Сигналка авто: Купить автосигнализацию в интернет-магазине Carcam

Содержание

Лучшие автомобильные сигнализации в 2018

Главная задача автосигнализации — охранять машину от воров. Если сигнализация будет ненадежная, машину могут легко взломать и угнать. А водитель об этом узнает только увидев пустое место на стоянке.

Помните: сигнализация не защищает автомобиль от угона на 100%. Чтобы максимально обезопасить машину, мастера советуют добавить дополнительные аксессуары: реле блокировки, GSM и GPS модули, обходчик штатного иммобилайзера.

    Лучшие сигнализации 2018 — 2019 года:
  1. Без автозапуска
  2. С автозапуском
  3. и GSM

Без автозапуска

Такие сигнализации стоят дешевле «коллег» с автозапуском. Подойдет тем, кто не планирует запускать авто дистанционно или живет в теплом климате, где зимой машины не промерзают.

StarLine A63 ECO — лучшая

Самая недорогая сигнализация у Starline — сэкономите на автозапуске, но не на бренде и качестве. Канал защищен 128-битным шифрованием. Легко устанавливается в любую машину без CAN-шины.

К системе можно подключить автозапуск, GSM и GPS, модуль 2CAN+LIN для установки в авто с CAN-шинами. То есть можно сначала купить недорогую сигнализацию, которая не ударит по карману, и постепенно докупать дополнительные модули.

StarLine E66 2CAN+2LIN ECO — экономит энергию

Просто хорошая сигнализация. Подходит ко всем автомобилям благодаря встроенной CAN-шине. Сигнал защищен от взлома и помех.

Потребляет совсем мало энергии — работает до 60 дней в режиме охраны. Можно добавить дополнительные модули: Блютуз, автозапуск, GPS, GSM.

Pandect X-1000BT

Сигнализация работает без отдельного брелока — машина открывается с телефона через Bluetooth. В мобильном приложении можно удобно настроить сигнализацию под свои нужды. Встроена функция Slave — можно открывать машину с родного брелока.

Размеры базового блока сигнализации всего 45х25х8 мм — можно спрятать в машине так, что угонщик никогда его не найдет. Для дополнительной защиты от угона в комплекте идет реле блокировки.

Pandect X-1000BT устанавливается в любой авто благодаря CAN-LIN шине. Можно подключить дополнительные устройства: замок капота, модули GSM и GPS, автозапуск.

Scher-Khan Mobicar А v 2.0

Среди всех сигнализаций Scher-Khan нового поколения эта самая бюджетная. В комплекте идет CAN-шина — можно подключить к любому авто с CAN. В версии 2.0 есть Bluetooth — можно управлять сигнализацией со смартфона. Также в комплекте идет брелок и Slave-система для работы от штатного ключа. При желании можно докупить и поставить модуль для автозапуска.

С автозапуском

Такие сигнализации заводят двигатель удаленно — при нажатии кнопки, в определенное время или если на улице станет слишком холодно. Помогают прогревать машину заранее и не дают ей замерзнуть зимой.

StarLine A93 2CAN+2LIN ECO — лучшая

Для сигнализации с автозапуском довольно недорогая. Благодаря шине 2CAN+2LIN легко устанавливается в любую машину, даже напичканную электроникой. Умеет без ключа обходить штатный иммобилайзер, можно настроить запуск двигателя по часам и дням недели. К сигнализации легко подключить дополнительные аксессуары для лучшей защиты от угона, например, GPS и GSM-модули.

StarLine — не китайский ноунейм, а известный бренд. У производителя есть техподдержка, в которой вам помогут правильно настроить сигнализацию, ответят на вопросы, а в случае поломки обменяют компоненты сигнализации по гарантии.

Pandora DX 50S (2CAN-LIN+IMMO-key) — бюджетная

Среди сигнализаций Pandora эта самая недорогая. У каждой сигнализации свой ключ шифрования на 128 бит — взломать электронно невозможно. Обход штатного иммобилайзера доступен сразу из коробки.

Энергопотребление Pandora DX 50S всего 7 mA — меньше, чем у большинства других моделей. Сигнализация не разрядит аккумулятор авто и позволит запустить двигатель после долгого простоя.

Pandora DX 90B

В этой сигнализации есть Блютуз. В пределах его действия можно управлять сигнализацией со смартфона — ставить и снимать систему с охраны, заводить и глушить двигатель, настраивать чувствительность датчиков и запуск двигателя по расписанию.

В комплекте есть блютуз-метка — с ней система определяет вас как владельца и позволяет открывать дверь и запускать авто штатным ключом. Если попробовать открыть машину без метки, сработает сигнализация. Смартфон тоже работает как Блютуз-метки.

Как и модель выше, защищена индивидуальным диалоговым кодом — взломать сигнализацию электронно невозможно.

Scher-Khan Mobicar А v 2.0 с модулем автозапуска М1

Сигнал у Scher-Khan Mobicar А шифруется по алгоритму AES-128 — электронно взломать его практически невозможно. Поддерживает Блютуз — можно управлять сигнализацией со смартфона и использовать телефон в качестве Блютуз-метки для дополнительной защиты.

Благодаря модулю автозапуска М1 можно поставить на машину без CAN-шины. Поддерживает бесключевой обход штатного иммобилайзера на большинстве моделей авто. Есть режим SLAVE — можно открывать и заводить авто со штатного брелока.

С автозапуском и GSM

Такие сигнализации связываются с брелком или смартфоном по GSM, то есть мобильной связи. Это позволяет следить за машиной на любом расстоянии, управлять защитой авто даже из другого города. Сигнал GSM не блокируется глушилками.

Pandect X-1800 BT — лучшая

Устойчивый ко взлому канал связи, реле блокировки двигателя, встроенный обход штатного иммобилайзера практически на всех авто — не придется делать дубликаты ключей и дополнительные брелоки. GSM-трафик платный, но есть бесплатный Блютуз, который хорошо работает на небольших расстояниях.

Через Блютуз можно управлять сигнализацией со смартфона и использовать его как Блютуз-метку для дополнительной защиты. В комплекте есть и стандартная метка, если смартфон в качестве метки вас не устроит.

GPS у этой модели нет, но технология LBS POSITIONING помогает с помощью смартфона найти авто, если оно находится в пределах действия сотовой сети.

StarLine A93 GSM

В базовой комплектации у сигнализации есть только GSM модуль и возможность обойти штатный иммобилайзер на некоторых авто. Но ее легко модифицировать: добавить GPS, реле блокировки, датчик объема — можно докупить только то, что нужно.

В комплекте два брелка — полноценный и дополнительный. Можно управлять функциями сигнализации с телефона через GSM-интерфейс.

Для установки в современные авто понадобится адаптер 2CAN-2LIN. С ним можно будет обойти почти любой штатный иммобилайзер.

StarLine S96 BT 2CAN+2LIN GSM/GPS+ГЛОНАСС — полный комплект

В этой сигнализации есть все: GPS, Блютуз, встроенная возможность обхода штатного иммобилайзера и работа со штатным брелоком. Поддерживает предпусковые обогреватели двигателей Webasto и Eberspacher — их можно запускать дистанционно.

В комплекте сигнализации вообще нет брелока с дисплеем. Для настройки сигнализации используется смартфон, с охраны авто снимается смартфоном или Блютуз-меткой.

В модуле GSM установлен 3G модем, сигнал намного лучше и быстрее, особенно среди высоток или на подземной парковке. Связь по GSM идет через звонки и СМС — можно позвонить машине и спросить, как у нее дела.

Призрак-8L — экономная

Самая недорогая из сигнализаций с GSM. На месте все нужные функции: бесключевой запуск, Блютуз, встроенный CAN-контроллер. Есть режим бесплатного мониторинга — даже без оплаты за GSM-связь можно следить за машиной из любой точки мира.

Особая фишка — «пляжный режим». На отдыхе можно закрыть в салоне все личные вещи вместе с ключами от машины — для открытия дверей нужно будет просто ввести заранее заданный код кнопками на дверях или багажнике.

Pandora DXL 4910

CAN-контроллер этой сигнализации работает одновременно с тремя шинами CAN, что позволяет ему эффективно управлять электроникой сложных современных автомобилей.

В сигнализацию встроен модуль GPS, Блютуз, радиореле блокировки двигателя, работает функция Slave и бесключевой доступ. Присутствует интегрированный радиомодуль на 868 МГц, так что сигнализация работает не только со смартфоном и метками, но и с брелоком.

Встроенное резервное питание обеспечивает дополнительную защиту. Если угонщик как-то отключит питание автомобиля, встроенный аккумулятор сигнализации отправит тревожное уведомление на смартфон или брелок.

почему это может происходить с авто и что делать в этом случае

От надежности работы автомобильной сигнализации напрямую зависит сохранность транспортного средства.

Если сигнализация время от времени начинает срабатывать без участия владельца транспортного средства, следует немедленно установить причины нештатного срабатывания, приступить к их немедленному устранению.

Почему сигнализация срабатывает сама по себе

К числу наиболее возможных причин нештатного срабатывания автомобильной сигнализации относятся:

  • неправильная регулировка чувствительности датчика удара/наклона/качения;
  • дребезг контактов датчиков закрытия дверей, капота, багажника;
  • разряд аккумуляторной батареи, наличие утечек по цепям питания;
  • высокий уровень электромагнитных помех в зоне стоянки автомобиля;
  • плохие контакты, нарушение электропроводки сигнализации;
  • сбои в работе CAN-шины авто;
  • попадание влаги;
  • неисправность или неправильная установка датчика объема;
  • преднамеренные действия автоугонщиков.

Разберемся, что делать в каждой конкретной ситуации, как установить причину ложных или псевдоложных срабатываний.

Что делать в этих случаях

Постараемся разобраться что можно предпринять в таких случаях в первую очередь и какие при этом бывают нюансы.

Преднамеренные действия автоугонщиков

Ситуация является классической, не раз описана в СМИ, литературе и фильмах. Классическая ситуация: в автомобиле ночью начинает периодически срабатывать сигнализация. После третьего — четвертого срабатывания хозяин, думая что сигналы ложные, снимает авто с охраны, откладывая устранение проблемы на утро.

Утром проблема уходит вместе с автомобилем. Угонщики провоцируют ложные срабатывания в своих противоправных целях.

Каким образом обычно вызываются псевдоложные срабатывания:

  • бросание мелких предметов в автомобиль;
  • специальный передатчик мощных радиопомех;
  • установка на днище вибрирующего устройства и др.

Как поступать в таких случаях? Ни в коем случае полностью не снимать автомобиль с охраны. В большинстве автомобильных сигнализаций на такой случай предусмотрен «тихий» режим работы без сирены, который можно запрограммировать с брелока.

На крайний случай, можно спуститься к авто и аппаратно отключить сирену: отсоединить один из проводников, идущих к ней. Спокойствие жильцов будет восстановлено, а сигнализация продолжит свою работу.

При установке автомобильной сигнализации желательно выбрать такую модель, чтобы в ней имелась функция иммобилайзера. В таком случае при несанкционированном проникновении завести двигатель будет проблематично. Однако это не убережет авто от угона методом эвакуации или буксирования. Обычно угонщики отказываются от своих планов при работающей аварийной световой сигнализации, которая в ночное время привлекает внимание.

Неправильная регулировка чувствительности датчика удара/наклона/качения

Повышенная чувствительность датчика может привести к ложным срабатываниям в плохих погодных условиях (ветер, большие осадки), постановке на охрану вблизи автомагистралей, оживленных мест.

В современных автомобильных сигнализациях в основном применяют двухуровневые датчики (на слабые и сильные воздействия). Их чувствительность устанавливается при монтаже автосигнализации, как правило, регулированием потенциометров, расположенных на корпусе датчика. Если чувствительность большая, это может привести к ложным срабатываниям.

В экстренном случае можно на время программно отключить датчик удара/наклона/качения либо сделать это технически (отсоединить от датчика разъем).

Датчик качения обычно представляет небольшой блок размером со спичечный коробок, установленный под рулем, с разъемом и светодиодом на корпусе. На корпусе имеются один или два регулировочных отверстия под маленькую отвертку «на плюс».

Регулировка чувствительности датчика производится в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Частая причина ложных срабатываний – нарушение крепления датчика. Иногда (и чаще всего) его крепят к элементам конструкции кузова пластмассовыми хомутами, которые через пару лет эксплуатации обламываются. Датчик просто болтается на проводах, срабатывая от малейшего дуновения ветра. Поэтому необходимо обязательно проверить качество его крепления.

Дребезг контактов датчиков закрытия дверей, капота, багажника

Такая неисправность чаще встречается в автомобилях до 2005 года выпуска. В таких авто устанавливались контактные датчики (концевики) закрытия дверей, капота и багажника, которые часто приходили в негодность. Признак проблемы со штатными датчиками закрытия дверей – непостоянная постановка на охрану автомобиля.

В первую очередь обычно отказывает датчик закрытия двери водителя, как наиболее востребованный. В этом случае, закрывая двери центральным замком, они могут сразу открываться.

Видео — что можно сделать, если сигналка срабатывает сама по себе из-за концевиков на капоте и багажнике:

Следует произвести регулировку завесов и скоб замков дверей, установленных на стойке, обычно проблема устраняется. При необходимости можно заменить концевые выключатели.

В современных автомобилях применяют электронные датчики закрытия дверей и окон, поэтому, если сигнализация сбоит по их причине, часто приходится заменять блоки замков целиком.

Разряд аккумуляторной батареи, наличие утечек по цепям питания

Если аккумулятор автомобиля разряжается до критической величины, автосигнализация может начать работать в нештатном режиме.

В двунаправленных сигнализациях с ЖК-брелоком обычно есть режим индикации напряжения бортовой сети. Если оно ниже, чем 11,5 Вольт, брелок подает звуковой сигнал. В более простых сигнализациях возможно срабатывание сирены. В этом случае необходимо проверить напряжение на АКБ, цепи питания на наличие утечек, приводящих к разряду аккумуляторной батареи во время стоянки.

Современные автосигнализации имеют крайне низкие токи потребления в режиме охраны (до 15 миллиампер). При отсутствии утечек и хорошем аккумуляторе такие автосигнализации могут работать до полугода во время длительной стоянки автомобиля без подзарядки АКБ.

Высокий уровень электромагнитных помех в зоне стоянки автомобиля

Производители указывают в технических характеристиках уровень помехозащищенности автомобильных сигнализаций. В городских условиях есть зоны, в которых уровень напряженности электромагнитного поля значительно превосходит максимально возможный, что может привести к сбоям. Обычно такие зоны находятся вблизи:

  • приемопередатчиков базовых станций сотовой связи;
  • линий электропередач;
  • троллейбусных и трамвайных путепроводов;
  • промышленных зон.

