP-YFP, прикрепленных к 96-луночным микропланшетам.
Буфер PBS был добавлен в каждую лунку, и сигнал FRET был рассчитан, взяв соотношение между эмиссией флуоресценции акцептора (530 ± 5 нм) и эмиссией флуоресценции донора (486 ± 5 нм), когда образцы возбуждали при 425 ± 10 нм с использованием флуоресценции. планшетный ридер. Действительно, в этих условиях значительный сигнал FRET был обнаружен для клеток MB231_CFP-YFP (рис. 1C).Примечательно, что зонд FRET оказался стабильным в клетках, погруженных в буфер PBS, на срок до 24 часов (рис. 1C). В качестве контроля параллельно анализировали нетрансфицированные родительские клетки MB231, которые не давали какого-либо значимого сигнала флуоресценции выше фонового шума при возбуждении на длине волны 425 ± 10 нм.
Иммунопреципитацию зонда CFP-линкер-YFP FRET проводили для подтверждения его селективности в отношении расщепления каспазой 3 и каспазой 8. Зонд CFP-линкер-YFP FRET очищали от клеточного лизата с использованием антитела против CFP / YFP, конъюгированного с шариками сефарозы.Связанный зонд FRET элюировали трис-буфером, содержащим 1 М NaCl.
Изолированный зонд FRET был охарактеризован с помощью SDS-PAGE с окрашиванием кумасси синим (рис. 1D, вверху) и иммуноблот-анализом (рис. 1D, внизу). Для оценки специфичности каспазы очищенный зонд FRET инкубировали с рекомбинантными формами активной каспазы 3, каспазы 8 или каспазы 2. Изменения FRET отслеживали (рис. 1 E). Как и ожидалось, расщепление зонда FRET было специфичным для каспазы 3 и каспазы 8 и приводило к выраженному снижению сигнала FRET.Соответственно, расщепление зонда FRET полностью прекратилось, когда реакционную смесь инкубировали с ингибитором панкаспазы (Z-VAD). Напротив, при инкубации зонда CFP-линкер-YFP FRET с каспазой 2 практически не было обнаружено расщепление зонда FRET.
Квалификация биосенсора FRET для использования в тестировании активности для лечения рака, направленного на рецепторы смерти
С помощью стабильно трансфицированного зонда FRET мы сначала проверили его пригодность для измерения эффективности класса белков, которые индуцируют апоптоз, воздействуя на рецепторы смерти (DR).
К ним относятся рекомбинантный человеческий TNF-связанный лиганд, индуцирующий апоптоз (TRAIL), и агонистические антитела к DR5, которые находятся в стадии разработки в многочисленных клинических испытаниях для лечения рака. Эти продукты действуют через DR4 и / или DR5, экспрессируемые на поверхности клеток-мишеней. После активации внутриклеточный домен смерти способствует сборке прокаспазы 8/10 и адапторного белка FADD в индуцирующий смерть сигнальный комплекс (DISC), что приводит к последовательной активации каспазы 8 и каспазы 3.Таким образом, эти агенты служат отличными зондами для тестирования сконструированного биосенсора FRET. Как ранее было показано для родительских клеток MB231 [18], клетки MB231_CFP-YFP сохраняли аналогичную чувствительность к TRAIL и антителам против DR5. Это было впервые продемонстрировано анализами жизнеспособности клеток на основе МТТ, когда клетки обрабатывали возрастающими концентрациями TRAIL или антитела против DR5. Аналогичная кривая доза-ответ и значение EC 50 были получены как для клеток parental_MB231, так и для клеток MB231_CFP-YFP при обработке TRAIL или антителом против DR5 (фиг.
2A и таблица 1).При анализе индукции апоптоза обе клеточные линии показали аналогичное дозозависимое увеличение апоптозных клеток после обработки TRAIL или антителом против DR5 (рис. 2В). Эти данные показывают, что трансфекция биосенсора FRET не влияла на клеточный ответ на терапию, направленную на DR. Стабильная линия клеток MB231_CFP-YFP, по-видимому, сохраняет интактный аппарат апоптоза, что поддерживает ее использование в качестве клеточного субстрата для тестирования цитотоксичности противораковых препаратов.
Рис. 2. Клетки MB231_CFP-YFP сохраняют чувствительность к TRAIL и антителам против DR5.
(A) Родительские клетки MB231 (закрашенные черным) и MB231_CFP-YFP (открытые прозрачные) обрабатывали TRAIL (0–100 нг / мл) в течение 2,5 ч или антителом против DR5 (0–200 мкг / мл) в течение 20 часов. ч при указанных концентрациях. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-анализа. (B) Клетки обрабатывали, как в A, и анализировали на апоптоз проточной цитометрией после окрашивания аннексином-V-APC и йодидом пропидия (PI). p-значения были определены с использованием t-критерия Стьюдента. Значения EC 50 были определены с использованием аппроксимации нелинейной кривой, как описано в разделе «Материалы и методы».Для каждого значения EC 50 95% доверительные интервалы, отражающие статистическую точность, представлены в таблице 1.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g002
Затем мы оценили расщепление зонда FRET в ответ на лечение TRAIL или антителом против DR5. С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали TRAIL и антителом против DR5. Иммуноблот-анализ выявил корреляцию между активацией каспазы и расщеплением зонда CFP-линкер-YFP FRET при всех уровнях доз (рис. 3A и 3B).
Рисунок 3. Расщепление зонда FRET указывает на активацию каспазы.
Клетки обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов или (B) 0–50 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. Полученные клетки анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител, специфичных к каспазе 3 (C3), каспазе 8 (C8) и CFP / YFP.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g003
Для измерения FRET клетки MB231_CFP-YFP культивировали в 96-луночных планшетах в течение ночи в среде DMEM.Среду для культивирования клеток удаляли и буфер PBS, содержащий различные концентрации TRAIL или антитела против DR5, добавляли к прикрепленным клеткам на 2,5 часа и 20 часов соответственно. В указанные моменты времени сигналы FRET были непосредственно измерены на отдельных образцах с настройкой возбуждения 425 ± 10 нм и настройкой излучения 530 ± 5 нм для YFP и 486 ± 5 нм для CFP с использованием флуоресцентного ридера для планшетов. Дозозависимое снижение FRET было идентифицировано с увеличением концентрации TRAIL и антител против DR5 (фиг. 4A и 4B).Значения FRET были нормализованы и нанесены на график в зависимости от логарифмического значения TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (рис. 4A и 4B), что дало значения EC 50 после подгонки нелинейной кривой к уравнению 2 (таблица 1). Примечательно, что анализ FRET дал значения EC 50 , которые согласуются со значениями из обычных анализов (MTT, проточная цитометрия и анализ иммуноблоттинга). В совокупности эти данные подтверждают использование клеточного анализа FRET для анализа биологической активности терапии, нацеленной на DR.Конфокальная микроскопия также использовалась для оценки изменения клеточного FRET, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались TRAIL (рис. 4C). Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL с настройкой возбуждения = 458 нм.
Рис. 4. Клеточный биосенсор FRET обеспечивает поддающийся количественной оценке ответ на лечение рака, нацеленного на рецепторы смерти.
Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали (A) 0–300 нг / мл TRAIL для 2.5 часов и (B) 0–100 мкг / мл антитела против DR5 в течение 20 часов. FRET был рассчитан и представлен в виде гистограмм в левой части панели.