Единственный способ устранения ложных срабатываний, связанных с этой причиной, — искать иное место для стоянки.

Плохие контакты, нарушение электропроводки сигнализации

Нередко сигнализация устанавливается на автомобиль не специалистами, с нарушениями привил электромонтажа. Даже если она установлена грамотно, через пять-семь лет эксплуатации сигнализация начинает «глючить» чаще всего по причине нарушения контактов, соединений. Поэтому с заказами по демонтажу старой сигнализации с каждым годом обращаются все больше автолюбителей.

В некоторых случаях рациональнее полностью демонтировать старую и установить новую автосигнализацию, чем постоянно обращаться к автоэлектрикам по поводу устранения проблем с сигнализацией, установленной несколько лет назад.

Сбои в работе CAN-шины авто

Современные автосигнализации ведут сбор информации о системах автомобиля по CAN-шине. CAN-шина – это своеобразная локальная сеть автомобиля, которая связывает основные блоки управления авто (кузовом, двигателем, ABS и др.)

Если раньше сигнализации контролировали закрытие дверей непосредственно с датчиков каждой двери, то современные сигнализации, работающие по CAN-шине, получают по ней одновременно практически все данные: о состоянии кузова, температуре салона, двигателя и другие.

Обычно CAN-шина представляет витую пару низкого и высокого уровня. При нарушении ее целостности сигнал о состоянии охранных зон авто теряется, автомобильная сигнализация может идентифицировать такое состояние, как попытку проникновения, и начать срабатывать.

Восстановление целостности CAN-шины довольно сложная проблема, требует вмешательства специалиста.

Попадание влаги на главный блок сигнализации

Очень частая причина для пожилых автомобилей.

Типовое место установки автосигнализации – под приборной панелью в районе левой стойки возле левого колена водителя.  Влага проникает в место установки вдоль водительской стойки. Чаще всего проблема возникает осенью, когда конструктивные сливы дождевой воды под лобовым стеклом засоряются опавшей листвой и хвоей. Сливы в эту пору года обязательно надо периодически очищать.

Если всё же в этот блок сигнализации попала вода, то необходимо выключить зажигание, снять клеммы аккумулятора, отсоединить от разъемов головной блок автосигнализации.

Затем надо аккуратно разобрать корпус, почистить монтажную плату с помощью мягкой кисточки и медицинского спирта (не растворителя!), просушить, можно с использованием фена при температуре не выше 130 градусов Цельсия.

Неисправность датчика объема или его неправильная установка

Датчик объема устанавливается не на все автомобили. В автосигнализациях Sherif ZX 945, например, можно встретить такой датчик.

Если его расположить в автомобиле неправильно, он может срабатывать на прохожих. В таких ситуациях можно его временно демонтировать, затем в спокойной обстановке экспериментировать с местом расположения датчика объема.

Совет

От исправной сигнализации, работающей без сбоев, зависит ваше спокойствие. Не накапливайте проблемы. Устраняйте их при появлении первых ложных срабатываний.

Если у вас есть соответствующие навыки и схема подключения розетки фаркопа, то сможете самостоятельно её установить.

Какое моторное масло лучше использовать зимой и почему.

Как и где можно найти свои штрафы ГИБДД https://voditeliauto.ru/voditeli-i-gibdd/shtrafy/po-nomeru-postanovleniya.html по номеру постановления.

Видео — как настроить чувствительность датчика удара, чтобы не было ложных срабатываний автосигнализации:


Сигнализация Призрак официальный сайт — ТЭК электроникс

Вы здесь: Главная 



Сертификаты

Установочный центр на Новом Арбате д. 36 стр.3

Установочный центр на Востряковском проезде 10Б

Установочный центр на Проспекте Мира 186А стр.1


Компания «ТЭК электроникс» – современный разработчик и интегратор электронных приборов различного назначения для последующего их применения в автомобильных системах. Десятилетний опыт работы, команда выдающихся инженеров и собственные патенты на изобретенную электронику говорят о высоком статусе фирмы на рынке высокотехнологических приборов. Основное направление деятельности – охранные приспособления, препятствующие угону автомобиля любым из способов, практически и теоретически возможных на данный момент.

Ассортимент продукции – прогрессивные виды противоугонных систем

Наибольшее признание и спрос среди отечественных и зарубежных клиентов имеют GSM-сигнализации, Slave-сигнализации и иммобилайзеры компании «ТЭК электроникс». Среди первой группы товара стоит выделить 800-ю серию, собравшую в себе множество эффективных технологий, известных под маркой «Призрак». Система защиты автомобиля на базе GSM-комплекса – это максимум удобств для пользователя и минимум шансов для злоумышленника.

Основное преимущества устройств серии Призрак-800 – это автозапуск мотора на любом расстоянии с возможностью включения отопителя в холодное время года. Управление климатом дополняется другими достоинствами:

  • удаленный контроль состояния автомобиля при помощи смартфона;
  • встроенный иммобилайзер с функциями AntiHiJack и PINTODrive;
  • сигнализация с активацией со штатного брелока.

В зависимости от конкретной модели функциональность расширяется не только за счет дополнительных опций, усиливающих защитные свойства авто, но и путем применения более надежных материалов или совместимостью с другими типами противоугонной защиты.

Незаметная противоугонная система – кошмарный сон автоугонщиков

Особенность Slave-сигнализации Призрак 700-й серии – это ее скрытая установка, абсолютно ничем себя не выдающая для злоумышленника. Миниатюрное управляющее устройство подключается к штатной проводке автомобиля в любом малозаметном месте под капотом. Так как обнаружить и определить тип защитной системы автомобильные угонщики не могут, то и взломать ее им не удается.

Датчики сигнализации информируют владельца обо всех неблагоприятных событиях с оставленной на парковке машиной. Наклон, удар или любое перемещение авто будет сразу же зафиксировано, о чем хозяин автомобиля получит соответствующий сигнал. Управление происходит также в скрытом режиме – обычным штатным-брелком. Оснащение топовых версий приборов данной модельной линейки в виде радиометки и блокирующего беспроводного реле позволяет минимизировать риски угона до нулевых значений.

Серия 500 – иммобилайзеры повышенной надежности

При установке иммобилайзера машину становится крайне затруднительно угнать как с места ее стоянки, так и в любой точке ее пути. Технология AntiHiJack глушит двигатель после того, как авто было захвачено и проехало несколько сотен метров (безопасное расстояние для вызова полиции владельцем). Функция PINTODrive отвечает за парковочный режим – даже заведя авто, уехать на нем не удастся: двигатель заглохнет, если не будет введен определенный код.

Подключение охранной системы по CAN-шине выполняется просто и надежно, у более дорогих моделей работает два контура защиты. При помощи продуманного ассортимента продукции «ТЭК электроникс» реально достичь такого уровня защищенности, который будет недостижим для взлома самыми опытными злоумышленниками современности.


Цены на установку сигнализации в автомобиль

Цена установки сигнализации складывается из нескольких значимых факторов:

 

1. Производитель сигнализации. Оборудование известных марок, которые давно зарекомендовали себя в этой сфере, отличается высоким качеством. Цена сигнализации «Шерхан», «Пандора», «Старлайн» и других востребованных у автолюбителей брендов будет несколько выше, чем охранного оснащения никому не известных фирм. Имя производителя уже является своего рода гарантией долговечности и надежности.

 

2. Функционал сигнализации. Очевидно, что цена установки автосигнализации с базовым набором функций будет ниже, потому что ее монтаж намного легче. Однако нужно учитывать, что и защита в таком случае будет не самой эффективной. Не стоит забывать, что преступники с каждым днем совершенствуют свои технические навыки и уже научились взламывать простейшие охранные механизмы.

 

3. Сложность установки. Дополнительные функции сигнализации делают пользование автомобилем более комфортным, но устанавливать такое оборудование сложнее. Поэтому стоимость установки автосигнализации с автозапуском и другими полезными опциями обойдется дороже, а монтаж системы автозапуска к уже установленной сигнализации – еще немного дороже.

 

Какую стоимость автосигнализации считать оптимальной?

 

У каждого владельца машины существуют собственные требования к охранной системе. Это может быть элементарная сигнализация с односторонней связью или модель с обратной связью для более полного контроля над безопасностью автомобиля. Также возможен выбор сигнализации с центральным замком или дистанционным управлением. В зависимости от того, какую вы решите установить сигнализацию на автомобиль, цена на нее будет разной.

 

Далеко на всякая марка авто требует максимально инновационных решений в области охраны. И владельцы подержанных «Жигулей», и обладатели новеньких «Порше» могут соблюсти идеальный баланс между ценой и качеством. Здесь, на сайте, вы можете узнать какова цена сигнализации на авто, а наши специалисты помогут вам определиться с выбором.

 

Говорящая сигнализация на авто своими руками: подробная схема

Чтобы отличить вой сирены своей автосигнализации от тысячи других, следует установить на автомобиль «умную» говорящую сигналку. Сделать это довольно просто.

Принцип работы говорящей сигнализации

К установленной в авто сигнализации потребуется прикупить:

  • рупор;
  • контроллер Ардуино.

Для самой простой конструкции этого будет достаточно. Контроллер спрячется за крышкой громкоговорителя, образовав с ним единую систему.

Озвучить устройство можно любым голосом – хоть политика, хоть киношного героя. Тут уже зависит от вашего личного предпочтения.

Система будет работать по такому алгоритму: рассчитывает количество импульсов, приходящих на сирену штатной сигнализации авто. К примеру, один импульс будет означать команду «закрыть машину» или «поставить на охрану». Два импульса, поступающие на штатную сирену, будут означать: «открыть автомобиль» или «снять с охраны». Сразу несколько импульсов подают сигнал тревоги, а постоянный импульс — сработает сигнализация.

Установка музыкальной сирены

Можно приобрести приставку, издающую разные звуки, – от лая собаки до нелестного крика: «Пошёл вон!». Возможны любые другие рингтоны или фразы. Такая музыкальная сирена подойдёт для установки к любой системе безопасности.

Установив музыкалку, которая, кстати, не влияет на разрядку аккумуляторной батареи, сможете провести настройки со смартфона, записав в ПО любую желаемую мелодию.

Прежде чем приступить, понадобится установить отдельный рупор, который будет управляться импульсами, как указано выше.

Подключение сирены

Рассмотрим вариант подключения для устройства SirenaBT5. Вам придётся соединить три провода:

  • красный: постоянный «+»;
  • чёрный: масса;
  • жёлтый соединяется с красным проводком сирены «+».

@beephorn.com

Далее следует подключить кнопку звукового сигнала:

  • зелёный «+»;
  • белый «-».

@beephorn.com

Чтобы сирена срабатывала на заднем ходу, соедините:

  • оранжевый «+»;
  • cерый «-».

Установка приложения BeebHorn

Зайдите в Play Market и выберите соответствующее приложение (для iOS не ищите — его пока не существует).

Для говорящей сирены понадобится SD-карта. Если она вдруг выйдет из строя, сирена будет подавать звуки тревоги в обычном старом режиме.

  1. Подведите к плате питание.
  2. Включите Блютуз на телефоне.
  3. Запустите поиск сигнала.
  4. В течение 10 секунд следует подобрать желаемый звук, иначе карта уйдёт в дежурный режим.
  5. Откройте приложение.
  6. Выберите кнопку готовой мелодии или запишите через микрофон свой текст.
  7. Во вкладке конфигурации задайте параметры громкости воспроизведения, ширину импульсов, режим кнопки, количество воспроизведений.
  8. Перейдите во вкладку «Мелодии», загрузив выбранный аудиоролик.
  9. В «Журнале» настройте событие: какая мелодия к какому случаю подходит (удержание, открывание, закрывание), задав цифровую кнопку и дописав при желании название трека.
  10. Произведите точно такие же настройки с остальными каналами (зелёный и оранжевый провода).
  11. Завершив настройки, зайдите в «Конфигурацию» и сохраните мелодии и события. Здесь же можно поменять пин-код Блютуз-соединения.

Для сигнализации «Шерхан» не следует устанавливать ширину импульсов, так как в этой сигнализации параметр постоянно изменяющийся.

Мелодии в приложение можно загружать с сайта BeebHorn. Отыскать выбранные на сайте треки можно в папке «Конвектор».

Динамик лучше выбирать влагостойкий. Разница в цене не особо существенна.

Будьте готовы к тому, что пищать и орать сирена будет отменно, а голос даже в формате МР3 воспроизводится не очень качественно.

Теперь вы знаете, как озвучить сигнализацию голосом, звуками или рингтонами. Надеемся, у вас всё получится.

Оценить статью

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:

Лучшая GSM-сигнализация для авто

В условиях современного города с его высотными зданиями и прочими искусственными препятствиями для радиосвязи обычные автомобильные сигнализации далеко не всегда работают эффективно.

При значительном удалении от машины брелок может не уловить поступивший на него тревожный сигнал. Кроме того, многие злоумышленники научились глушить оповещения сигнализации при помощи специализированных устройств, помещающихся в небольшую наплечную сумку или чемодан.

Поэтому оптимальным выбором для профессиональной защиты транспортного средства является GSM-сигнализация для авто, которая работает на любом расстоянии и не может быть заглушена даже при помощи дорогостоящего оборудования. Также GSM-сигнализация позволяет управлять многими функциями транспортного средства, даже находясь в другом городе.

Покупка готовой модели

Оптимальным вариантом с точки зрения функциональности и удобства является приобретение готовой GSM-сигнализации. Производители предлагают разнообразные модели для транспорта, которые могут управлять разнообразными функциями машины, а также предоставлять дополнительные сервисы, повышающие уровень безопасности.

Преимущество подобного способа установки сигнализации заключается и в возможности заказа профессионального монтажа. При этом вы получаете гарантию защиты транспортного средства от случайного возгорания либо сбоя в электронике. Единственным существенным недостатком выбора готовой GSM-сигнализации можно назвать высокую стоимость.

Чтобы понять, какой вариант оптимально подходит для автомобиля, мы составим рейтинг лучших GSM-сигнализаций. Оцениваться будут не только функции такого устройства, но и устойчивость к взлому, а также возможность контроля состояния авто. Мы рекомендуем обратить внимание на следующие высококачественные модели, выпущенные в 2015 году.

Pandora 500 PRO

Вряд ли существует более совершенная автомобильная сигнализация — эта модель от производителя с мировым именем может похвастаться высочайшей степенью защиты машины. Главная её особенность — наличие полноценной двусторонней связи, которая позволяет владельцу получать оповещения о запуске тревожного режима на телефон, планшет, компьютер либо иной вид портативной электроники.