Значения ЕС 50 определяли путем подгонки нелинейной кривой к нормированным значениям FRET, построенным против логарифмических значений TRAIL и концентрации антител против DR5 в молях (правая часть панели). (C) Изображения конфокальной микроскопии, показывающие изменения FRET в клетках MB231_CFP-YFP, обработанных 0-25 нг / мл TRAIL в течение 2,5 часов. Выраженный сдвиг от эмиссии акцептора YFP (желтый) к эмиссии донора CFP (голубой) можно наблюдать для клеток, обработанных увеличивающейся концентрацией TRAIL, с настройкой возбуждения = 458 нм.Статистический анализ проводился как на рис. 1 и 2.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g004
Применение клеточного FRET-анализа для оценки биологической активности химиотерапевтических средств против рака
Мы спросили, может ли сконструированный зонд FRET быть адаптирован для анализа низкомолекулярных лекарств, которые функционируют посредством модуляции внутренних сигнальных путей апоптоза.
К этой категории относятся многие классические химиотерапевтические препараты. Сначала мы протестировали стауроспорин и камптотецин, поскольку оба они известны как мощные индукторы апоптоза в различных типах клеток [7], [26].С этой целью клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали стауроспорином или камптотецином. Дозозависимое снижение FRET наблюдалось при увеличении концентрации каждого отдельного агента (рис. 5А). Аппроксимация нелинейной кривой дала значения EC 50 , которые, в частности, сравнимы со значениями, полученными с помощью МТТ-анализа (рисунок 5B, таблица 1). Мы расширили исследование, включив в него несколько других химиотерапевтических препаратов, включая этопозид, компактин, 5-ФУ и таксол. Эти препараты действуют через генотоксический и цитоскелетный стресс и приводят к последующему подавлению роста и / или апоптотической гибели клеток, в зависимости от условий эксперимента и целевых клеток [5] — [7].Соответственно, наблюдаемые изменения сигнала FRET были идентифицированы, когда клетки MB231_CFP-YFP обрабатывались каждым химиотерапевтическим агентом (рис.
5C). Однако их способность индуцировать апоптоз, зависящий от каспазы 3/8, оказалась намного ниже, чем у TRAIL или антител против DR5, что требует как высокой концентрации (100 мкг / мл), так и более длительных периодов инкубации (72 часа) по сравнению с эффективностью. TRAIL (EC50 ∼0,05–0,08 нМ) и анти-DR5 (EC50 ∼0,24–0,80 нМ). Эти данные демонстрируют способность клеточного зонда FRET количественно определять активность, индуцирующую апоптоз, как биологических, так и химиотерапевтических агентов.Путем точной настройки экспериментальных условий тесты FRET можно использовать для прямого сравнения биологической активности различных противораковых препаратов in vitro.
Рис. 5. FRET-анализ биоактивности химиотерапевтических агентов.
(A) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали 0–100 мкг / мл стауроспорина в течение 20 часов и 0–1,7 мкг / мл камптотецина в течение 72 часов. Дозозависимые изменения сигналов FRET определяли, как показано на рис. 4. (B) МТТ-анализ использовали для оценки жизнеспособности клеток в ответ на обработку клеток parental_MB231 (закрашено черным цветом) и MB231_CFP-YFP (открытое прозрачное) 0-25 мкг. / мл стауроспорина в течение 20 ч и 0–7.7 мкг / мл камптотецина в течение 72 ч соответственно. (C) Клетки MB231_CFP-YFP обрабатывали химиотерапевтическими агентами (100 мкг / мл) в течение 72 часов. Измерение и анализ FRET выполняли, как показано на рис. 4. Статистический анализ выполняли, как на рис. 1 и 2.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107010.g005
Обсуждение
Мы разработали клеточный биосенсор FRET для измерения активности препаратов, вызывающих апоптоз. Наш анализ FRET, по-видимому, превосходит другие обычно используемые анализы апоптоза, учитывая его простоту, стабильность, удобство и надежность.Мы ожидаем, что с учетом этих преимуществ, стабильно экспрессируемый зонд FRET может быть адаптирован для использования в будущих исследованиях по открытию и разработке соответствующих лекарств.
Целью лечения рака является уничтожение раковых клеток. Следовательно, анализ активности должен быть разработан таким образом, чтобы отразить механизм действия лекарственного средства, то есть индуцировать апоптоз или другие формы гибели клеток.
Апоптоз — распространенная форма гибели клеток, связанная с лечением рака как in vitro , так и in vivo . Для обнаружения и измерения апоптоза доступно несколько методов, включая проточную цитометрию, микроскопию, иммуноблоттинг и анализы на основе каспазных субстратов [14], [27] — [29].Эти методологии являются мощными исследовательскими инструментами при изучении апоптоза, но каждый метод связан с присущими ему ограничениями, включая, помимо прочего, невозможность оптимизации с высокой пропускной способностью, изменчивость, связанную с проницаемостью клеток материалов, необходимых для сигнала считывания, требованием клетки лизис и высокий фоновый шум [17]. Из-за этих ограничений все еще существует потребность в стандартном и надежном анализе апоптоза. Хотя несколько групп сообщили о клеточной экспрессии слитого белка на основе GFP, который может действовать как субстрат каспазы и обнаруживать изменения в клеточном FRET при индукции апоптоза, методы обнаружения в этих случаях в первую очередь полагались на конфокальную микроскопию и проточную цитометрию [15], [15] [ 30] — [33].
Предоставляя ценную информацию, эта рабочая процедура не идеальна для надежного и высокопроизводительного анализа активности. Примечательно, что есть редкие сообщения, в которых используется формат планшетов с пропускной способностью [34], [35]. Наш клеточный FRET-анализ позволяет беспрецедентно определять активность каспазы 3 и каспазы 8 в формате микропланшета с использованием линии клеток рака груди человека. Эта комбинация каспаз позволяет охарактеризовать любой агент, который может индуцировать апоптоз внутренним или внешним путем, или обоими способами.Кроме того, наша методология была специально адаптирована для устранения фоновой автофлуоресценции, связанной со средой для культивирования клеток; это помогает достичь улучшенного отношения сигнал / шум и позволяет избежать сильного вычитания фона, что может усложнить вычисления FRET. Кроме того, наша работа строго сосредоточена на пригодности описанного анализа для функционирования в качестве теста на эффективность сложных белковых препаратов, нацеленных на рецепторы смерти, в то время как другие работы в основном сосредоточены на открытии низкомолекулярных лекарств.
Одно из ограничений нашего анализа связано с доступностью молекулярных мишеней в клетках MDA-MB-231 для конкретной молекулы лекарственного средства. Например, известно, что клетки MDA-MB-231 обладают недостаточной экспрессией рецептора Her2, что делает анализ непригодным для оценки моноклональных антител против HER2, одобренных для использования при лечении рака груди. Этот недостаток, однако, можно легко устранить либо путем экспрессии зонда CFP-YFP FRET в HER2-положительной линии клеток, либо путем трансфекции HER2 в линию клеток MB231_CFP-YFP.В принципе, стабильные клетки MB231_CFP-YFP могут служить в качестве матрицы, которая может быть сконструирована для экспрессии молекулярной мишени (мишеней) для конкретного лекарственного средства. Кроме того, зонд CFP-YFP FRET может быть включен в другие линии раковых клеток для тестирования соответствующих интересующих лекарств. Следует также отметить, что описанный зонд FRET не подходит для лекарств, которые убивают раковые клетки посредством независимых от каспаз механизмов, или лекарств, убивающих клетки посредством активации каспаз, отличных от каспазы 3 или 8, таких как апоптоз или некроптоз, опосредованный каспазой 2.
Тем не менее, анализ FRET, описанный в этой работе, позволяет осуществлять одноэтапное обнаружение и измерение апоптоза для обработанных клеток, что делает его привлекательным подходом к быстрому и надежному анализу эффективности противораковых препаратов или лекарств-кандидатов, которые вызывают каспазозависимый апоптоз. Важно отметить, что платформа на основе FRET также позволяет различать препараты, вызывающие гибель клеток, и препараты, вызывающие ингибирование роста, что, в свою очередь, может определять выбор комбинированной терапии для лучшего результата лечения рака.