Сигнализация Pandora 5000 PRO

Применение метода диалогового кодирования позволяет защитить сигнал от перехвата большинством приборов, стоящих на вооружении злоумышленников. Также сигнализация включает в себя микрофон, устанавливающийся в салоне автомобиля — он позволяет выполнять прослушивание всего происходящего внутри транспортного средства либо запись звуков в режиме реального времени.

В максимальной комплектации можно установить и отдельный динамик либо подключить к блоку управления аудиосистему машины, чтобы иметь возможность связаться с преступником и убедить его оставить автомобиль, чтобы смягчить наказание либо решить ситуацию без привлечения правоохранителей.

Видео-обзор сигнализации Pandora 5000 PRO:

Дополнительное преимущество сигнализации — наличие GPS-модуля, который позволяет отслеживать текущее местонахождение транспортного средства. Данные можно выводить как в специальное мобильное приложение, так и в интерфейс веб-сервера.

Также можно воспользоваться услугой пультовой охраны и поставить автомобиль на контроль специальной службы, что будет наиболее актуально для наиболее дорогих машин. При необходимости сигнализацию можно оснащать блоками автоматического запуска и программаторами. За счёт этого удаётся заранее запускать двигатель, а также включать кондиционер либо отопитель при наличии автоматизированного климат-контроля.

Starline B94 GSM/GPS

Более дешёвая модель, которая является компромиссом между описанным выше устройством и сигнализациями начального класса. Её основная особенность — наличие множества датчиков в базовой комплектации. Они контролируют положение дверей, капота, крышки багажника и анализируют давление на водительское сидение.

Сигнализация Starline B94 GSM/GPS

При доработке путём подключения дополнительных модулей схема такой сигнализации может включать датчики положения руля, рукояти КПП, а также запуска мотора и температуры в салоне. Кроме того, владелец сигнализации от Starline может раскошелиться и на блок автоматического старта мотора, что позволит ему прогревать машину к определённому времени.

Как свидетельствует из названия, устройство также имеет встроенный модуль GPS, отслеживающий перемещения транспортного средства. Для управления им используется фирменное мобильное приложение с интуитивно понятным интерфейсом.

Видео-обзор сигнализации Starline B94 GSM/GPS:

Оно может создавать логи поездок, что особенно удобно для анализа пробега, средних затрат горючего и прочих параметров автомобиля, а также для сбора доказательств при ДТП. Сигнализацией можно управлять и в том случае, если вы забыли брелок дома — достаточно ввести специальный код в мобильном приложении либо отправить СМС на заранее определённый номер.

Magnum МН-880-03 GSM

Эту модель можно назвать лучшей в бюджетном классе благодаря применению множества датчиков и передаче кода с помощью диалогового метода связи. Однако её существенным минусом является очень бедная базовая комплектация, в которую не входит ни блок автозапуска, ни модуль GPS.

Сигнализация Magnum MH-880

Конечно, их можно установить дополнительно, но тогда стоимость устройства будет сопоставима с GSM-сигнализацией среднего класса. Поэтому устройство от Magnum нацелено, прежде всего, на водителей, нуждающихся в простом и эффективном средстве для защиты своего транспортного средства.

Ключевая особенность сигнализации — возможность управления ею с помощью различных интерфейсов и способов связи:

  • Веб-сервер;
  • Мобильное приложение;
  • СМС-сообщения;
  • Телефонные звонки и голосовые оповещения.

Благодаря этому получать информацию об активации тревожного режима и управлять некоторыми функциями транспортного средства можно в любой точке мира. Кроме того, сигнализацию также можно будет подключить к системе пультовой охраны.

Самостоятельный монтаж

Чтобы сэкономить немало денежных средств, вы можете создать простейшую GSM-сигнализацию своими руками, воспользовавшись минимальным количеством инструментов и компонентов. Главной частью импровизированной защитной системы будет простейший мобильный телефон без сенсорного экрана — подойдёт даже устаревшая кнопочная модель.

Возьмите кнопочный телефон

Также вам понадобится магнитный датчик открытия двери и геркон с двумя либо тремя контактами. Конечно, не обойтись и без соединительных проводов — лучше выбрать медные кабели в экранированной оплётке, которые отличаются очень высоким уровнем надёжности и долговечности.

Для начала задайте быстрый вызов своего номера на определённую кнопку, чтобы иметь возможность получать своевременные оповещения. Далее телефон нужно разобрать — достаточно снять с него переднюю кнопочную панель, чтобы открыть контакты, срабатывающие при нажатии. Провода присоединяются к кнопке вызова и нужной цифре на клавиатуре. Если при повторном нажатии кнопки вызова разговор не прекращается, вам придётся найти трёхконтактный геркон и присоединить один из его выводов к клавише сброса.

Схема по которой можно сделать сигнализацию

Теперь в схему нужно добавить магнитный датчик, который будет реагировать на несанкционированное открытие двери автомобиля. Её можно модифицировать, добавив вместо подобного сигнализатора датчик поворота ключа в замке зажигания либо датчик давления на кресло водителя.

Питание на геркон и датчик должно подаваться от батареи мобильного телефона. Чтобы обеспечить непрерывную работоспособность полученной самодельной сигнализации, нужно взять автомобильное зарядное устройство для этой модели телефона, разобрать 12-вольтовую розетку и подключить провода напрямую в электросистему автомобиля.

Результатом вашей работы станет действующая модель GSM-сигнализации. При открытии двери и срабатывании датчика геркон подаст питание на контакты соответствующих кнопок, и телефон совершит вызов. Единственное, что от вас требуется — следить за пополнением счёта мобильного телефона, чтобы обеспечить возможность беспрепятственного вызова.

Кроме того, раз в месяц рекомендуется доставать мобильный телефон из места скрытой установки и проверять его техническое состояние. Нежелательно давать номер телефона сигнализации кому-то из знакомых, поскольку при утечке информации злоумышленник сможет заблокировать работу устройства путём постоянного дозвона.

Видео готовой GSM сигнализации:

Если вы обладаете хорошими инженерными навыками, для вас не будет сложностью сделать более продвинутую GSM-сигнализацию из телефона. Для этого необходимо подключить к кнопкам вместо геркона электронный контроллер, соединённый с различными датчиками.

Базовые контроллеры для создания самодельных сигнализаций можно заказать в интернете либо купить на радиорынке. При желании вы можете подключить к мобильному телефону внешний динамик и микрофон, которые позволят установить двустороннюю связь с автомобилем. При создании сигнализации своими руками всё ограничивается только вашей фантазией и техническими навыками.

Лучшая защита

На сегодняшний день GSM-сигнализации считаются лучшими средствами защиты автомобиля, если не считать дорогостоящих спутниковых систем связи, контролируемых оператором в режиме реального времени.

Однако даже на такие устройства находится управа — злоумышленники приобретают специализированные приборы, которые глушат GSM-сигнал в радиусе нескольких метров и не позволяют отправить сигнал тревоги. Кроме того, преступник может выяснить, где находится кнопка отключения устройства, что позволит ему взломать автомобиль без применения дорогостоящей электроники.

Поэтому рассчитывать на полную безопасность машины при установке GSM-сигнализации не стоит. Никогда не стоит забывать о закрытом гараже, охраняемой стоянке или паркинге с видеокамерой, которые являются лучшим дополнением к наиболее продвинутым системам безопасности.

Автосигнализация (с автозапуском, обратной связью)

Словом «автосигнализация» принято обозначать специальное оборудование, которое звуковым или иным способом оповещает автовладельца или, окружающих машину, людей о том, что с ней происходят какие-либо неприятности. Сразу оговоримся, что следует различать между собой понятия противоугонных систем и противоугонных комплексов.

Среди противоугонных охранных систем различают: собственно автосигнализацию, иммобилайзер (электронная блокировка двигателя) и механические средства (устанавливаемые отдельно – замок на рулевой вал или КПП, замок капота и другие). Противоугонный комплекс — это подобранная комбинация из охранных систем, часто индивидуального технического наполнения.

Обычно сигнализация состоит из: основного блока, брелока, антенны приемо-передатчика, светодиодного индикатора, кнопки сервиса и датчика удара. Основной способ ценовой классификации самих автосигнализаций, представленных на рынке на сегодняшний день, базируется на технических особенностях связи автомобиля с устройством управления (брелоком). По этому принципу автомобильные сигнализации делятся на: имеющие одностороннюю связь и имеющие обратную (двустороннюю) связь.

Сигнализирующие охранные системы без обратной связи на сегодня являются самыми простыми и дешевыми. Их задача — не дать (случайному) вору завести автомобиль (за счет работы внутреннего электронного блока) и сообщить о несанкционированном проникновении в машину окружающим (без информирования владельца, если тот находится вне зоны видимости автомобиля и звуковой досягаемости сирены). К сожалению, таким способом легко можно отпугнуть только случайного взломщика или хулигана (что актуально для недорогих авто и автомобилей средней ценовой категории). Однако для профессионального автоугонщика проблема взломать такую сигнализацию особого труда не представляет. Поэтому можно говорить о том, что в настоящее время автосигнализации без обратной связи в плане реальной защиты автомобиля — это уже вчерашний день.

Автосигнализации с двусторонней (обратной) связью информируют владельца обо всем, что происходит с его машиной. Выполняется эта функция путем передачи на экран брелока данных о том, какому конкретно воздействию подвергся автомобиль, причем не обязательно этот момент будет сопровождаться звуковой сиреной. Современная двусторонняя связь может выполняться по трем алгоритмам: динамического и диалогового кодирования и путем передачи сигнала по мобильной связи (GSM-модуль). И тут начинается основная интрига, так как от способа кодировки напрямую зависят реальные противоугонные характеристики автосигнализации с обратной связью. Сегодня на рынке предлагаются самые различные модели автомобильных сигнализаций с обратной связью, разнообразие которых в основном базируется на комбинации прилагаемых тюнинговых функций, таких как запуск двигателя (автозапуск) в отсутствие водителя, управление электрическими стеклоподъемниками, регулировка настроек кондиционера, магнитолы, водительского сиденья и других. Итоговая цена такой автосигнализации зависит от уровня и количества встроенных опций. И зачастую информация о способе кодировки, используемой в обратной связи автосигнализации, не является ключевой для покупателя – а зря.

Поскольку наша задача — обзор возможностей современных автосигнализаций и их характеристик, вернемся к алгоритмам кодировки двусторонней связи. Динамическое кодирование основано на использовании запрограммированного алгоритма изменения кодов, по которым распознают друг друга блоки автосигнализации – находящиеся в автомобиле и в брелоке. Самым известным, доступным и распространенным среди способов динамической шифровки является KeeLoq (запатентован американской компанией Microchip Inc.). KeeLoq популярен среди производителей автосигнализаций благодаря своей недорогой лицензии (или возможностью пиратского использования), надежности, дешевым кодерам KeeLoq, из-за малых размеров отлично подходящих для конструирования брелока. Однако благодаря его распространенности этот код доступен всем, в том числе злоумышленникам, которые при помощи печально известных кодграбберов (устройство считывания и копирования кода) без серьезных усилий открывают автомобиль защищенный такой сигнализацией. Цена на автосигнализацию с обратной связью с динамическим кодированием без особых функциональных изысков и без учета установки колеблется в пределах 70-90 у.е.
Диалоговое кодирование опирается все на тот же код KeeLoq, но не применяет стандартных вариантов, а варьирует его самые сложные возможности с использованием статических и динамической части алгоритма. Такие автосигнализации появились на рынке недавно и пока еще представляют определенные трудности для профессиональных взломщиков авто, их базовая цена находится на уровне 200-250 у.е. Автосигнализаций с элементами диалогового кодирования обратной связи на рынке не так много, однако можно предположить, что именно за ними — ближайшее будущее.
Недостаток и первых и вторых типов автомобильных сигнализаций с обратной связью – реализация этой связи происходит только по средствам их радиопередатчиков – что значительно ограничивает радиус действия двусторонней связи (порядка полукилометра в пределах “прямой видимости”). Но этого недостатка лишена следующая реализация обратной связи…
Автосигнализация с GSM-модулем позволяет владельцу практически всегда и везде (где имеется мобильная связь) «видеть» свой автомобиль благодаря постоянному общению с ним через сеть мобильной связи. Понятно, что это самый современный, сложный и дорогой принцип, реализуемый в защите машины путем сигнализации на сегодня, он еще не получил большого распространения. Его «минусы»: во-первых, дороговизна при покупке, установке и абонентском обслуживании, во-вторых, связь с автомобилем будет утеряна, как только машина попадет в зону «вне доступа» либо будет применено оборудование, глушащее сигнал. Базовая автосигнализация со встроенным GSM-модулем обойдется покупателю в среднем в 400-700 у.е.

Среди автосигнализаций с односторонней связью из широко известных можно назвать Challenger, двусторонней с аналоговым кодированием в базовом варианте – Pharaon, Sheriff. Среди таких «модных» сегодня автосигнализаций с обратной связью премиум-класса, как ScherKhan, Tomahawk, Pandora, StarLine только две последние можно отнести к разряду диалоговой кодировки, причем у StarLine функция автоматического контроля канала обратной связи полноценно работает только первые десять минут. Львиную долю их стоимости составляют увеличенная дальность каналов управления и оповещения, автозапуск двигателя и другие сервисные функции.

Немного о процессе подключения автосигнализации… для установки автосигнализации необходимо произвести вмешательство в электронные «мозги» автомобиля для подключения проводов к автоэлектропроводке и периферийным участкам сигнализационного оборудования (к сирене, светодиодному индикатору, концевым выключателям, всевозможным датчикам). Соответственно, чем больше всякого разного периферического оборудования владелец хочет установить на свой автомобиль вместе с сигнализацией, тем больше его машина будет «раскурочена». Возвращение деталей салона и кузова на свои места после монтажа всех звеньев системы не всегда проходит гладко, оставляя после себя царапины, вмятины — в общем, портя внешний вид… Поэтому установку автосигнализации (а тем более с дополнительными функциями) лучше поручить сертифицированным профессионалам.
Стоит отметить, что подключение такой функции, как автоматический запуск двигателя (автозапуск) требует отключения иммобилайзера, что не может не отразиться на общей безопасности автомобиля (и даже порой влечет за собой повышение тарифа по КАСКО, а то и отказ в страховании).

Чтобы не переплатить за то, что в будущем вряд ли потребуется, при выборе охранной автомобильной сигнализации необходимо изучить и оценить ее функциональность. Если хозяин авто испытывает потребность только в функции отпугивания «шпаны», то вполне подойдет сигнализация без обратной связи. При определенных запросах к удобству можно остановить свой выбор на автосигнализации с динамической обратной связью (коих подавляющее большинство на рынке), при этом сфокусировав внимание на дополнительном функционале. Так, человеку рассеянному пригодится опция автоматического включения сигнализации, а в морозное время года любому водителю приятно сесть в заранее прогретый автомобиль (опция автозапуска двигателя в отсутствие хозяина). Как было сказано выше, автосигнализация может по совместительству управлять большим количеством функций салонного комфорта, но увеличение числа «наворотов» существенно поднимет цену оборудования.