Благодарности
Мы благодарим докторов наук. Эми Розенберг и Серж Бокаж за критическое прочтение рукописи. Отказ от ответственности: комментарии и обсуждения в этой статье основаны на наших экспериментальных данных и обзоре соответствующих научных публикаций. Они не обязательно отражают официальную точку зрения Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в отношении анализов активности для использования при оценке онкологических лекарственных препаратов.
Вклад авторов
Эксперименты задуманы и спланированы: БЖ.Проведены эксперименты: WB XD KT SP. Проанализированы данные: WB XD KT LR. Участвовал в написании рукописи: BZ WB XD LR.
Ссылки
- 1. Waldman SA (2002) Предсказывает ли потенция клиническую эффективность? Иллюстрация через антигистаминную модель. Ann Allergy Asthma Immunol 89: 7–11 S1081-1206 (10) 61904-7 [pii]; 10.1016 / S1081-1206 (10) 61904-7 [doi].
- 2. Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ и др. (1988) Возможность скрининга лекарств с панелями линий опухолевых клеток человека с использованием анализа тетразолия в микрокультурах.Cancer Res 48: 589–601.
- 3. Shoemaker RH (2006) Скрининг противоопухолевых препаратов линии опухолевых клеток человека NCI60. Nat Rev Cancer 6: 813–823 nrc1951 [pii]; 10.1038 / nrc1951 [doi].
- 4.
Кремер Дж., Галлуцци Л., Ванденабил П., Абрамс Дж., Алнемри Е.С. и др. (2009) Классификация клеточной смерти: рекомендации Номенклатурного комитета по клеточной смерти 2009. Cell Death Differ 16: 3–11 cdd2008150 [pii]; 10.1038 / cdd.2008.150 [doi].
- 5. Хагг М., Бивен К., Уэно Т., Ридлендер Л., Бьорклунд П. и др.(2002) Новый тест с высокой пропускной способностью для скрининга проапоптотических препаратов. Инвестируйте новые лекарства 20: 253–259.
- 6. Ли Y, Yu J, DU D, Fu S, Chen Y и др. (2013) Участие посттранскрипционной регуляции FOXO1 с помощью HuR в 5-FU-индуцированном апоптозе в клетках рака молочной железы. Oncol Lett 6: 156–160 10.3892 / ol.2013.1352 [doi]; ol-06-01-0156 [pii].
- 7. Степчинска А., Лаубер К., Энгельс И.Х., Янссен О., Кабелиц Д. и др. (2001) Стауроспорин и обычные противоопухолевые препараты вызывают перекрывающиеся, но разные пути апоптоза и активации каспаз.Онкоген 20: 1193–1202 10.1038 / sj.onc.1204221 [doi].
- 8.
Абдулгани Дж., Эль-Дейри В.С. (2010) Передача сигналов рецептора TRAIL и терапия. Мнение эксперта Ther Targets 14: 1091–1108 10.1517 / 14728222.2010.519701.
- 9. Zhou L, Wang W, Dicker DT, Humphreys RC, El-Deiry WS (2011) Прогнозирование проапоптотического противоракового терапевтического ответа in vivo на основе визуализации клеточной смерти и взаимодействия лиганд-рецептор смерти TRAIL. Cancer Biol Ther 12 335–348: 17174.
- 10.Walczak H (2013) Системы рецептор-лиганд смерти при раке, гибели клеток и воспалении. Колд-Спринг-Харб Perspect Biol 5: a008698 5/5 / a008698; 10.1101 / cshperspect.a008698.
- 11. Джонстон Р.В., Фрю А.Дж., Смит М.Дж. (2008) Путь апоптоза TRAIL в возникновении, прогрессировании и терапии рака. Nat Rev Cancer 8: 782–798, nrc2465; 10.1038 / nrc2465.
- 12.
Smith GS, Voyer-Grant JA, Harauz G (2012) Мониторинг активности расщепленной каспазы-3 и апоптоза иммортализованных олигодендроглиальных клеток с использованием визуализации живых клеток и расщепляемых субстратов флуорогенного красителя после индуцированной калием деполяризации мембраны. J Vis Exp. 3422 [pii]; 10,3791 / 3422 [doi].
- 13. Prasuhn DE, Feltz A, Blanco-Canosa JB, Susumu K, Stewart MH, et al. (2010) Пептидные биосенсоры на квантовых точках для мониторинга протеолиза каспазы 3 и ионов кальция. ACS Nano 4: 5487–5497 10.1021 / nn1016132 [doi].
- 14. Kaufmann SH, Kottke TJ, Martins LM, Henzing AJ, Earnshaw WC (2001) Анализ активации каспаз во время апоптоза. Curr Protoc Cell Biol Глава 18: Единица. 10.1002 / 0471143030.cb1802s11 [doi].
- 15. Wu X, Simone J, Hewgill D, Siegel R, Lipsky PE, et al. (2006) Измерение активности двух каспаз одновременно в живых клетках с помощью нового двойного флуоресцентного индикаторного зонда FRET. Cytometry A 69: 477–486 10.1002 / cyto.a.20300 [doi].
- 16.
Wang ZQ, Liao J, Diwu Z (2005) N-DEVD-N’-морфолинкарбонил-родамин 110: новые флуорогенные субстраты каспазы-3 для клеточного анализа апоптоза. Bioorg Med Chem Lett 15: 2335–2338 S0960-894X (05) 00274-X [pii]; 10. 1016 / j.bmcl.2005.02.081 [doi].
- 17. Brunelle JK, Zhang B (2010) Анализы апоптоза для количественной оценки биоактивности противоопухолевых лекарственных препаратов. Обновление Drug Resist 13: 172–179 S1368-7646 (10) 00039-7 [pii]; 10.1016 / j.drup.2010.09.001 [doi].
- 18. Zhang Y, Zhang B (2008) TRAIL-резистентность клеток рака молочной железы связана с конститутивным эндоцитозом рецепторов смерти 4 и 5. Mol Cancer Res 6: 1861–1871 6/12/1861 [pii]; 10.1158 / 1541-7786.MCR -08-0313 [doi].
- 19. Zhang Y, Rivera Rosado LA, Moon SY, Zhang B (2009) Подавление D4-GDI ингибирует рост и инвазивное поведение в клетках MDA-MB-231 за счет активации Rac-зависимой передачи сигналов p38 и JNK. J Biol Chem 284: 12956-12965 M807845200 [pii]; 10.1074 / jbc.M807845200 [doi].
- 20.
Zhang B, Zhang Y, Dagher MC, Shacter E (2005) Ингибитор диссоциации Rho GDP защищает раковые клетки от апоптоза, вызванного лекарствами. Cancer Res 65: 6054–6062 65/14/6054 [pii]; 10. 1158 / 0008-5472.CAN-05-0175 [doi].
- 21. Мастерс А., Харрисон П. (2013) Подсчет тромбоцитов с помощью проточного цитометра BD Accuri C6. Тромбоциты. 10.3109 / 09537104.2013.801947 [doi].
- 22. van RJ, Langeslag M, Jalink K (2004) Корректировка конфокального сбора для оптимизации отображения резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью сенсибилизированного излучения. Biophys J 86: 2517–2529 S0006-3495 (04) 74307-6 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (04) 74307-6 [doi].
- 23. Клегг Р.М. (1996) Флуоресцентный резонансный перенос энергии.В: X.F.Wang, B.Herman, редакторы. Флуоресцентная спектроскопия и микроскопия. 179–252.
- 24. Xia Z, Liu Y (2001) Надежное и глобальное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием флуоресцентных микроскопов. Biophys J 81: 2395-2402 S0006-3495 (01) 75886-9 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (01) 75886-9 [doi].
- 25.
Gordon GW, Berry G, Liang XH, Levine B, Herman B (1998) Количественные измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии с использованием флуоресцентной микроскопии. Biophys J 74: 2702–2713 S0006-3495 (98) 77976-7 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (98) 77976-7 [doi].
- 26.
Nieves-Neira W, Pommier Y (1999) Апоптотический ответ на камптотецин и 7-гидроксистауроспорин (UCN-01) в 8 клеточных линиях рака груди человека из NCI Anticancer Drug Screen: многофакторные взаимосвязи с топоизомеразой I, протеинкиназой C, Bcl- 2, p53, MDM-2 и каспазные пути. Int J Cancer 82: 396–404 10.1002 / (SICI) 1097-0215 (199
) 82: 3 <396 :: AID-IJC13> 3.0.CO; 2-Z [pii].
- 27. Демченко А.П. (2012) Изменение клеточных мембран при апоптозе: детекция флуоресценции. Опыт Онкол 34: 263–268. 3559 [pii].
- 28. Muppidi J, Porter M, Siegel RM (2004) Измерение апоптоза и других форм гибели клеток. Curr Protoc Immunol Глава 3: Блок. 10.1002 / 0471142735.im0317s59 [doi].
- 29.
Крыско Д.В., Ванден Берге Т., Д’Херде К., Ванденабеле П. (2008) Апоптоз и некроз: обнаружение, различение и фагоцитоз.Методы 44: 205–221 S1046-2023 (08) 00002-9 [pii]; 10. 1016 / j.ymeth.2007.12.001 [doi].
- 30. He L, Wu X, Meylan F, Olson DP, Simone J и др. (2004) Мониторинг активности каспаз в живых клетках с использованием флуоресцентных белков и проточной цитометрии. Am J Pathol 164: 1901–1913 S0002-9440 (10) 63751-0 [pii]; 10.1016 / S0002-9440 (10) 63751-0 [doi].
- 31. Kawai H, Suzuki T, Kobayashi T., Sakurai H, Ohata H, et al .. (2005) Одновременное обнаружение в реальном времени активации инициатора и эффекторной каспазы с помощью анализа переноса энергии двойного флуоресцентного резонанса.J Pharmacol Sci 97: 361–368. JST.JSTAGE / jphs / FP0040592 [pii].
- 32. Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2001) Применение метода флуоресцентного резонансного переноса энергии для изучения динамики активации каспазы-3 во время УФ-индуцированного апоптоза в живых клетках HeLa. Biochem Biophys Res Commun 283: 1054-1060 10.1006 / bbrc.2001.4896 [doi]; S0006-291X (01) 94896-X [pii].
- 33.
Luo KQ, Yu VC, Pu Y, Chang DC (2003) Измерение динамики активации каспазы-8 в одной живой клетке HeLa во время апоптоза, индуцированного TNFalpha. Biochem Biophys Res. Commun. 304: 217–222. S0006291X0300559X [pii].
- 34. Jones J, Heim R, Hare E, Stack J, Pollok BA (2000) Разработка и применение внутриклеточного анализа каспазы GFP-FRET для скрининга лекарств. J Biomol Screen 5: 307–318.
- 35. Zhu X, Fu A, Luo KQ (2012) Анализ апоптоза эндотелиальных клеток на основе высокопроизводительного флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и его применение для скрининга агентов, разрушающих сосуды. Biochem Biophys Res Commun 418: 641–646 S0006-291X (12) 00100-3 [pii]; 10.1016 / j.bbrc.2012.01.066 [doi].
1016 / j.bmcl.2005.02.081 [doi].
Biophys J 74: 2702–2713 S0006-3495 (98) 77976-7 [pii]; 10.1016 / S0006-3495 (98) 77976-7 [doi].
1016 / j.ymeth.2007.12.001 [doi].(PDF) Резонансный перенос энергии Форстера (FRET) с донорно-акцепторной системой, адсорбированной на серебряных или золотых наноостровках
с 300 нм (сплошная линия). Перекрытие между флуоресцентным излучением
и полосой рассеяния подложки с покрытием из серебра
отличное. Напротив, спектр покрытой золотом подложки
полностью отстроен от излучения флуорофора.
22
Следовательно, серебро представляется лучшим выбором, в то время как золото
может оказать пагубное влияние на работу соединения 1
.
Выводы
Мы изучили FRET-свойства SAM новой
ковалентно связанной донорно-акцепторной пары D – A, состоящей из
двух нафталиновых групп, действующих как доноры, и бензофуразановой группы
, действующей как акцептор и адсорбированной на Ag и Au
NIF. Спектроскопия SERS подтвердила его адсорбцию на металле
даже без какой-либо конкретной функционализации и предоставила
информацию о природе хемосорбции. Для обоих металлов
мы наблюдали хорошо разрешенный эффект FRET, характеризуемый
интенсивным сигналом флуоресценции в зеленой области спектра
, который был вдвое более интенсивным в случае НИФ Ag
.Хотя наши тесты не могут помочь дать окончательное объяснение этого результата
, тем не менее наш АСМ-анализ и спектроскопия экстинкции
показывают, что ценный вклад в
флуоресцентного излучения антенны на серебре можно отнести к резонансам рассеяния. , что согласуется с моделью излучающего плазмона
. В этом кадре мы можем заключить, что
процесс автоорганизации, используемый для создания металлических структур нано-
, более благоприятен для путей радиационного распада на
AgNIF по сравнению с AuNIF.
Такие открытия могут помочь в разработке подходящих металлических подложек
, которые эффективно преобразуют передачу энергии, которая происходит внутри молекулы
, в излучение. Перспективным применением
является разработка флуоресцентных хемосенсоров.
23
Например, предварительные испытания показали, что контакт
SAM соединения 1 на Ag с водными растворами
, содержащими следы Cu
2+
, вызывает чистое и избирательное тушение
Флюоресценция.В этом смысле будущая работа
будет сосредоточена на разработке SAM новых систем D – A, содержащих
групп D, поглощающих в видимой области электромагнитного спектра
, где доступны дешевые источники в виде лазерных диодов.
Возможность работы с видимыми длинами волн
также откроет путь к использованию распространения поверхностных плазмонов
на границах раздела серебро / хромофор, что представляет собой мощную
альтернативу использованию локализованных поверхностных плазмонов для эффективного усиления
финальной флуоресценции.
24
Благодарности
Финансирование от итальянского FIRB 2004 «Молекулярные соединения
и гибридные наноструктурированные материалы с резонансными и не
резонансными оптическими свойствами для фотонных устройств» (номер контракта
RBNE033KMA) и от PRIN 2007 Подтвержден договор «Металлоорганические плазмонные наноструктуры
для сенсоров» №1 2007LN873M_002
.
Список литературы
1 А. Андронов и Дж. М. Фреше
´
т, Chem.Commun., 2000, 1701;
F. V. R. Neuwahl, R. Righini, A. Andronov, P. R. Malenfant и
J. M. Freche
´
t, J.