Важно помнить, что установка автосигнализации не является панацеей от профессионального взлома. Хорошим дополнением охранных функций для автомобиля послужат иммобилайзер (в настоящее время он штатно устанавливается почти всеми производителями на новые авто), механические средства защиты и … элементарная осторожность и аккуратность в выборе места для парковки.

CAR Сигнальные сети | Cell Signaling Technology

Pathway Описание:

Терапия Т-клетками с химерными антигенными рецепторами (CAR-T) — это многообещающая новая иммунотерапия, в которой для лечения рака используются генетически модифицированные клетки. Благодаря введению ex vivo и экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) собственные Т-клетки пациента конструируются для нацеливания на специфический поверхностный антиген, который служит молекулярным маяком для раковых клеток. При инфузии CAR-T-клетки действуют как «живой препарат», который идентифицирует и убивает клетки, экспрессирующие этот маркер, используя цитотоксические способности Т-клеток.Ключевой областью исследований в продолжающейся разработке CAR является полное понимание того, как они активируют нижестоящие сигнальные пути, чтобы максимизировать клиническую эффективность при одновременном снижении токсичности.

CAR представляют собой синтетические белки с модульной конструкцией, предназначенные для взаимодействия с эндогенными клеточными сигнальными каскадами, которые вызывают функции эффекторных Т-клеток, включая усиленную пролиферацию, высвобождение цитокинов и цитотоксичность. CAR связываются с интересующей мишенью через внеклеточный домен распознавания антигена (ARD), который состоит из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), который связывает вариабельные области легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела.scFv связан с трансмембранной частью рецептора спейсерным доменом, длина которого напрямую влияет на аффинность связывания ARD. Трансмембранный домен, обычно полученный из CD8 или CD28, прикрепляет CAR к мембране Т-клетки и соединяет ARD с внутриклеточными сигнальными участками рецептора. Оптимальный состав внутриклеточной области CAR является активной областью исследований, поскольку вариации количества и длины этих доменов могут резко изменить противоопухолевое действие CAR-T.Текущее поколение рецепторов состоит из домена активации и одного или нескольких костимулирующих доменов, которые служат для передачи событий связывания лиганда для изменения программ транскрипции Т-клеток посредством вовлечения множества нижестоящих сигнальных сетей. Домен активации, полученный из цепи CD3ζ Т-клеточного рецептора, является общей чертой внутриклеточной части CAR, способной инициировать передачу сигналов для управления цитотоксическими функциями Т-клеток. Считается, что добавление костимулирующих доменов — либо из семейства рецепторов CD28, либо из семейства рецепторов фактора некроза опухоли (4-1BB, OX40 или CD27) — повышает эффективность CAR-T за счет усиления секреции цитокинов, а также пролиферации CAR-T и упорство.

Включение различных функциональных доменов во внутриклеточную часть позволяет CAR повторять интегрированные события передачи сигналов Т-клеточного рецептора с помощью одной цепи рецептора. Ключевой посттрансляционной модификацией, которая создается при связывании лиганда, является фосфорилирование CD3ζ, которое, в свою очередь, рекрутирует ассоциированную с дзета-цепью протеинкиназу 70 (Zap-70), чтобы способствовать сборке нижестоящих адаптерных и каркасных белков. Параллельно костимулирующие модули инициируют передачу сигналов через пути PI3K/AKT, фактор 2, ассоциированный с рецептором TNF (TRAF2)/p38MAPK, и JNK.В совокупности эти сигнальные события сходятся на критических модуляторах транскрипции, включая NF-κB, NFAT, STAT3, JUN и FOS, чтобы управлять изменениями в экспрессии генов, связанными с активацией Т-клеток и эффекторной функцией.

В то время как предыдущие теории предполагали, что отдельные костимулирующие домены передают сигналы через различные механизмы, недавний фосфопротеомный анализ передачи сигналов CAR предполагает, что вместо этого они изменяют кинетику активации и интенсивность многих одних и тех же сигнальных молекул (Salter et al., 2018). Однако эффекты, наблюдаемые в этом исследовании, могут зависеть от контекста, поскольку независимая оценка интерактома CAR и сигналсом выявила значительные различия в связи с сигнальными молекулами и активацией пути между CAR, содержащими вариабельные внутриклеточные области (Ramello et al., 2019). Эти результаты подчеркивают необходимость полной оценки взаимосвязи между конструкцией CAR и внутриклеточными сигнальными событиями, которые они контролируют, чтобы оптимизировать эффективность терапии CAR-T-клетками.

Передача сигналов от Т-клеточных рецепторов (TCR) и химерных антигенных рецепторов (CAR) на Т-клетках

  • Gonzalez, H., Hagerling, C. & Werb, Z. Роли иммунной системы при раке: от возникновения опухоли до метастазирования прогресс. Гены Дев. 32 , 1267–1284 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hanson, H.L. et al. Эрадикация установленных опухолей с помощью адоптивной иммунотерапии CD8+ T-клетками. Иммунитет 13 , 265–276 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Каламс, С. А. и Уокер, Б. Д. Критическая потребность в помощи CD4 для поддержания эффективного ответа цитотоксических Т-лимфоцитов. Дж. Экспл. Мед. 188 , 2199–2204 (1998).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Пардолл, Д.М. и Топалян С.Л. Роль ответов CD4+ Т-клеток в противоопухолевом иммунитете. Курс. мнение Иммунол. 10 , 588–594 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Шанкаран В. и др. IFNgamma и лимфоциты препятствуют развитию первичной опухоли и формируют иммуногенность опухоли. Природа 410 , 1107–1111 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Мацусита, Х.и другие. Анализ экзома рака выявляет Т-клеточно-зависимый механизм иммуноредактирования рака. Природа 482 , 400–404 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Тенг, М. В., Галон, Дж., Фридман, У. Х. и Смит, М. Дж. От мышей к людям: разработки в области иммуноредактирования рака. Дж. Клин. Инвестировать. 125 , 3338–3346 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Беккер, М.Л. и др. Экспрессия гибридного белка рецептора иммуноглобулина-Т-клеток у трансгенных мышей. Cell 58 , 911–921 (1989).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Говерман, Дж. и др. Белки химерного иммуноглобулина-Т-клеточного рецептора образуют функциональные рецепторы: значение для образования и активации комплекса Т-клеточного рецептора. Cell 60 , 929–939 (1990).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гросс Г., Вакс, Т. и Эшхар, З. Экспрессия химерных молекул иммуноглобулина-Т-клеточного рецептора в качестве функциональных рецепторов со специфичностью типа антител. Проц. Натл. акад. науч. США 86 , 10024–10028 (1989).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Gascoigne, N.R., Goodnow, C.C., Dudzik, K.I., Oi, V.T. & Davis, M.M. Секреция химерного белка Т-клеточный рецептор-иммуноглобулин. Проц.Натл. акад. науч. США 84 , 2936–2940 (1987).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Neuberger, M.S., Williams, G.T. & Fox, R.O. Рекомбинантные антитела, обладающие новыми эффекторными функциями. Природа 312 , 604–608 (1984).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Траунекер, А., Luke, W. & Karjalainen, K. Растворимые молекулы CD4 нейтрализуют вирус иммунодефицита человека типа 1. Nature 331 , 84–86 (1988).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Smith, D.H. et al. Блокирование инфекционности ВИЧ-1 растворимой секретируемой формой антигена CD4. Наука 238 , 1704–1707 (1987).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Моррисон, С.Л., Джонсон, М.Дж., Герценберг, Л.А. и Ои, В.Т. Химерные молекулы антител человека: антигенсвязывающие домены мыши с доменами константной области человека. Проц. Натл. акад. науч. США 81 , 6851–6855 (1984).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Bird, R. E. et al. Одноцепочечные антигенсвязывающие белки. Наука 242 , 423–426 (1988).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хьюстон, Дж.С. и др. Белковая инженерия сайтов связывания антител: восстановление специфической активности одноцепочечного аналога Fv против дигоксина, полученного в Escherichia coli . Проц. Натл. акад. науч. США 85 , 5879–5883 (1988).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Irving, B. A. & Weiss, A. Цитоплазматического домена дзета-цепи Т-клеточного рецептора достаточно для соединения с путями передачи сигнала, связанными с рецептором. Cell 64 , 891–901 (1991).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Эшхар З., Вакс Т., Гросс Г. и Шиндлер Д. Г. Специфическая активация и нацеливание на цитотоксические лимфоциты посредством химерных одиночных цепей, состоящих из доменов, связывающих антитело, и гамма- или дзета-субъединиц иммуноглобулина и Т. -клеточные рецепторы. Проц. Натл. акад. науч. США 90 , 720–724 (1993).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Sadelain, M., Riviere, I. & Brentjens, R. Нацеливание на опухоли с помощью генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Нац. Преподобный Рак 3 , 35–45 (2003).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hombach, A. et al. Опухолеспецифическая активация Т-клеток рекомбинантными иммунорецепторами: передача сигналов CD3 и костимуляция CD28 одновременно необходимы для эффективной секреции IL-2 и могут быть интегрированы в одну комбинированную молекулу сигнального рецептора CD28/CD3. Дж. Иммунол. 167 , 6123–6131 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Kochenderfer, J. N. et al. Эрадикация клеток В-линии и регрессия лимфомы у пациента, получавшего аутологичные Т-клетки, генетически сконструированные для распознавания CD19. Кровь 116 , 4099–4102 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Портер Д.Л., Левин Б.Л., Калос М., Багг А. и Джун С.Х. Модифицированные химерным антигенным рецептором Т-клетки при хроническом лимфоидном лейкозе. Н. англ. Дж. Мед. 365 , 725–733 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мод, С. Л. и др. Тисагенлеклеуцел у детей и молодых людей с В-клеточным лимфобластным лейкозом. Н. англ. Дж. Мед. 378 , 439–448 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Джун, С. Х. и Садлен, М. Терапия химерными антигенными рецепторами. Н. англ. Дж. Мед. 379 , 64–73 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Davis, M.M. & Bjorkman, P.J. Гены рецептора Т-клеточного антигена и распознавание Т-клеток. Природа 334 , 395–402 (1988).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Рудольф, М. Г., Стэнфилд, Р. Л. и Уилсон, И. А. Как TCR связывают MHC, пептиды и корецепторы. год. Преподобный Иммунол. 24 , 419–466 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Кабелиц Д., Маришен Л., Оберг Х.-Х., Холтмайер В. и Веш Д. Эпителиальная защита с помощью γδ Т-клеток. Междунар. Арка Аллергия Иммунол. 137 , 73–81 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гао, Г. Ф. и Якобсен, Б. К. Молекулярные взаимодействия корецептора CD8 и MHC класса I: молекулярная основа функциональной координации с Т-клеточным рецептором. Иммунол. Сегодня 21 , 630–636 (2000 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гао, Г.Ф., Рао З. и Белл Дж. И. Молекулярная координация рецепторов αβ Т-клеток и корецепторов CD8 и CD4 при распознавании ими лигандов пептид-MHC. Тренды Иммунол. 23 , 408–413 (2002).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Yachi, P.P., Ampudia, J., Gascoigne, N.R. & Zal, T. Нестимулирующие пептиды способствуют антиген-индуцированному взаимодействию CD8-T-клеточных рецепторов в иммунологическом синапсе. Нац. Иммунол. 6 , 785–792 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Zhao, X. et al. Нестимулирующий пептид-MHC усиливает специфические антиген-специфические ответы Т-клеток человека путем усиления проксимальной передачи сигналов TCR. Нац. коммун. 9 , 2716 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Паласиос, Э.H. & Weiss, A. Функция киназ семейства Src, Lck и Fyn, в развитии и активации Т-клеток. Онкоген 23 , 7990–8000 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Нерретер, Т. и др. Микроскопия со сверхвысоким разрешением выявляет сверхнизкую экспрессию CD19 на клетках миеломы, которая запускает элиминацию CD19 CAR-T. Нац. коммун. 10 , 3137 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Брамешхубер, М.и другие. Мономерные TCR управляют распознаванием Т-клеточного антигена. Нац. Иммунол. 19 , 487–496 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Chang, Z.L. et al. Перепрограммирование ответов Т-клеток на растворимые факторы с помощью химерных антигенных рецепторов. Нац. хим. биол. 14 , 317–324 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • млн лет, X.и другие. Инженерия интерлейкина-23 улучшает функцию Т-клеток CAR в солидных опухолях. Нац. Биотехнолог. 38 , 448–459 (2020).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Feng, Y., Reinherz, E.L. & Lang, M.J. Механосенсорные рецепторы Т-клеток вытесняют последовательное взаимодействие. Тренды Иммунол. 39 , 596–609 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Тишер Д.К. и Вайнер, О. Д. Настройка периода полураспада лиганда на основе света поддерживает кинетическую модель корректуры передачи сигналов Т-клеток. eLife 8 , e42498 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Дэвис, С. Дж. и ван дер Мерве, П. А. Модель кинетической сегрегации: запуск TCR и не только. Нац. Иммунол. 7 , 803–809 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Чоудхури, К., Wiseman, D., Brown, M.H., Gould, K. & van der Merwe, P.A. Запуск Т-клеточного рецептора критически зависит от размеров его лиганда пептид-MHC. Природа 436 , 578–582 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Чоудхури, К. и др. Размеры комплекса пептид-большой гистосовместимости контролируют проксимальный баланс киназы-фосфатазы во время активации Т-клеток. Дж. Биол.хим. 284 , 26096–26105 (2009 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Cordoba, S.P. et al. Большие эктодомены CD45 и CD148 регулируют их сегрегацию и ингибирование лигированного Т-клеточного рецептора. Кровь 121 , 4295–4302 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Джеймс, Дж.Р. и Вейл, Р. Д. Биофизический механизм запуска рецептора Т-клеток в реконструированной системе. Природа 487 , 64–69 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ника, К. и др. Конститутивно активная киназа Lck в Т-клетках управляет передачей сигнала антигенного рецептора. Иммунитет 32 , 766–777 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Нель А.E. Активация Т-клеток через антигенный рецептор. Часть 1: сигнальные компоненты, сигнальные пути и интеграция сигнала в синапсе Т-клеточного антигенного рецептора. J. Аллергическая клиника. Иммунол. 109 , 758–770 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Denny, M. F., Patai, B. & Straus, D. B. Дифференциальная передача сигналов Т-клеточного антигенного рецептора, опосредованная киназами семейства Src Lck и Fyn. Мол. Клетка. биол. 20 , 1426–1435 (2000).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Weiss, A. & Littman, D.R. Передача сигналов антигенными рецепторами лимфоцитов. Cell 76 , 263–274 (1994).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Касас, Дж. и др. Задействованный лиганд TCR запускается Lck, не связанным с корецептором CD8. Нац. коммун. 5 , 5624 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Гаскойн Н.Р., Касас Дж., Бжостек Дж. и Рыбакин В. Инициация фосфорилирования TCR и передача сигнала. Перед. Иммунол. 2 , 72 (2011).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Цзян Н.и другие. Двухэтапные кооперативные взаимодействия Т-клеточный рецептор-пептид главного комплекса гистосовместимости-тримолекулярные взаимодействия CD8 усиливают дискриминацию антигена. Иммунитет 34 , 13–23 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Самельсон, Л. Э. Передача сигнала, редактируемая рецептором антигена Т-клеток: роль адаптерных белков. год. Преподобный Иммунол. 20 , 371–394 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ло, В. Л. и др. Lck способствует Zap70-зависимому фосфорилированию LAT, связывая Zap70 с LAT. Нац. Иммунол. 19 , 733–741 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Смит-Гарвин, Дж. Э., Корецки, Г. А. и Джордан, М. С. Активация Т-клеток. год. Преподобный Иммунол. 27 , 591–619 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Lesourne, R. et al. Themis, специфический для Т-клеток белок, важный для позднего развития тимоцитов. Нац. Иммунол. 10 , 840–847 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Джонсон, А.Л. и др. Themis является членом нового семейства генов Metazoan и необходим для завершения положительного отбора тимоцитов. Нац. Иммунол. 10 , 831–839 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Fu, G. et al. Фемида устанавливает порог сигнала для положительного и отрицательного отбора в развитии Т-клеток. Природа 504 , 441–445 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Чой С.и другие. THEMIS усиливает передачу сигналов TCR и обеспечивает положительный отбор путем селективного ингибирования фосфатазы SHP-1. Нац. Иммунол. 18 , 433–441 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Пастер В. и др. Комплекс THEMIS:SHP1 способствует выживанию Т-клеток. EMBO J. 34 , 393–409 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Фу, Г.и другие. Themis контролирует отбор тимоцитов посредством регуляции передачи сигналов, опосредованной Т-клеточным антигенным рецептором. Нац. Иммунол. 10 , 848–856 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Liu, S.K., Fang, N., Koretzky, G.A. & McGlade, C.J. Гематопоэтически специфичный адапторный белок gads функционирует в передаче сигналов Т-клеток посредством взаимодействия с адаптерами SLP-76 и LAT. Курс. биол. 9 , 67–75 (1999).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Шим, Э. К., Юнг, С. Х. и Ли, Дж. Р. Роль двух адаптерных молекул SLP-76 и LAT в сигнальном пути PI3K в активированных Т-клетках. Дж. Иммунол. 186 , 2926–2935 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Богин Ю., Ainey, C., Beach, D. & Yablonski, D. SLP-76 опосредует и поддерживает активацию киназы семейства Tec ITK посредством индуцированной Т-клеточным антигенным рецептором ассоциации между SLP-76 и ITK. Проц. Натл. акад. науч. США 104 , 6638–6643 (2007 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Солтер, А. И. и др. Фосфопротеомный анализ передачи сигналов химерного антигенного рецептора выявляет кинетические и количественные различия, влияющие на функцию клетки. науч. Сигнал. 11 , eaat6753 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Harris, D. T. et al. Сравнение активности Т-клеток, опосредованной человеческими TCR и CAR, которые используют одни и те же домены распознавания. Дж. Иммунол. 200 , 1088–1100 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ватанабэ, К., Kuramitsu, S., Posey, A.D. Jr. & June, CH. Расширение терапевтического окна для CAR-T-клеточной терапии при солидных опухолях: известное и неизвестное в биологии CAR-T-клеток. Перед. Иммунол. 9 , 2486 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Гаскойн, Н. Р., Рыбакин, В., Акуто, О. и Брзостек, Дж. Сила сигнала TCR и развитие Т-клеток. год. преп.Сотовый Дев. биол. 32 , 327–348 (2016).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Daniels, M. A. et al. Порог отбора тимуса определяется компартментализацией передачи сигналов Ras/MAPK. Природа 444 , 724–729 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Karlsson, H. et al. Оценка внутриклеточной передачи сигналов нижестоящих химерных антигенных рецепторов. PLoS ONE 10 , e0144787 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Ramello, M.C. et al. Иммунопротеомный подход к характеристике интерактома и сигналосомы CAR. науч. Сигнал. 12 , eaap9777 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Рорс, Дж.A., Zheng, D., Graham, N.A., Wang, P. & Finley, S.D. Вычислительная модель химерных антигенных рецепторов объясняет кинетику сайт-специфического фосфорилирования. Биофиз. J. 115 , 1116–1129 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Гулати, П. и др. Аберрантный сигнал Lck посредством костимуляции CD28 усиливает антиген-специфическую функциональность и контроль опухоли с помощью перенаправленных Т-клеток с блокадой PD-1 у гуманизированных мышей. клин. Рак рез. 24 , 3981–3993 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Guedan, S. et al. Повышение устойчивости CAR Т-клеток с помощью костимуляции ICOS и 4-1BB. JCI Insight 3 , 96976 (2018 г.).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Gomes da Silva, D. et al. Прямое сравнение in vivo судьбы CD19-специфического химерного антигенного рецептора (CAR)-T-клеток второго и третьего поколения у пациентов с B-клеточной лимфомой: изменение токсичности тонической передачи сигналов. Кровь 128 , 1851 (2016).