Phys. Chem. В, 2001, 105, 1307; A. Bar-Haim,
J. Klafter и R. Kopelman, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119,
6197; A. W. Freeman, S. C. Koene, P. R. L. Malenfant,
M. E. Thompson и J. M. Freche
´
t, J. Am. Chem. Soc., 2000,
,, 122, 12385; В. Бальзани, П. Черони, М. Маэстри, К.Саудан и
В. Вичинелли, верх. Curr. Chem., 2003, 288, 159; V. Balzani,
P. Ceroni, M. Maestri и V. Vicinelli, Curr. Opin. Chem. Биол.,
2003, 7, 657; D. W. Brousmiche, J. M. Serin, J. M. J. Fre
´
chet,
G. S. He and R. Kannan, J. Phys. Chem. B, 2004, 108, 8592.
2 L. Basabe-Desmonts, D. N. Reinhoudt и M. Crego-Calama,
Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 993; К. Э. Сапсфорд, Л. Берти и
И.Л. Мединц, Angew. Chem., Int. Ed., 2006, 45, 4562.
3 A. B. Doust, X. Yang, T. E. Dykstra, K. Koo and G. D. Scholes,
Appl. Phys. Lett., 2006, 89, 213505.
4 PL Gentili, M. Mugnai, L. Bussotti, R. Righini, P. Foggi,
S. Cicchi, G. Ghini, S. Viviani and A. Brandi, J Photochem.
Photobiol. A: Chem., 2006, 18, 209.
5 (a) G. Calzaferri, H. Li, Proc. SPIE, 2008,7002,
700202-1–700202-7; (b) А.З. Руис, Х. Ли и Г.Calzaferri, Angew.
Chem., Int. Ed., 2006, 45, 5282; (c) Х. Спанггаард, Ф. К. Кребс,
М. Йоргенсен, Н. Розлосник, Н. Б. Ларсен и О. Хагеманн, Proc.
SPIE – Int.Soc.Opt.Eng., 2005, 5938,59380V; (d) M.Sakomura,
T. Takagi, H. Nakayama, R. Sawada и M. Fujihira, Colloids
Surf., A, 2002,198–200 769.
6 Э. Джорджетти, М. Мунис-Миранда, Г. Маргери, А. Джусти,
С. Соттини, М. Аллоизио, К. Куниберти и Г. Деллепиане, Лангмюр,
2006,
22, 1129 .
7 J. R. Lakowicz, Anal. Biochem., 2005, 337, 171.
8 M. P. Kreuzer, R. Quidant, J. P. Salvador, M. P. Marco и
G. Badenes, Anal. Биоанал. Chem., 2008, 391, 1813.
9 Н. Т. Ким, З. Розенцвейг, Anal. Chem., 2002, 74, 741624.
10 WS Rasband, ImageJ, Национальные институты здравоохранения США,
Bethesda, Мэриленд, США, http://rsb.
info.nih.gov/ij/, 1997.
11 I. Horcas, R. Ferna
´
ndez, JM Go
´
mez-Rodrı
´
guez and J.Colchero,
Rev. Sci. Instrum., 2007, 78, 13705.
12 H. Morawitz, M. R. Philpott, Phys. Ред. B: Конденс. Matter
Mater. Phys., 1974, 10, 4863.
13 Х. Беккер, С. Э. Бернс, Р. Х. Френд, Phys. Ред. B: Конденс.
Matter Mater. Phys., 1997, 56, 1893.
14 J. Zhang, Yi. Fu, J. R. Lakowicz, J. Phys. Chem. C, 2007,
111 (1), 50.
15 K. LanceKelly, E. Coronado, Lin Lin Zhao и G.C.Shatz,
J.Phys. Chem. B, 2003, 107, 668.
16 H. Heberer and H. Matschiner, J. Prakt. Chem., 1986, 328, 261.
17 A. M. Schwartzberg, C. D. Grant, A. Wolcott, C. E. Talley,
T. R. Huser, R. Bogomolni и J. Z. Zhang, J. Phys. Chem. B,
2004, 108, 19191.
18 К. Дж. Аддисон и А. Г. Броло, Langmuir, 2006, 22, 8696.
19 С. К. Гош и Т. Пал, Chem. Rev., 2007, 107, 4797.
20 A. A. Lazarides, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. В, 2000, 104, 460.
21 KH Su, QH Wei, X. Zhang, JJ Mock, DR Smith и
S. Schultz, Nano Lett., 2003, 3, 1087.
22 Y. Chen, K. Munechika и DS Ginger, Nano Lett., 2007,
7 (3), 690.
23 M. Arduini, S. Marcuz, M. Montolli, E. Rampazzo, F. Mancin,
S. Gross, L. Armelao, P. Tecilla and U. Tonellato, Langmuir, 2005,
21, 9314.
24 T. Neumann, ML Johansson, D. Kambhampati and W. Knoll,
Adv. Funct.Матер.
, 2002, 12, 575.
Рис. 8 Спектры экстинкции AgNIF с 1 покрытием (пунктирная линия),
AuNIF с покрытием 1 (штриховая линия) и флуоресцентное излучение раствора этанола
из 1 для возбуждения с 300 нм (сплошная линия).
Номер этого журнала:
c
Общества владельцев 2009 Phys.Chem.Chem.Phys., 2009, 11, 9798–9803 | 9803
Флуоресцентный резонансный перенос энергии между квантовыми точками углерода и наночастицами серебра: применение для зондирования ионов ртути
Основные моменты
- •
Флуоресцентные квантовые точки углерода (C-точки) были синтезированы с использованием лимонной кислоты и диметилглиоксима.
- •
Флуоресцентное излучение C-точек было уменьшено наночастицами Ag посредством процесса FRET.
- •
Уменьшение интенсивности флуоресценции FRET было восстановлено в присутствии иона Hg (II).
- •
Новый флуоресцентный датчик включения / выключения был сконструирован для определения следовых количеств иона Hg (II).
- •
Метод был использован для оценки содержания ионов Hg (II) в воде, промышленных сточных водах и образцах чая.
Abstract
Процесс резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в качестве практической и конкурентной стратегии зондирования был использован между квантовыми точками углерода (C-точки) и наночастицами серебра (НЧ Ag) для определения ионов ртути. Новые синтезированные C-точки с квантовым выходом 84% действовали как донор, а наночастицы Ag действовали как акцептор в процессе FRET, приводя к тушению флуоресценции C-точек.
В присутствии ионов Hg (II) подавленное FRET излучение флуоресценции системы C-точки – НЧ Ag восстанавливалось за счет окисления НЧ Ag ионами Hg (II), так что интенсивность флуоресценции при включении непосредственно определялась. пропорциональна концентрации ионов Hg (II).Соответственно, комбинация системы FRET с окислительно-восстановительной реакцией была впервые использована для создания инновационного флуоресцентного датчика выключения / включения для количественного определения иона Hg (II). Градуировочный график был линейным в диапазоне концентраций 0,5–500,0 нмоль л –1 с коэффициентом детерминации ( R 2 ) 0,9965. Предел обнаружения и предел количественного определения составляли 0,10 и 0,35 нмоль л -1 , соответственно, согласно определению IUPAC.Этот метод применялся для определения иона Hg (II) в озерной воде, сточных водах и образцах чая, и для образцов с добавками были получены соответствующие относительные извлечения (98,0–104,0%). Этот метод имеет высокий потенциал для диагностики следовых количеств ионов ртути в реальных образцах с высокой чувствительностью и воспроизводимостью.
Ключевые слова
Ион ртути
Квантовые точки углерода
Наночастицы серебра
Флуоресцентный резонансный перенос энергии
Редокс-реакция
Флуоресцентный датчик
Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)
Просмотреть полный текст© 2020 Elsevier B.V. Все права защищены.
Рекомендуемые статьи
Цитирующие статьи
Все тексты, перечисленные на
эта страница соответствует рекомендациям, изложенным в
3-е издание Писца Среднего царства
Справочник. Моя цель предложить как минимум два
версии текста прокрутки для каждой награды, но это
трудоемкий проект, так что терпите меня.