    Артикул Google ученый

  • Сан, К. и др. Рекрутирование THEMIS-SHP1 с помощью 4-1BB настраивает LCK-опосредованное праймирование Т-клеток, перенаправленных на химерный антигенный рецептор. Раковая клетка 37 , 216–225 (2020).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hamieh, M. et al. Трогоцитоз и кооперативный лизинг CAR Т-клеток регулируют ускользание опухолевого антигена. Природа 568 , 112–116 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hui, E. et al. Т-клеточный костимулирующий рецептор CD28 является основной мишенью для ингибирования, опосредованного PD-1. Наука 355 , 1428–1433 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Золов С.Н., Ритберг С.П. и Бонифант С.Л. Активация белка 1 запрограммированной гибели клеток предпочтительно ингибирует клетки CD28.CAR-T. Цитотерапия 20 , 1259–1266 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Камфорст, А. О. и др. Спасение истощенных CD8 Т-клеток с помощью терапии, направленной на PD-1, зависит от CD28. Наука 355 , 1423–1427 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ван З.и другие. Ассоциация Lck, опосредованная трансмембранным доменом, лежит в основе байстандерной и костимулирующей передачи сигналов ICOS. Сотовый. Мол. Иммунол. 17 , 143–152 (2020).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Fooksman, D. R. et al. Функциональная анатомия активации Т-клеток и образования синапсов. год. Преподобный Иммунол. 28 , 79–105 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Спрингер, Т.А. Рецепторы адгезии иммунной системы. Природа 346 , 425–434 (1990).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Дастин, М. Л. Иммунологический синапс. Рак Иммунол. Рез. 2 , 1023–1033 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Корман, А. Дж., Peggs, K.S. & Allison J.P. Блокада контрольных точек при иммунотерапии рака , Vol. 90 297–339 (Эльзевир; 2006).

  • Yokosuka, T. et al. Пространственно-временная регуляция костимуляции Т-клеток микрокластерами TCR-CD28 и транслокацией протеинкиназы Cθ. Иммунитет 29 , 589–601 (2008).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мукерджи, М., Мейс, Э.М., Кэриси, А.Ф., Ахмед, Н. и Оранж, Дж.С. Подходы к количественной визуализации для изучения иммунологического синапса CAR. Мол. тер. 25 , 1757–1768 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Монкс, Ч.Р.Ф., Фрайберг, Б.А., Купфер, Х., Скиаки, Н. и Купфер, А. Трехмерное разделение супрамолекулярных активационных кластеров в Т-клетках. Природа 395 , 82–86 (1998).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Кампи, Г., Варма, Р. и Дастин, М.Л. Актин и микрокластеры Т-клеточных рецепторов, зависящие от комплекса агонистов МНС-пептид, в качестве каркасов для передачи сигналов. Дж. Экспл. Мед. 202 , 1031–1036 (2005).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Варма Р., Кампи Г., Yokosuka, T., Saito, T. & Dustin, M.L.T. Проксимальные сигналы клеточных рецепторов поддерживаются в периферических микрокластерах и заканчиваются в центральном надмолекулярном кластере активации. Иммунитет 25 , 117–127 (2006).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Сайто Т., Йокосука Т. и Хашимото-Танэ А. Динамическая регуляция активации и костимуляции Т-клеток с помощью микрокластеров TCR. ФЭБС Письмо. 584 , 4865–4871 (2010).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Zinselmeyer, B.H. et al. PD-1 способствует иммунному истощению, вызывая паралич подвижности противовирусных Т-клеток. Дж. Экспл. Мед. 210 , 757–774 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Йи, Дж., Wu, X.S., Crites, T. & Hammer, J.A. III Ретроградный поток актина и сокращение дуги актомиозина II управляют динамикой кластера рецепторов в иммунологическом синапсе в Т-клетках Jurkat. Мол. биол. Ячейка 23 , 834–852 (2012).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Wabnitz, G., Balta, E. & Samstag, Y. l-Plastin регулирует стабильность иммунного синапса наивных и эффекторных Т-клеток. Доп. биол. Регул. 63 , 107–114 (2017).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Джонсон, К.Г., Бромли, С.К., Дастин, М.Л. и Томас, М.Л. Супрамолекулярная основа для регуляции тирозинфосфатазы CD45 при устойчивой активации Т-клеток. Проц. Натл. акад. науч. США 97 , 10138–10143 (2000 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Симс, Т.Н. и др. Противоположные эффекты PKCtheta и WASp на нарушение симметрии и перемещение иммунологического синапса. Cell 129 , 773–785 (2007).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Давенпорт, А. Дж. и др. Т-клетки с химерным антигенным рецептором образуют неклассические и мощные иммунные синапсы, вызывающие быструю цитотоксичность. Проц. Натл. акад. науч. США 115 , E2068–E2076 (2018 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Xiong, W. et al. Иммунологический синапс предсказывает эффективность клеток химерного антигенного рецептора. Мол. тер. 26 , 963–975 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T. & Dustin, M.L. Проксимальные сигналы Т-клеточного рецептора сохраняются в периферических микрокластерах и заканчиваются в центральном надмолекулярном кластере активации. Иммунитет 25 , 117–127 (2006).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Давенпорт, А. Дж. и др. CAR-T-клетки вызывают последовательное уничтожение множества опухолевых клеток-мишеней. Рак Иммунол. Рез. 3 , 483–494 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Давенпорт, А.J. & Jenkins, MR. Программирование серийного убийцы: Т-клетки CAR образуют неклассические иммунные синапсы. Oncoscience 5 , 69–70 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Baeuerle, P. A. et al. Синтетические рецепторы TRuC взаимодействуют с полным рецептором Т-клеток для мощного противоопухолевого ответа. Нац. коммун. 10 , 2087 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Оффнер, С., Хофмайстер Р., Романюк А., Куфер П. и Бауэрле П.А. Индукция регулярных цитолитических Т-клеточных синапсов с помощью конструкций биспецифических одноцепочечных антител на MHC класса I-негативных опухолевых клетках. Мол. Иммунол. 43 , 763–771 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Helsen, C.W. et al. Химерный рецептор TAC кооптирует рецептор Т-клеток, обеспечивая надежную противоопухолевую активность без токсичности. Нац. коммун. 9 , 3049 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Чон, Б. Н. и др. Стабилизатор актина TAGLN2 потенцирует адоптивную Т-клеточную терапию, усиливая костимуляцию изнутри наружу посредством антигена-1, ассоциированного с функцией лимфоцитов. Онкоиммунология 7 , e1500674 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ван, Х.и другие. Леналидомид усиливает функцию Т-клеток, перенаправленных на химерный антигенный рецептор CS1, против множественной миеломы. клин. Рак рез. 24 , 106–119 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Джозеф, Н., Райхер, Б. и Барда-Саад, М. Петля обратной связи кальция и активация Т-клеток: как сети цитоскелета контролируют внутриклеточный поток кальция. Биохим. Биофиз. Acta 1838 , 557–568 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Льюис, Р. С. Механизмы передачи сигналов кальция в Т-лимфоцитах. год. Преподобный Иммунол. 19 , 497–521 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Schulze-Luehrmann, J. & Ghosh, S. Передача сигналов антиген-рецептора ядерному фактору каппа B. Immunity 25 , 701–715 (2006).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Macian, F. Белки NFAT: ключевые регуляторы развития и функционирования Т-клеток. Нац. Преподобный Иммунол. 5 , 472–484 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Рош М.И., Рамадас Р.А. и Медофф Б.Д. Роль CARMA1 в Т-клетках. Крит. Преподобный Иммунол. 33 , 219–243 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Sun, W. & Yang, J. Молекулярные основы индуцированной лизофосфатидной кислотой активации NF-kappaB. Сотовый. Сигнал. 22 , 1799–1803 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Хейден, М.С. и Гош, С. Общие принципы передачи сигналов NF-kappaB. Cell 132 , 344–362 (2008).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Руз, Дж. П., Молленауэр, М., Хо, М., Куросаки, Т. и Вайс, А. Необычное взаимодействие двух типов активаторов Ras, RasGRP и SOS, обеспечивает чувствительную и надежную активацию Ras в лимфоцитах. Мол. Клетка. биол. 27 , 2732–2745 (2007).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Роскоски Р. мл. Киназы ERK1/2 MAP: структура, функция и регуляция. Фарм. Рез. 66 , 105–143 (2012).