Если у вас есть уникальный текст, который вы хотели бы
поделитесь и добавили сюда, не стесняйтесь отправить его по электронной почте Бесс @ denevell. com.
Индекс наград ПоднебеснойОружейная награда , неизвестное устройство — из 3 rd издания Писец Справочник стр. 27 Провозгласить на всем протяжении
царство, которое мы <имя государя>, король <королева> Поднебесной, и Воистину Мы <король и королевы name> Regnum Mediterranae уважаем его / ее <причина награждения> наградить <получатели name> Оружейная награда. Дано нашими руками это <день> из <месяца> А.С. <год> в нашем <месте дано>. Оружейная награда , титул, именной герб & эмблема Bess Да будет известно всем
добрые джентльмены во всем нашем королевстве, которых Мы <имя
государь> король <королева> по праву герба
Поднебесной и Вернуться к началу Королевский Аугментация оружия — с 3-го рд издание Scribal Handbook стр. 27 Провозгласим всей земле, что <имя
государя> Король, <королева> по праву герба
Поднебесной и <имя супруги>, наша королева <король>, были свидетелями службы, с которой <имя
получателя> проиллюстрировал идеалы, которые мы
стремимся отстаивать, и поэтому мы хотим
признать его / ее подходящим и приличным образом
с некоторым видимым знаком нашего уважения.Мы
хочет дать ему / ей Королевское увеличение
Оружие в знак признания его деяний. Это будет
конкретное обвинение, означающее нашу признательность и
поощрение в соответствии с обоими его / ее пожеланиями
и Правилами Коллегии вооружений
Knowne World. Совершено нашими руками <дата> день <месяц>, Anno Societatis <год>, в нашем <местонахождении
событие>. К началу Kingdom Augmentation of Arms — из 3 rd издание Scribal Handbook стр. 27 ** В связи с особым характером этой награды офис Dragon Herald предпочитает писца получить конкретную формулировку от их величеств на время переуступки ** Формулировка Kingdom Augmentation of Arms, используемая для Мастер Дафидд Блейд (просмотреть прокрутить здесь) Знаем все, что мы, Вальхарик и Алис, король и
Королева Поднебесной настоящим заявляет, что
Дафид Блейд отдал свое сердце и душу
через его долгое и преданное служение Нашему царству.
Он отдал свое время, свою энергию и части
своей личной жизни, чтобы обеспечить всех граждан
MidRealm с электронным информационным сайтом.
За его самоотверженное создание, поддержку и
предоставление этого сайта, различных списков и ссылок,
и испытания и невзгоды, связанные с
усилия такого масштаба, хотим ли мы
признать его видимым знаком нашего уважения
и признательность всего Королевства. К началу Заказать Королевского Авангарда — из 3 ряд издание Scribal Handbook стр.27 Пусть все люди в нашем Царстве услышат
провозглашение, что мы <имя государя> король <королева> по праву оружия Поднебесной, и <имя супруги>, — изложила наша королева <король>. Знать
что с учетом его / ее выдающихся
услуги в качестве чемпиона наших королей / королевы настоящим
сделать <имя получателя> Сподвижником нашего Ордена
Королевский авангард.Мы отдаем ему / ей все
права и обязанности, связанные с этим
Орден и право ношения нагрудного знака Ордена:
Бесполевой, безудержный серебряный полудракон. Сделано
наши руки в этот <дата> день <месяца>, Anno
Societatis <год> in out <место происшествия>. К началу Премия Сапфир — из 3 выпуска rd Писец Справочник стр.27 Провозгласить всему нашему Царству, что мы <имя государь>, король <королева> по праву герба Поднебесной, и <имя супруга>, наш Королева <король>, передай сердечный привет. Знай, что это одно из удовольствий короны узнавать люди, которые проявляют большую вежливость, грацию и честь людям всех рангов, и которые служат примером это значит быть воплощением Мечты. Таким образом, мы намерены сделать <имя получателя> Награда Сапфир. Мы дарим на нем / ней все права и обязанности связаны с Сапфиром и правом обнажать значок: Fieldless — лазурный драгоценный камень ступенчатой огранки. Совершено нашими руками <дата> день <месяца> А.С. <год> в нашем <месте проведения мероприятия>. Награда Sapphire — от Bess Все добрые дворяне и дворяне знают
Срединное царство, которое мы <имя государя> и <имя
консорта> Regnum Mediterranae, пришлите вам наши
самые сердечные приветствия. К началу Премия Сокровища Дракона — из бывшего печатка сайт Кому эти
подарки приходят знать, что Мы, <<Король>>, Король по праву
оружия, и < К началу Премия Дубинка — предоставлена леди Айкико Кэтрин О’Брайен из справочника писцов Всем, кому достаются эти подарки, известно, что мы
(имя Государя), Король (Королева) по праву руки
Поднебесной и (имя Консорта), наша
Королева (король) передает привет.Как известно на
сокровище королевства лежит в К началу Присуждение Серебряный желудь — Бесс Да будет известно, что королева <имя королевы>, покровительница
искусств и наук и К началу Премия Роща — с бывшего сайта печатей Да будет известно, что королева <<Имя>>, покровительница
Искусство и Науки и Король <<Имя>> хорошо осведомлены
об усилиях и успехах народа << Название группы >> в художественном и / или научном
зона << Художественная / научная зона >>. К началу Премия Полета Дракона — из бывшей печатки сайт Объявите всем, что Мы, <<Король>>, Король
право оружия Поднебесной, и <<Королева>>,
Наша королева любви и красоты, желаю воздать должное
превосходные навыки и услуги << Название группы >>
Корпус Лучников Поднебесной.Мы настроены на
наградить их наградой полета дракона,
со всеми правами и обязанностями, связанными с
это звание и право ношения нагрудного знака: Серебряный,
бледный, чешуйчатый, серебристый, между четырьмя феонами,
без позволения и препятствий со стороны любого человека. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, A. К началу Присуждение Зубы Дракона — с бывшего веб-сайта с печаткой Знай по этим подаркам, что Мы, <Король>, Король,
право оружия Поднебесной, и <<Королева>>,
Наша королева любви и красоты, правильно помнящая
драматические поступки и навыки, которыми обладает << Название группы >>
отображается на поле боя, особенно << Конкретные дела >>, помните, чтобы дать им
Награда Зуба Дракона.Мы даем им
все права и обязанности, связанные с этим
награды и право ношения нагрудного знака: Argent, на
танец между двумя сломанными зубами дракона и другой
серебристый, без позволения и препятствий со стороны какого-либо человека.
Совершено в < К началу Присуждение Purple Fretty — из бывшей печатки сайт Да будет известно, что Мы, <<Король>>, Король по праву
герб Среднего царства и < К началу Орден Розы — с бывшего сайта печатки «Провозгласите всем кротким и знатным, что Мы, < К началу Заказать White Chamfron — из бывшей печатки сайт Пусть знают, что Мы, << Имя Правителя >> сильные
и просто, и << Имя супруги >> изящное и
мудрый, Regnum Mediterranae, видел умение,
преданность и поддержка, которые < К началу Заказать Кавендишского узла — из бывшей печатки сайт Пусть знают, что Мы, << Имя Правителя >> сильные
и просто, и << Имя супруги >> изящное и
мудрый, Regnum Mediterranae, видел умение,
преданность и поддержка, которые < К началу Заказ Барб Дракона — из бывшей печатки сайт Вся знать, знайте по этим подаркам, что Мы, < К началу Заказ the Red Company — с бывшего веб-сайта с печаткой Во всех армиях в истории было много
воинов, которые сражались и вели изнутри
чины, поднявшись до почетных должностей. Воин
обладает многими достоинствами, такими как умение обращаться с оружием, лидерство
на поле и обучение боевым искусствам.