    КАС Статья Google ученый

  • Benmebarek, M.R. et al. Механизмы уничтожения Т-клеток химерного антигенного рецептора (CAR). Междунар. Дж.Мол. науч. 20 , E1283 (2019).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Лю, Ю. и др. Опосредованный гасдермином Е пироптоз клеток-мишеней CAR Т-клетками запускает синдром высвобождения цитокинов. науч. Иммунол. 5 , eaax7969 (2020).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Радд, К. Э., Тейлор, А.& Schneider, H. Экспрессия корецепторов CD28 и CTLA-4 и передача сигнала. Иммунол. Ред. 229 , 12–26 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Yoshinaga, S.K. et al. Костимуляция Т-клеток через B7RP-1 и ICOS. Природа 402 , 827–832 (1999).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Фос, К.и другие. Лигирование ICOS рекрутирует регуляторную субъединицу p50alpha PI3K в иммунологический синапс. Дж. Иммунол. 181 , 1969–1977 (2008).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Wikenheiser, D. J. & Stumhofer, J. S. Костимуляция ICOS: друг или враг? Перед. Иммунол. 7 , 304 (2016).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Эзенстен, Дж.Х., Хелоу, Ю. А., Чопра, Г., Вайс, А. и Блюстоун, Дж. А. Костимуляция CD28: от механизма к терапии. Иммунитет 44 , 973–988 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Cheng, Z. et al. Экспансия in vivo и противоопухолевая активность коинфузированных CD28- и 4-1BB-инженерных CAR-T-клеток у пациентов с В-клеточным лейкозом. Мол. тер. 26 , 976–985 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кеглер, А. и др. Т-клетки, привитые UniCAR 28/z, превосходят Т-клетки, трансдуцированные UniCAR BB/z, в условиях иммуносупрессии, опосредованной регуляторными Т-клетками. Онкоиммунология 8 , e1621676 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Вайнкове Р., Джордж П., Дасьям Н. и Маклеллан А. Д. Выбор костимулирующих доменов для химерных антигенных рецепторов: функциональные и клинические соображения. клин. Перевод Иммунол. 8 , e1049 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Kofler, D.M. et al. Костимуляция CD28 Нарушает эффективность перенаправленной противоопухолевой атаки Т-клеток в присутствии регуляторных Т-клеток, которую можно преодолеть, предотвращая активацию Lck. Мол. тер. 19 , 760–767 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Zheng, W. et al. PI3K оркестровка персистенции in vivo Т-клеток, модифицированных химерным антигенным рецептором. Лейкемия 32 , 1157–1167 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кавалекар, О.У. и др. Различная передача сигналов корецепторов регулирует специфические пути метаболизма и влияет на развитие памяти в CAR Т-клетках. Иммунитет 44 , 380–390 (2016).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Аджина, А. и Махер, Дж. Стратегии адресации тонической сигнализации химерных антигенных рецепторов. Мол. Рак Тер. 17 , 1795–1815 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кляйн Гелтинк, Р.И. и др. Митохондриальный прайминг с помощью CD28. Cell 171 , 385–397 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Eyquem, J. et al. Нацеливание CAR на локус TRAC с помощью CRISPR/Cas9 усиливает отторжение опухоли. Природа 543 , 113–117 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Харада Ю.и другие. Изменение одной аминокислоты в цитоплазматическом домене определяет активацию промотора IL-2 путем лигирования CD28, но не индуцируемого костимулятора (ICOS). Дж. Экспл. Мед. 197 , 257–262 (2003).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Guedan, S. et al. Химерные антигенные рецепторы на основе ICOS программируют биполярные клетки Th27/Th2. Кровь 124 , 1070–1080 (2014).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ward-Kavanagh, L.K., Lin, W.W., Sedy, J.R. & Ware, C.F. Надсемейство рецепторов TNF в ко-стимулирующих и ко-ингибирующих реакциях. Иммунитет 44 , 1005–1019 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • О, Х.С. и др. Передача сигналов 4-1BB усиливает первичную и вторичную популяционную экспансию CD8+ Т-клеток за счет максимизации аутокринной передачи сигналов рецепторов IL-2/IL-2. PLoS ONE 10 , e0126765 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Снелл, Л. М., Лин, Г. Х., Макферсон, А. Дж., Мораес, Т. Дж. и Уоттс, Т. Х. Внутренние эффекты GITR и 4-1BB на Т-клетки во время вирусной инфекции и иммунотерапии рака. Иммунол. Ред. 244 , 197–217 (2011).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Bartkowiak, T. & Curran, M. A. Агонисты 4-1BB: мультипотенциальные потенциаторы противоопухолевого иммунитета. Перед. Онкол. 5 , 117 (2015).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Тамада, К. и др.СВЕТ, TNF-подобная молекула, костимулирует пролиферацию Т-клеток и необходим для опосредованного дендритными клетками аллогенного Т-клеточного ответа. Дж. Иммунол. 164 , 4105–4110 (2000 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Milone, M.C. et al. Химерные рецепторы, содержащие домены передачи сигнала CD137, опосредуют повышенную выживаемость Т-клеток и повышенную противолейкемическую эффективность in vivo. Мол.тер. 17 , 1453–1464 (2009).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Сингх, Н. и др. Нарушение передачи сигналов рецептора смерти при лейкемии вызывает антиген-независимую резистентность, индуцируя дисфункцию CAR Т-клеток. Рак Дисков. 10 , 552–567 (2020).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Мамонкин М.и другие. Обратимая экспрессия трансгена уменьшает братоубийство и позволяет костимуляцию 4-1BB Т-клеток CAR, направленных на Т-клеточные злокачественные новообразования. Рак Иммунол. Рез. 6 , 47–58 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Kunkele, A. et al. Функциональная настройка CAR выявляет сигнальный порог, выше которого противоопухолевая активность CD8+ CTL ослабляется из-за клеточного Fas-FasL-зависимого AICD. Рак Иммунол.Рез. 3 , 368–379 (2015).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Nunoya, J. I., Masuda, M., Ye, C. & Su, L. Химерный антигенный рецептор T-клеток, несущий костимулирующий сигнальный домен медиатора проникновения вируса герпеса, проявляет высокую функциональную активность. Мол. тер. Онколитики 14 , 27–37 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Хомбах, А.A., Heiders, J., Foppe, M., Chmielewski, M. & Abken, H. Костимуляция OX40 химерным антигенным рецептором отменяет секрецию IL-10, индуцированную CD28 и IL-2, перенаправленными CD4(+) T-клетками. Онкоиммунология 1 , 458–466 (2012).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Fraietta, J.A. et al. Детерминанты ответа и устойчивости к CD19 химерному антигенному рецептору (CAR) Т-клеточной терапии хронического лимфоцитарного лейкоза. Нац. Мед. 24 , 563–571 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Siegel, A. M. et al. Критическая роль передачи сигналов фактора транскрипции STAT3 в развитии и поддержании памяти Т-клеток человека. Иммунитет 35 , 806–818 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Кагоя Ю.и другие. Новый химерный антигенный рецептор, содержащий сигнальный домен JAK-STAT, обеспечивает превосходные противоопухолевые эффекты. Нац. Мед. 24 , 352–359 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Гест, Р. Д. и др. Роль внеклеточных спейсерных областей в оптимальном дизайне химерных иммунных рецепторов: оценка четырех различных scFv и антигенов. Дж. Иммунотер. 28 , 203–211 (2005).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hombach, A. et al. Активация Т-клеток рекомбинантными иммунными рецепторами гамма-цепи FcepsilonRI: внеклеточный спейсерный домен ухудшает антиген-зависимую активацию Т-клеток, но не распознавание антигена. Джин Тер. 7 , 1067–1075 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Хомбах, А.А. и др. Активация Т-клеток антителоподобными иммунорецепторами: положение связывающего эпитопа внутри молекулы-мишени определяет эффективность активации перенаправленных Т-клеток. Дж. Иммунол. 178 , 4650–4657 (2007 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • James, S.E. et al. Антигенная чувствительность CD22-специфических химерных TCR модулируется расстоянием эпитопа-мишени от клеточной мембраны. Дж. Иммунол. 180 , 7028–7038 (2008 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Zah, E., Lin, M. Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C. & Chen, Y. Y. Т-клетки, экспрессирующие биспецифические химерные антигенные рецепторы CD19/CD20, предотвращают утечку антигена злокачественными В-клетками. Рак Иммунол. Рез. 4 , 498–508 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Цинь Х.и другие. Эрадикация B-ALL с использованием Т-клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор, нацеленных на онкобелок TSLPR. Кровь 126 , 629–639 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ирвин, Д. Дж., Пурбху, М. А., Крогсгаард, М. и Дэвис, М. М. Прямое наблюдение за распознаванием лиганда Т-клетками. Природа 419 , 845–849 (2002).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Фрай Т.Дж. и др. CD22-нацеленные CAR Т-клетки индуцируют ремиссию B-ALL, который является наивным или резистентным к CD19-нацеленной иммунотерапии CAR. Нац. Мед. 24 , 20–28 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Сан, Б. и др. Эрадикация гепатоцеллюлярной карциномы с помощью CAR-T-клеток на основе NKG2D. Рак Иммунол. Рез. 7 , 1813–1823 (2019).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Стоун, Дж.Д., Агген, Д. Х., Шитингер, А., Шрайбер, Х. и Кранц, Д. М. Шкала чувствительности для нацеливания на Т-клетки с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR) и биспецифических привлекателей Т-клеток (BiTE). Онкоиммунология 1 , 863–873 (2012).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ватанабэ, К. и др. Плотность антигена-мишени регулирует эффективность анти-CD20-CD28-CD3 дзета-химерных антигенных рецепторов, модифицированных эффекторными CD8+ Т-клетками. Дж. Иммунол. 194 , 911–920 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hoseini, S.S. & Cheung, N.V. Иммунотерапия гепатоцеллюлярной карциномы с использованием химерных антигенных рецепторов и биспецифических антител. Рак Летт. 399 , 44–52 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Орен, Р.и другие. Функциональное сравнение сконструированных Т-клеток, несущих нативный TCR, с химерными антигенными рецепторами на основе TCR-подобных антител указывает на пороги аффинности/авидности. Дж. Иммунол. 193 , 5733–5743 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Роселли, Э. и др. Инженерия CAR-T: оптимизация передачи сигнала и эффекторных механизмов. BioDrugs 33 , 647–659 (2019).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Chmielewski, M., Hombach, A., Heuser, C., Adams, G.P. & Abken, H.T. Активация клеток антителоподобными иммунорецепторами: увеличение аффинности домена одноцепочечного фрагмента выше порогового значения не увеличивает T активация клеток против антиген-позитивных клеток-мишеней, но снижает селективность. Дж. Иммунол. 173 , 7647–7653 (2004).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Карузо, Х.Г. и др. Настройка чувствительности CAR к плотности EGFR ограничивает распознавание нормальной ткани при сохранении мощной противоопухолевой активности. Рак Res. 75 , 3505–3518 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Лю Х. и др. Аффинно настроенные Т-клетки химерного антигенного рецептора ErbB2 или EGFR демонстрируют повышенный терапевтический индекс против опухолей у мышей. Рак Res. 75 , 3596–3607 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Талавера, А. и др. Нимотузумаб, противоопухолевое антитело, нацеленное на рецептор эпидермального фактора роста, блокирует связывание лиганда, обеспечивая при этом активную конформацию рецептора. Рак Res. 69 , 5851–5859 (2009 г.).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Линн Р.С. и др. Высокоаффинные FRbeta-специфические CAR Т-клетки уничтожают ОМЛ и нормальный миелоидный рост без токсичности HSC. Лейкемия 30 , 1355–1364 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Walker, A. J. et al. Плотность опухолевого антигена и рецептора регулирует эффективность химерного антигенного рецептора, нацеленного на киназу анапластической лимфомы. Мол. тер. 25 , 2189–2201 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Hudecek, M. et al. Аффинность рецептора и модификации внеклеточного домена влияют на распознавание опухоли ROR1-специфическими Т-клетками химерного антигенного рецептора. клин. Рак рез. 19 , 3153–3164 (2013).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Смит, Э.Л. и др. GPRC5D является мишенью для иммунотерапии множественной миеломы рационально сконструированными Т-клетками CAR. науч. Перевод Мед. 11 , eaau7746 (2019).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Long, A.H. et al. Костимуляция 4-1ВВ уменьшает истощение Т-клеток, вызванное тонической передачей сигналов химерных антигенных рецепторов. Нац. Мед. 21 , 581–590 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Хегде, М.и другие. Тандемные Т-клетки CAR, нацеленные на HER2 и IL13Ralpha2, уменьшают утечку опухолевого антигена. Дж. Клин. Инвестировать. 126 , 3036–3052 (2016).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Ляди, И. и др. Отдельные подвижные CD4(+) Т-клетки могут участвовать в эффективном множественном уничтожении посредством конъюгации с несколькими опухолевыми клетками. Рак Иммунол. Рез. 3 , 473–482 (2015).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Зоммермейер, Д.и другие. Модифицированные химерным антигенным рецептором Т-клетки, происходящие из определенных субпопуляций CD8+ и CD4+, обладают превосходной противоопухолевой реактивностью in vivo. Лейкемия 30 , 492–500 (2016).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Yang, Y. et al. Вовлечение TCR отрицательно влияет на CD8, но не CD4 CAR Т-клеток и клиренс лейкемии. науч. Перевод Мед. 9 , eaag1209 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Cheadle, E. J. et al. Дифференциальная роль цитокинов Th2 и Th3 в аутотоксичности, вызванной CD19-специфическими Т-клетками химерного антигенного рецептора второго поколения на мышиной модели. Дж. Иммунол. 192 , 3654–3665 (2014).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ло, И.и другие. Различия в реакции между CD4(+) и CD8(+) Т-клетками человека во время костимуляции CD28: последствия для терапии на основе иммунных клеток и исследования, связанные с экспансией дважды положительных Т-клеток при старении. клин. Иммунол. 96 , 187–197 (2000).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Zhang, H. et al. 4-1BB превосходит костимуляцию CD28 для образования CD8+ цитотоксических лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии. Дж. Иммунол. 179 , 4910–4918 (2007 г.).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Chan, W.K. et al. CD45RA-негативные Т-клетки, перенаправленные на химерный антигенный рецептор, обладают мощной антилейкемической реакцией и реакцией памяти на патогены без активности «трансплантат против хозяина». Лейкемия 29 , 387–395 (2015).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Користка С.и другие. Прививка регуляторных Т-клеток человека с технологией гибкого модульного химерного антигенного рецептора. J. Аутоиммун. 90 , 116–131 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Hombach, A. A. & Abken, H. Большинство из них, но некоторые нет: CD4(+)CD25(-) T-клетки, но не CD4(+)CD25(+) Treg-клетки, являются цитолитическими при перенаправлении химерный антигенный рецептор (CAR). Раки 9 , 112 (2017).

    Центральный пабмед Статья КАС Google ученый

  • Boroughs, A.C. et al. Домены костимуляции химерного антигенного рецептора модулируют регуляторную функцию Т-клеток человека. JCI Insight 5 , e126194 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Benveniste, P. M. et al. Генерация и молекулярное распознавание ассоциированных с меланомой антиген-специфических гамма-дельта Т-клеток человека. науч. Иммунол. 3 , eaav4036 (2018).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Vermijlen, D., Gatti, D., Kouzeli, A., Rus, T. & Eberl, M. gammadelta Реакции Т-клеток: сколько лигандов потребуется, пока мы не узнаем? Семин. Сотовый Дев. биол. 84 , 75–86 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Мирзаи Х.R., Mirzaei, H., Lee, S.Y., Hadjati, J. & Till, B.G. Перспективы химерного антигенного рецептора (CAR) gammadelta T-клеток: потенциальное изменение правил игры для адоптивной T-клеточной иммунотерапии рака. Рак Летт. 380 , 413–423 (2016).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Fisher, J. et al. Предотвращение целевого внеопухолевого активации с помощью химерного антигенного рецептора, предназначенного только для костимуляции. Мол. тер. 25 , 1234–1247 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Capsomidis, A. et al. Гамма-дельта Т-клетки человека, сконструированные с помощью химерного антигенного рецептора: повышенная цитотоксичность с сохранением перекрестной презентации. Мол. тер. 26 , 354–365 (2018).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Себастьен З., Принц И., Дешане-Мервиль Дж., Сильва-Сантос Б. и Кубалл Дж. Преобразование гамма-дельта (γδ) Т-клеток и их рецепторов в терапию раковых клеток. Нац. Преподобный Друг Дисков. 19 , 169–184 (2019).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Дуфва, О. и др. Интегрированное профилирование лекарств и скрининг CRISPR позволяют выявить основные пути цитотоксичности CAR Т-клеток. Кровь 135 , 597–609 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Дуган, М. и др. Ингибиторы IAP усиливают костимуляцию, способствуя иммунитету к опухолям. Дж. Экспл. Мед. 207 , 2195–2206 (2010).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мичи, Дж. и др. Антагонизм IAP повышает эффективность CAR T-клеток. Рак Иммунол. Рез. 7 , 183–192 (2019).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Cui, J. et al. Ингибирование PP2A с помощью LB-100 повышает эффективность терапии CAR-T-клетками против глиобластомы. Раки 12 , 139 (2020).

    Центральный пабмед Статья КАС Google ученый

  • Ким, Э. Х. и Суреш, М. Роль передачи сигналов PI3K/Akt в дифференцировке Т-клеток CD8 памяти. Перед. Иммунол. 4 , 20 (2013).

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

  • Местерманн, К. и др. Ингибитор тирозинкиназы дазатиниб действует как фармакологический выключатель для CAR Т-клеток. науч. Перевод Мед. 11 , eaau5907 (2019).

    ПабМед Статья КАС Google ученый

  • Вебер, Э.В. и др. Фармакологический контроль функции CAR-T-клеток с помощью дазатиниба. Кровь Adv. 3 , 711–717 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Дахмани, А. и др. TGFbeta программирует центральную дифференцировку памяти в ex vivo-стимулированных Т-клетках человека. Рак Иммунол. Рез. 7 , 1426–1439 (2019).

    ПабМед Статья Google ученый

  • Сингх, Х.и другие. Перепрограммирование CD19-специфических Т-клеток с передачей сигналов IL-21 может улучшить адоптивную иммунотерапию злокачественных новообразований В-линии. Рак Res. 71 , 3516–3527 (2011).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Cieri, N. et al. IL-7 и IL-15 инструктируют генерацию стволовых Т-клеток памяти человека из наивных предшественников. Кровь 121 , 573–584 (2013).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Соколски Дж.Т. и др. Селективное нацеливание на сконструированные Т-клетки с использованием ортогональных комплексов цитокин-рецептор ИЛ-2. Наука 359 , 1037–1042 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Мардиана, С. и др. Многофункциональная роль адъювантной терапии анти-4-1ВВ в усилении противоопухолевого ответа Т-клетками с химерными антигенными рецепторами. Рак Res. 77 , 1296–1309 (2017).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Гроссер Р., Черкасский Л., Чинтала Н. и Адусумилли П. С. Комбинированная иммунотерапия CAR Т-клетками и блокада контрольных точек для лечения солидных опухолей. Раковая клетка 36 , 471–482 (2019).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Marshall, N. et al.Гомеостатическая активация противоопухолевых Т-клеток не связана с гомеостатическим ингибированием посредством блокады контрольных точек. Рак Дисков. 9 , 1520–1537 (2019).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Кондо Т. и др. Ось NOTCH-FOXM1 играет ключевую роль в митохондриальном биогенезе в индукции CAR-T-клеток, подобных памяти стволовых клеток человека. Рак Res. 80 , 471–483 (2020).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Akahori, Y. et al. Противоопухолевая активность CAR-T-клеток, нацеленных на внутриклеточный онкопротеин WT1, может быть усилена вакцинацией. Кровь 132 , 1134–1145 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Slaney, C.Y. et al. Т-клетки с химерным антигенным рецептором двойной специфичности и непрямая вакцина уничтожают множество крупных солидных опухолей в условиях иммунокомпетентности, собственных антигенов. клин. Рак рез. 23 , 2478–2490 (2017).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Feucht, J. et al. Калибровка потенциала активации CAR направляет альтернативные судьбы Т-клеток и терапевтическую эффективность. Нац. Мед. 25 , 82–88 (2019).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Коллинсон-Паутц, М.Р. и др. Конститутивно активная костимуляция MyD88/CD40 усиливает размножение и эффективность Т-клеток химерного антигенного рецептора, нацеленных на гематологические злокачественные новообразования. Лейкемия 33 , 2195–2207 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Шум Т. и др. Конститутивная передача сигналов от сконструированного рецептора IL7 способствует длительной элиминации опухоли Т-клетками, перенаправленными на опухоль. Рак Дисков. 7 , 1238–1247 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D. & Brentjens, R. J. Т-клетки Armored CAR повышают противоопухолевую эффективность и преодолевают микроокружение опухоли. науч. Респ. 7 , 10541 (2017).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

  • Хертон, Л.В. и др. Связанный IL-15 усиливает противоопухолевую активность и способствует субпопуляции памяти стволовых клеток в опухолеспецифических Т-клетках. Проц. Натл. акад. науч. США 113 , E7788–E7797 (2016).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Ху, Б. и др. Усиление противоопухолевого иммунитета CAR Т-клетками человека и мыши, секретирующими IL-18. Cell Rep. 20 , 3025–3033 (2017).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Винаница, Н.и другие. Специфическая стимуляция Т-лимфоцитов эритропоэтином для адоптивной иммунотерапии. Кровь 135 , 668–679 (2019).

    Артикул Google ученый

  • Моцеллин С., Ван Э. и Маринкола Ф. М. Цитокины и иммунный ответ в микроокружении опухоли. Дж. Иммунотер. 24 , 392–407 (2001).

    КАС пабмед Статья Google ученый

  • Накадзима, М., Сакода Ю., Адачи К., Нагано Х. и Тамада К. Повышение выживаемости Т-клеток, сконструированных с использованием химерного антигенного рецептора (CAR-T), и опухолеспецифических Т-клеток, вызванное одиночным анти-программируемым белком клеточной гибели 1 CAR-T-клетки, продуцирующие вариабельный фрагмент цепи. Науки о раке. 110 , 3079–3088 (2019).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Сукумаран, С. и др. Повышение эффективности и специфичности сконструированных Т-клеток для лечения рака. Рак Дисков. 8 , 972–987 (2018).

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Байгайн П. и др. Терапия CAR-Т-клетками рака молочной железы: использование опухолевой среды для активации Т-клеток. Дж. Иммунотер. Рак 6 , 34 (2018).

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

  • Линн Р.С. и др. Сверхэкспрессия c-Jun в CAR Т-клетках индуцирует устойчивость к истощению. Природа 576 , 293–300 (2019).

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

  • Сравнительный анализ передачи сигналов TCR и CAR дает информацию о конструкциях CAR с превосходной антигенной чувствительностью и функцией in vivo

    Сравнительное исследование

    .2021 24 августа; 14 (697): eabe2606. doi: 10.1126/scisignal.abe2606. Александр I Солтер 1 2 , Ануша Раджан 3 2 , Джейкоб Дж. Кеннеди 2 , Ричард Джи Айви 2 , Сара Шелби 4 , Изабель Люнг 3 2 , Меган Л. Темплтон 3 2 , Вишака Мухунтан 3 2 , Валентин Вуайе 5 6 , Даниэль Зоммермейер 3 2 , Джеффри Р. Уайтакер 2 , Рафаэль Готтардо 5 , Сара Л. Витч 4 , Аманда Г. Полович 2 , Стэнли Р. Ридделл 1 2 7

    Принадлежности Расширять

    Принадлежности

    • 1 Программа по иммунологии, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США[email protected] [email protected]
    • 2 Отдел клинических исследований, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 3 Программа по иммунологии, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 4 Кафедра биофизики, Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, 48109, США.
    • 5 Отдел вакцин и инфекционных заболеваний, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 6 Кейптаун Лаборатория иммунологии HVTN, Научно-исследовательский институт центра Хатчинсона, Южная Африка, NPC (HCRISA), Кейптаун 8001, Южная Африка.
    • 7 Медицинский факультет, Медицинская школа Вашингтонского университета, Сиэтл, Вашингтон, 98195, США.
    Бесплатная статья ЧВК

    Элемент в буфере обмена

    Сравнительное исследование

    Александр I Солтер и др.Научный сигнал. .

    Бесплатная статья ЧВК Показать детали Показать варианты

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    .2021 24 августа; 14 (697): eabe2606. doi: 10.1126/scisignal.abe2606.

    Авторы

    Александр I Солтер 1 2 , Ануша Раджан 3 2 , Джейкоб Дж. Кеннеди 2 , Ричард Джи Айви 2 , Сара Шелби 4 , Изабель Люнг 3 2 , Меган Л. Темплтон 3 2 , Вишака Мухунтан 3 2 , Валентин Вуайе 5 6 , Даниэль Зоммермейер 3 2 , Джеффри Р. Уайтакер 2 , Рафаэль Готтардо 5 , Сара Л. Витч 4 , Аманда Г. Полович 2 , Стэнли Р. Ридделл 1 2 7

    Принадлежности

    • 1 Программа по иммунологии, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США[email protected] [email protected]
    • 2 Отдел клинических исследований, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 3 Программа по иммунологии, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 4 Кафедра биофизики, Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, 48109, США.
    • 5 Отдел вакцин и инфекционных заболеваний, Онкологический исследовательский центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл, Вашингтон, 98109, США.
    • 6 Кейптаун Лаборатория иммунологии HVTN, Научно-исследовательский институт центра Хатчинсона, Южная Африка, NPC (HCRISA), Кейптаун 8001, Южная Африка.
    • 7 Медицинский факультет, Медицинская школа Вашингтонского университета, Сиэтл, Вашингтон, 98195, США.

    Элемент в буфере обмена

    Полнотекстовые ссылки Параметры отображения цитирования

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    Абстрактный

    Т-клеточная терапия, модифицированная химерным антигенным рецептором (CAR), эффективна при лечении лимфом, лейкозов и множественной миеломы, при которых опухолевые клетки экспрессируют большое количество антигена-мишени.Однако для достижения стойкой ремиссии этих гематологических злокачественных новообразований и распространения CAR-T-клеточной терапии на пациентов с солидными опухолями потребуются рецепторы, которые могут распознавать и устранять опухолевые клетки с низкой плотностью антигена-мишени. Хотя CAR были разработаны для имитации передачи сигналов Т-клеточного рецептора (TCR), TCR по меньшей мере в 100 раз более чувствительны к антигену. Чтобы разработать CAR с улучшенной чувствительностью к антигенам, мы напрямую сравнили передачу сигналов TCR и CAR в первичных Т-клетках человека. Общий фосфопротеомный анализ показал, что ключевые сигнальные белки Т-клеток, такие как CD3δ, CD3ε и CD3γ, которые составляют часть корецептора Т-клеток, а также адаптерный белок TCR LAT, либо не фосфорилировались, либо фосфорилировались лишь слабо. путем стимуляции CAR.Модификация обычной последовательности 4-1BB/CD3ζ CAR для лучшего взаимодействия с CD3ε и LAT с использованием встроенных доменов CD3ε или GRB2 привела к усилению активации Т-клеток in vitro в условиях низкой плотности антигена и повышению эффективности в моделях лимфомы, лейкемии in vivo. , и рак молочной железы. Эти CAR представляют собой примеры изменений в конструкции рецепторов, которые были вызваны углубленным изучением передачи сигналов Т-клетками.

    Copyright © 2021 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки.Претензий к оригинальным работам правительства США нет.

    Заявление о конфликте интересов

    Конкурирующие интересы: A.I.S. является акционером и научным консультантом Lyell Immunopharma. С.Р.Р. является основателем и акционером Lyell Immunopharma, а также основателем и научным консультантом Juno Therapeutics, компании Celgene. Р.Г. получает доход от консультационных услуг от Juno Therapeutics, Celgene, Illumina, Takeda, Infotech Soft и Merck, исследовательскую поддержку от Janssen Pharmaceuticals и Juno Therapeutics, а также владеет долей в CellSpace Biosciences, Ozette Technologies и Modulus Therapeutics.A.I.S., A.R. и S.R.R. подали предварительные патенты на конструкции CAR, описанные в этой рукописи. Другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

    Цифры

    Рисунок 1. Биспецифические Т-клетки и магнитные…

    Рис. 1.. Биспецифические Т-клетки и магнитные гранулы позволяют анализировать передачу сигналов TCR и CAR…

    Рисунок 1. Биспецифические Т-клетки и магнитные шарики позволяют анализировать передачу сигналов TCR и CAR в одной клеточной популяции.

    (A) Схема, описывающая состав биспецифических Т-клеток, обладающих EBV-специфическим TCR и ROR1-специфическим CAR. (B) Анализ проточной цитометрией связывания EBV-тетрамера (EBV-tet) и экспрессии маркера трансдукции CD19t в размноженных Т-клетках.На графике показаны окрашенные (черный) и изотип (серый) CD8 + синглетные лимфоциты. Данные являются репрезентативными для трех экспериментов с использованием Т-клеток от двух уникальных доноров. (C) Временной график показывает среднее значение ± SEM (заштриховано) мобилизации Ca 2+ в биспецифических Т-клетках, стимулированных ROR1 (зеленый и синий) или SCT (красный и фиолетовый), содержащих липидные бислои, измеренные с помощью Fluo-4 AM интенсивность ответов отдельных клеток. Следы представляют собой долю ячеек выше порога активации в любой момент времени.Плотность антигена модулировали путем изменения молярной доли биотинилированных липидов в нанесенном бислое: 0,005% (пурпурный и синий) или 0,01% (красный и зеленый). (D) Вестерн-блот-анализ на CD3ζ, CD3ζ pTyr 142 , SLP-76, SLP-76 pSer 376 , PLC-γ1 и PLC-γ1 pTyr 783 в клеточных лизатах после стимуляции указанными гранулами или K562 клетки в течение 45 мин. Данные являются репрезентативными для двух экспериментов с использованием Т-клеток от двух уникальных доноров.