Поэтому Мы, <<Король>> и <<Королева>>, Король и
Королева Среднего Царства настоящим признает <<Имя>>
как член Ордена Красной Компании.Он / Она может
назвал себя Сержантом этого благородного
ордена, и может иметь свой значок: Gules, две булавы в
saltire Argent, в кантоне на его / ее щите. Сделанный
this < К началу Заказ Зуб Дракона — из бывшей печатки сайт Всем и единственным, кому эти подарки
Приди, знай, что Мы, <<Король>>, Король по праву оружия
Поднебесной и <<Королева>>, наша королева
любовь и красота, помня о драматических деяниях
и навыки, которые < К началу Присуждение The Doe’s Grace — с бывшего веб-сайта с печаткой Смотрите, читайте, слушайте и поймите эти подарки
что Мы, Королева Поднебесной, и <<Король>> Наш король, помня о высоком уважении
в котором < Мы поем на просторах этого
славный MidRealm милосердие и красота, которые
дана жизнь словами нашей королевы <королевы
имя> и <имя короля> ее король. Хорошо зная
широко распространенное восхищение, в котором <имя получателя> удерживаемых населением и нами и в
подтверждение <указанная причина> рады
покажите ему / ей этот знак благосклонности Королевы
Награда Лани Милости.Со всем сопутствующим
такая честь дается право ношения нагрудного знака:
Лазурный, собственно меч, украшенный венком из цветов.
серебристый, поскользнулся и оставил Или, не давая или
помеха со стороны любого человека. Сделано в < К началу Присуждение Королевская чаша — из бывшей печатки сайт Смотрите, читайте, слушайте и поймите эти подарки
что Мы, <<Король>> Король Среднего Царства, и <<Королева>> Наша королева, помня о высоком
уважение, которым < К началу Присуждение Purple Fret — с бывшего веб-сайта с печаткой Провозгласить повсюду
царство, которое Мы, <<Король>>, Король по праву оружия
Поднебесной и <<Королева>>, наша королева
любовь и красота, признайте образцовую службу
что <<Имя>> отдал Среднему Царству,
в частности <<Служба>>.. Мы делаем здесь публично
похвалите его / ее и прошу подарить
ему / ей Награда Purple Fret. Мы даем
его / ее все права и обязанности сопровождающего
на это звание и право носить значок: Или,
раздражение пурпурное, без препятствий ни от каких
человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей
престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего
Мы установили Свою руку и печать. К началу Орден Willow — с бывшего сайта с печаткой Всем и единственным, кому эти подарки
придет, знай, что Мы, <Королева> Королева
Поднебесной и покровительница искусств, а также < <Имя королевы> Королева Поднебесной,
Право оружия К началу Заказ Silver Oak — с бывшего сайта с печаткой Всем и единственным, кому эти подарки
придет, знай, что Мы, <Королева> Королева
Среднее царство и покровительница наук, а также < К началу Оружие для великих государственных служащих — с бывшего сайта с печаткой Объявите всем, кому эти подарки
что Мы, <<Король>>, Король по праву герб
Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в
рассмотрение отличного обслуживания, которое < К началу Грант Оружие для других — с бывшего сайта с печаткой Объявите всем, кому эти подарки
что Мы, <<Король>>, Король по праву герб
Поднебесной и <<Королева>>, Наша Королева, в
рассмотрение отличного обслуживания, которое < К началу Компания Бронзового кольца — с бывшего сайта печатки Всем и
единственное, кому эти подарки будут доставлены, знайте
что Мы, <Король> и <Королева>, король и королева
MidRealm, правильно помня о своем начальнике
навыки, лидерство и образцовое служение
Рапирные Легионы Нашего Королевства признают настоящим <<Имя>> как соратник нашей бронзовой роты
Звенеть.Совершено в < Компания Бронзового кольца — адаптирована из Текст Atlantian White Scarf от Бесс Да будет это известно всем людям к настоящему моменту
писаний, где бы их ни читали, ни слушали
или осмысленны, и особенно для всех видов
офицеры под властью наших страшных властителей, <имя> и <имя>, монархи Среднего царства,
такие как бароны, сенешал, рыцари-маршалы и
их заместители, удостоверяя им этим письмом
что это нравится нашим указанным договорам, с их
самый уважаемый советник принять <имя получателя
> в качестве Хранителя Бронзового кольца. К началу Компания Белого копья — с бывшего сайта с печаткой Как во время войны, так и в мирное время
неустрашимые наездники оттачивали свои боевые навыки в
турниры по подготовке всадника и коня к
защиты Нашего славного царства. К началу Орден Компании Гринвуд — От Заказ Сайт Во всех армиях в истории было
лучников, которые стреляли и учили изнутри
чины, поднявшись до почетных должностей.An
у лучника много достоинств, таких как умение обращаться с луком,
лидерство на линии, а также преподавание искусств и
науки о стрельбе из лука. Следовательно, Мы, <государи
имя> и <имя супруги>, король и королева
Срединное царство, настоящим признаем <имя
получатель> как член Ордена Гринвуда
Компания. К началу Орден Золотая булава — из 3 выпуска rd Писец Справочник стр. 32 Смотри, слушай и читай слова <имя
государь>, король <королева> по праву герба
Среднее Королевство и <имя супруги>, королева <король> Среднего царства.Руководство и обучение
наших воинов имеет важное значение для силы
армии, и мы стали свидетелями такого превосходства в нашей
subject <имя получателя>. Поэтому мы желаем
признать его / ее Сподвижником Нашего Ордена
Золотая Булава. Мы предоставляем ему / ей все права и
обязанности, сопутствующие этому рангу, с
право называться капитаном
Орден Красной компании.Впредь он / она может
иметь нагрудный знак Ордена, должным образом зарегистрированный в
Колледж Вестников. К началу Орден Evergreen — автор Bess Пойте хвалу и дайте знать всему необъятность царства, которое мы <имя Консорта, Королевская покровительница искусств и <имя государя> наш король, хорошо осведомлены о совершенстве и умелое обучение, осуществленное <имя получатель> в <искусство / наука / исследования> <причина для награды>.Поэтому мы хотим, чтобы все знали о с большим уважением, с которым мы относимся к нему / к ней, и поэтому мы стремятся сделать его / ее Спутником Орден Вечнозеленых растений. Мы даем ему / ей все права и обязанности, связанные с этим звание и право ношения нагрудного знака: [Без поля] A сосна бледно-пурпурная и ор. Дано нашим передает этот <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год> в нашем <месте проведения мероприятия>. К началу Заказ Сердце Дракона — из бывшей печатки сайт Вся знать, знайте по этим подаркам, что Мы, < К началу Барон (эсс) суда — с бывшей печатки Всем нежным и благородным, да будет известно всем
что Мы, <<Король>>, Король по праву герб
Поднебесной и <<Королева>>, наша королева, пошлите
приветствие.Поскольку это привилегия
Корона, чтобы признать определенное благородство, и у нас есть
такое благородство видел в < К началу Территориальный Барон (ess) — с бывшего сайта с печаткой Вся знать, по этим дарам знай, что Мы, < К началу Рыцари рыцарства: рыцарь или магистр оружия Клятва рыцаря «Я клянусь в верности и кланяюсь Да будет известно, что Мы, <<Король>>, Король по праву
герб Среднего царства и < ДЛЯ ВСЕХ И ОТДЕЛЬНЫХ, а также для дворян и неевреев
как и другие, кому эти подарки достанутся <имя
Дракона> псевдоним Дракон главный здесь
король оружия всего Царства Среднего
Царство посылает приветствие нашего Повелителя
вечный <имя Повелителя> и <имя
consort> его королева, ПОСКОЛЬКУ давным-давно из
начиная отважные и энергичные поступки достойных
люди пришли в мир с Сондри
памятники и воспоминания о там добрых пустынях делают
Нашей особой благодати и определенных знаний
распознать << Имя получателя >> как
Рыцарь / Мастер по оружию Общества творчества
Анахронизм, быть во всех почетных местах пронумерован
Пэр Нашего Царства и член ордена
Рыцарство, все права, привилегии, знаки отличия,
приоритет и ответственность за него
принадлежащий. К началу Орден Лавр , Laurel Oath
Настоящие письма всем знатным и знатным людям. читать, слышать или видеть<имя Дракона> как Главный герольд дракона и король оружия Посланник Среднего Царства с должной и скромной похвалой и приветствие. Справедливость воля и разум орданет
чтобы люди добродетельные и благородные
заслуги и известность вознаграждаются не только их
дела, но быть помещенным с честью с другими
признанный, принятый и уважаемый, принятый некоторыми
ансамбли и демонстрации чести и знати, которые
значит пэрство королевства и герб
Патентными письмами. И поскольку <имя
получатель>, джентльмен / женщина, рекомендуется для нее
безграничная преданность и преподавание искусства в
поля <специальности>, и поскольку
упомянутый лорд / леди встретил большое одобрение со стороны
члены нашего Ордена Лавра имеют свои
величайшие величества <имя короля и королевы> хотел, чтобы я, упомянутый Дракон, посвятил и подтвердил
он / она сказал, что оружие впредь будет нести эти
буквы Патент, подтвержденный его / ее квалифицированными специалистами.
работает и манера поведения и подобает пэру
Общество.И поэтому я по их просьбе и
ответственный властью и властью присоединенной,
приписывались, давались и даровались мне и моим
офис Dragon Herald выраженными словами под
отличная печать MidRealm ратифицирована, подтверждена и
изложил ей оружие таким образом, как
далее следует, то есть: К
иметь и придерживаться указанного |
Это один из великих
радость короны узнавать людей, которые
проявлять вежливость, изящество и честь ко всем людям
разряды и которые наглядно демонстрируют, что значит быть
воплощение Мечты. Поэтому в знак признания
из этих прекрасных характеристик мы настоящим
сделать <имя получателя> Премию
Сапфир. Мы передаем ему / ей все права и
обязанности, связанные с The Sapphire и
право носить значок: Без поля ступенчатый разрез
драгоценный камень лазурный.С большим удовольствием это было
подтверждено царскими руками, сидя на нашем
троны этот <дата> день <месяца> А.С. <год>, в
наше самое очаровательное <место проведения мероприятия>.
Поскольку он / она украсил корону
Срединное царство до сих пор, так что он / она будет продолжать
сделать это в наших сердцах.Совершено в <
Мы желаем
всем знать, что они высоко ценятся
Сами, с этой целью Мы даруем им
Премия Рощи. << Название группы >> может украсить
их устройство с: Per pale Or и argent, a hurst
purpure, знак этой награды. Дано Нашими руками
this <
S. <<Год>>, а
сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в
свидетельство чего Мы поставили руку и печать.
Мы
предоставить ему / ей все права и обязанности
сопровождающий в этом звании, и право носить
значок: Верт, на бледном Или, три клыка верт, без
пусть или помеха от любого человека. Сделано это <<Дата>>
день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, сидя на
Наши престолы в Нашем << Названии места >> в свидетельстве
к которому Мы приложили руку и печать.
Совершено в <
Мы предоставляем ему / ей все права и
обязанности, сопутствующие этому званию, и
право носить значок награды без разрешения или
помеха со стороны любого человека. Совершено в <
S. <<Год>>, сидя на Нашей
престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего
Мы установили Свою руку и печать.
Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей
престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего
Мы установили Свою руку и печать.
Знай, что у него есть
доказанное право достойно чести и заслуги
суфизиантская хитрость и умение проявлять гражданские
бой и показал это на испытаниях оружием с
наши легионы Rapier. Прежде всего, знайте, что мы находим
он благородный кавалер, которому мы доверяем
воспитание и бережное отношение к Благородному искусству защиты
в этом нашем Среднем Царстве, доверяя ему предложить
хорошее наставление для всех, кто его ищет, советуйтесь в
хороший сезон, и что он немедленно возьмет
действие, чтобы защитить честь этого королевства, путем
кто бы это ни оспаривал.Мы даем ему право
носить нагрудный знак: Gules, две рапиры в салазках
серебро в кольце Или и гордо показать все
символы Ордена беспрепятственно и беспрепятственно
человек. В свидетельство чего Мы приложили руку к этому <дата> день <месяца> Anno Societatis <год> в Нашей <ветка>, в <событие>.
У наездника есть
многие достоинства, такие как навыки верховой езды, верховая езда
точность в обращении и обучение искусствам
конный спорт; Истинное лидерство проявляется, когда все
достигнуть высшей точки в симбиозе лошади и всадника, чтобы
приведи их к победе. Следовательно, Мы, <<Король>> и <
Сделано нашими руками это <дата> день <месяца>, Anno Societatis <год> в нашем <место проведения мероприятия>.
Мы наделяем его / ее всеми правами
и обязанности, связанные с этим званием и
право ношения нагрудного знака: Argent, a heart vert
чешуйчатый серебристый, без каких-либо препятствий
человек. Дано Нашими руками в этот <<Дата>> день <<Месяц>>, A.S. <<Год>>, сидя на Нашей
престолов в Нашем << Месте >>, в свидетельство чего
Мы поставили Нашу руку и печать
Мы подтверждаем и
признать ему / ей все права и
обязанности, сопутствующие этому рангу, без
пусть или помеха от любого человека. Отныне он / она
должен быть известен его / ее короной из серебра
украшен жемчугом. Мы подтверждаем это нашими
передает этот <
Впредь он / она будет известен своим
корона из золота, украшенная жемчугом. Сделано это <<Дата>> день <<Месяц>>, А.С. <<Год>>, а
сидя на Наших престолах в Нашем << Названии места >>, в
свидетельство чего Мы поставили руку и печать.
И, кроме того, подтверждаем
ему / ей на основании патентной грамоты право на ношение <
Среди которых самые главные и самые
Обычно все носят знаки в шильдах
под названием Armes, которые являются явной демонстрацией
prowes и valoir, которые
предусмотрительно разработано вначале, чтобы расшевелить и
найти в сердцах людей подражание
vertue и noblenes Так же есть Бен и
но постоянно до конца соблюдается, что, например,
оказали достойную услугу своему королю или контри
либо в войне, либо в мире оба могут получить должную честь
в своей жизни и получают то же самое последовательно до
там постерити навеки И ТРЕБУЕТСЯ <имя получателя> в <имя получателя локального
группа> джентльмен, после чего я произвел поиск
соответственно и обнаруживаем, что саид <имя
получатель> может носить эти оружие в соответствии с Патентным письмом
ЧТО СКАЗАТЬ <получатели зарегистрированного герба>, и
Я сказал, Дракон, каждую его часть и каждую частичку.
Король оружия властью и властью в моем офисе
приложен и предоставлен в виде буквенного патента в соответствии с
большая печать MidRealm подтверждаю ратификацию и
разрешить и для указанного <имя получателя
с новым названием> джентльмен к своему потомству с должным
разница в соответствии с Lawe Armes и
то же самое иметь и наслаждаться вечно без препятствий
позволение или вмешательство любого лица или лиц В
СВИДЕТЕЛИ ЧЕГО в нашей горе <местонахождение даже> установить здесь королевскую руку и печать Офиса <дата> день <месяца> и в <год> год нашего
Общество.