    Рис. 2.. Стимуляция CAR способствует менее интенсивному…

    Рисунок 2. Стимуляция CAR способствует менее интенсивному фосфорилированию цепей CD3 и проксимальной передаче сигналов TCR…

    Рисунок 2. Стимуляция CAR способствует менее интенсивному фосфорилированию цепей CD3 и проксимальных сигнальных адаптеров TCR.

    (A) Схема экспериментальной стимуляции биспецифических Т-клеток шариками, покрытыми антигенами TCR (SCT/CD28) или CAR (ROR1). (от B до D) Графики показывают среднее значение log 2 FC указанных сайтов фосфорилирования (PO 4 ), как показано на (A), из двух или трех экспериментов ЖХ-МС/МС с Т-клетками от двух уникальных доноров. (E) Сравнение среднего log 2 FC сайтов фосфорилирования после стимуляции TCR или CAR шариками SCT/CD28 или ROR1. Красные точки указывают сайты, которые имели средние значения log 2 FC, отличающиеся на ≥ 1 между образцами, стимулированными TCR и CAR, через 10, 45 и 90 минут по сравнению с контрольной стимуляцией шариками. (F) График показывает среднее значение log 2 FC фосфорилирования CD3δ, CD3ε и CD3γ ITAM. Усредняли log 2 FC фосфорилирования обоих тирозинов ITAM. Данные представляют собой средние значения двух или трех экспериментов ЖХ-МС/МС с Т-клетками от двух уникальных доноров. (G) Тепловая карта показывает среднее значение log 2 FC для выбранных сайтов фосфорилирования в момент времени 10 минут. (H) График показывает среднее значение log 2 FC для выбранных сайтов фосфорилирования в LAT. (I) Вестерн-блот анализ на CD3ζ, CD3ζ pTyr 142 , LAT и LAT pTyr 220 , ZAP-70, ZAP-70 pTyr 319 , ZAP-70 pTyr 1673 4693 PLC-γ1 pTyr 783 и PLC-γ1 pSer 1248 (p = фосфорилирование) в биспецифических лизатах Т-клеток, используемых для экспериментов ЖХ-МС/МС.Блоты являются репрезентативными для трех экспериментов с использованием Т-клеток, полученных от двух уникальных доноров; скомпилированные данные количественно представлены на рис. С4А. (J) Вестерн-блот-анализ LAT, LAT pTyr 220 , ZAP-70, ZAP-70 pTyr 319 , PLC-γ1 и PLC-γ1 pTyr 783 в лизатах биспецифических Т-клеток, экспрессирующих BB/ζ CAR после 10 мин стимуляции контрольными шариками, SCT/CD28 или ROR1. Блоты являются репрезентативными для трех экспериментов с использованием Т-клеток, полученных от двух уникальных доноров; скомпилированные данные количественно представлены на рис.S4B.

    Рисунок 3. Конструкции CAR под управлением MS выражены…

    Рисунок 3. Конструкции CAR, управляемые МС, экспрессируются первичными Т-клетками.

    (А) Схемы автомобилей…

    Рисунок 3.. Конструкции CAR, управляемые MS, экспрессируются первичными Т-клетками.

    (A) Схема CAR с последовательностями CD3ε. (B) Анализ связывания ROR1-Fc с помощью проточной цитометрии для измерения экспрессии CAR на трансдуцированных Т-клетках. Графики показывают нетрансдуцированные (серые) или CD8 + EGFRt + (цвета) синглетные лимфоциты. Гистограмма показывает среднее значение ± SEM относительного процента средней интенсивности флуоресценции (MFI) по сравнению с Т-клетками BB/ζ CAR. N = три эксперимента с использованием Т-клеток от трех уникальных доноров. (C) Среднее ± SEM кратное изменение концентрации IFN-γ, IL-2 или TNF-α в клеточном супернатанте через 24 часа после совместного культивирования указанных CAR T-клеток с опухолевыми клетками K562 или K562/ROR1. N = четыре уникальных донора Т-клеток. Значение P с помощью обычного однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. (D) Схема CAR с доменами GRB2 или GRAP2 Sh3. (E) Анализ связывания ROR1-Fc с помощью проточной цитометрии, как в (B). Гистограмма показывает среднее ± SEM относительного процента MFI по сравнению с Т-клетками BB/ζ CAR.N = три эксперимента с использованием Т-клеток от трех уникальных доноров. (F) Вестерн-блот-анализ на CD3ζ в лизатах Т-клеток CAR. Блот представляет три независимых эксперимента с использованием Т-клеток от двух уникальных доноров. (G) Среднее ± SEM кратное изменение концентрации IFN-γ, IL-2 или TNF-α в клеточном супернатанте, как на (C). N = 4 уникальных донора Т-клеток. Обратите внимание, что данные BB/ζ и 28/ζ CAR в (G) такие же, как и в (C), в целом полученные в тех же экспериментах. Значение P с помощью обычного однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки.

    Рисунок 4. Новые конструкции CAR обладают повышенным…

    Рисунок 4. Новые конструкции CAR обладают повышенной чувствительностью к антигенам.

    (A) График X-Y показывает среднее значение…

    Рисунок 4.. Новые конструкции CAR обладают повышенной антигенной чувствительностью.

    (A) На графике X-Y показано среднее ± SEM доля клеток, проявляющих ответы Ca 2+ после 20-минутного воздействия на бислои, обладающие диапазоном плотностей ROR1, измеренным по интенсивности флуоресценции Fluo-4 AM. Мол. % обозначает молярное процентное содержание липидов, покрытых ROR1, в бислое. N = 3 или 4 эксперимента с использованием Т-клеток от двух уникальных доноров. (B) Fluo-4 Ca 2+ измерения мобилизации клеток, стимулированных на 0.1% бислоев, меченных ROR1. График времени показывает среднее значение ± SEM (заштриховано) кумулятивной доли мобилизации Ca 2+ во времени после воздействия двухслойных материалов. N = 4 независимых эксперимента. (C) Выше последовательность изображений показывает репрезентативный пример изменения интенсивности флуоресценции Fluo-4 AM, когда клетка приземляется и активируется двойным слоем, содержащим ROR1. Ниже данные из (B) представлены в виде нормализованных кумулятивных кривых, чтобы подчеркнуть различия в кинетике мобилизации Ca 2+ .Толстые линии представляют собой экспоненциальное соответствие данным с константами времени активации для всей популяции выделенных клеток. (D) Вестерн-блот-анализ на LAT, LAT pTyr 220 , SLP-76, SLP-76 pSer 376 , PLC-γ1 и PLC-γ1 pTyr 783 в лизатах Т-клеток после 10 минут инкубации с ROR1 (+) или контрольные (–) шарики. Гистограммы показывают среднее значение ± SEM для log 2 FC нормированной интенсивности полосы из трех экспериментов с использованием Т-клеток от трех уникальных доноров.Значения P были рассчитаны с помощью однофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями с посттестом Тьюки. (E и F) Графики показывают среднее значение ± стандартная ошибка среднего для концентрации IFN-γ (E) или IL-2 (F) в супернатанте через 24 часа после стимуляции указанными количествами ROR1, связанного с планшетом. Для каждой конструкции CAR была подобрана сигмоидальная кривая, и указано среднее значение IC 50 . N = 5 экспериментов с использованием Т-клеток от пяти уникальных доноров. Значения P были рассчитаны с помощью однофакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями с посттестом Тьюки.

    Рисунок 5. BB/ζ CAR, содержащие CD3ζ или…

    Рисунок 5. BB/ζ CAR, содержащие домены CD3ζ или GRB2, сохраняют противоопухолевую функцию in vivo в…

    Рисунок 5.. BB/ζ CAR, содержащие домены CD3ζ или GRB2, сохраняют противоопухолевую функцию in vivo в условиях высокой экспрессии антигена.

    (A и B) Репрезентативные изображения биолюминесценции (A) и среднее значение яркости ± SEM (фотоны/секунда/см 2 /ср) (B) опухолевой нагрузки Raji/ffluc у мышей, получавших CD19-специфический CD8 + CAR Т-клетки. N = 6 или 10 мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов с использованием Т-клеток от уникальных доноров. (C) Анализ выживания мышей, как в (B).Значимость (*) и значений P (обозначение на вставке) были рассчитаны с помощью логарифмического рангового критерия. (от D до F) Графики показывают среднее значение ± SEM нормализованного PD-1 (D) и Lag3 (E) средней интенсивности флуоресценции (MFI) на CD8 + CD45 + GFP CAR Т-клетках, а также процентная частота таких клеток (F) в костном мозге через 21 день после инъекции опухоли клеток Раджи. N = 7 или 8 мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов с использованием Т-клеток от уникальных доноров. P значений с помощью обычного однофакторного дисперсионного анализа с посттестом Тьюки. (G) На графике показано среднее значение яркости ± SEM (фотоны/секунда/см 2 /ср) опухолевой нагрузки Nalm-6/ffluc у мышей, получавших CD19-специфические Т-клетки CD8 + CAR. N = 6 или 8 мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов с использованием Т-клеток от уникальных доноров. Значимость (* P <0,05) оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки. (H) Анализ выживания мышей, как в (G). Значимость (*) и значений P (обозначение на вставке), оцененные с помощью логарифмического рангового теста.

    Рисунок 6. BB/ζ CAR, содержащие CD3ζ или…

    Рисунок 6. BB/ζ CAR, содержащие домены CD3ζ или GRB2, усиливают противоопухолевую функцию in vivo у…

    Рисунок 6.. BB/ζ CAR, содержащие домены CD3ζ или GRB2, усиливают противоопухолевую функцию in vivo в условиях низкой экспрессии антигена.

    (A и B) Репрезентативные изображения биолюминесценции (A) и среднее ± SEM излучение (фотонов/секунду/см 2 /ср) (B) опухолевой нагрузки Jeko-1/ffluc у мышей, получавших ROR1-специфический CD8 + CAR Т-клетки. N = 7 или 8 мышей на группу, объединенных из двух независимых экспериментов с использованием Т-клеток от уникальных доноров. (C) Анализ выживания мышей, как в (B).Значимость (*) и значений P (обозначение на вставке), оцененные с помощью логарифмического рангового теста. (D) Графики показывают среднее значение ± SEM частоты Т-клеток CAR в крови (слева) или костном мозге (справа) в указанные моменты времени после инъекции опухолевых клеток Jeko-1. N = три или четыре мыши на группу. (от E до G) Среднее значение ± SEM яркости экспрессирующих люциферазу опухолей MDA-MB-231 в зависимости от времени (E) или на 27 (F) и 34 (G) дни после инъекции опухолевых клеток MDA-MB-231 и обработка ROR1-специфичными CD8 + CAR Т-клетками на 7-й день.N = 5 мышей на группу. P значения, определенные с помощью обычного однофакторного дисперсионного анализа с посттестом Тьюки.

    Похожие статьи

    • Фосфопротеомный анализ передачи сигналов химерного антигенного рецептора выявляет кинетические и количественные различия, влияющие на функцию клетки.

      Солтер А.И., Айви Р.Г., Кеннеди Дж.Дж., Войлет В., Раджан А., Олдерман Э.Дж., Войтович Ю.Дж., Лин С., Соммермейер Д., Лю Л., Уайтакер Дж.Р., Готтардо Р., Паулович А.Г., Ридделл С.Р.Солтер А.И. и др. Научный сигнал. 21 августа 2018 г .; 11 (544): eaat6753. doi: 10.1126/scisignal.aat6753. Научный сигнал. 2018. PMID: 30131370 Бесплатная статья ЧВК.

    • Комбинированная костимуляция CD28 и 4-1BB потенцирует Т-клетки, сконструированные с помощью химерных антигенных рецепторов с настроенной аффинностью.

      Дрент Э., Поэлс Р., Руитер Р., ван де Донк НВЦЖ, Цвигман С., Юан Х., де Брюйн Дж., Саделайн М., Локхорст Х.М., Гроен Р.В.Дж., Мутис Т., Темели М.Дрент Э. и др. Клин Рак Рез. 2019 1 июля; 25 (13): 4014-4025. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-2559. Epub 2019 12 апр. Клин Рак Рез. 2019. PMID: 30979735 Бесплатная статья ЧВК.

    • Новый химерный антигенный рецептор, содержащий сигнальный домен JAK-STAT, обеспечивает превосходные противоопухолевые эффекты.

      Кагоя Ю., Танака С., Го Т., Анчуровски М., Ван Ч., Сасо К., Батлер М.О., Минден М.Д., Хирано Н.Кагоя Ю. и др. Нат Мед. 2018 март; 24(3):352-359. doi: 10.1038/nm.4478. Epub 2018 5 февраля. Нат Мед. 2018. PMID: 29400710 Бесплатная статья ЧВК.

    • Химерная антиген-рецепторная Т-клеточная терапия гематологических злокачественных новообразований и солидных опухолей: клинические данные на сегодняшний день, текущие ограничения и перспективы.

      Готье Дж., Якуб-Ага И. Готье Дж. и др. Curr Res Transl Med.2017 сен; 65 (3): 93-102. doi: 10.1016/j.retram.2017.08.003. Curr Res Transl Med. 2017. PMID: 28988742 Рассмотрение.

    • Что-нибудь ближе к успешной терапии множественной миеломы? CAR-T-клетка — хороший повод для оптимизма.

      Марофи Ф., Тахмасеби С., Рахман Х.С., Кайгородов Д., Марков А., Юмашев А.В., Шомали Н., Чартран М.С., Патхак Ю., Мохаммед Р.Н., Джарахян М., Мотавалли Р., Мотавалли Хиави Ф.Марофи Ф. и др. Стволовые клетки Res Ther. 2021 29 марта; 12 (1): 217. doi: 10.1186/s13287-021-02283-z. Стволовые клетки Res Ther. 2021. PMID: 33781320 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

    Цитируется

    4 статьи
    • Терапия рака с помощью TCR-инженерных Т-клеток: текущие стратегии, проблемы и перспективы.

      Шафер П., Келли Л.М., Хойос В. Шафер П. и др. Фронт Иммунол. 2022 3 марта; 13:835762. doi: 10.3389/fimmu.2022.835762. Электронная коллекция 2022. Фронт Иммунол. 2022. PMID: 35309357 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

    • Адаптивная клеточная терапия множественной миеломы с использованием CAR- и TCR-трансгенных Т-клеток: ответ и устойчивость.

      Фюксль Ф., Крэкхардт А.М.Füchsl F, et al. Клетки. 2022 25 января; 11 (3): 410. doi: 10.3390/cells11030410. Клетки. 2022. PMID: 35159220 Бесплатная статья ЧВК. Рассмотрение.

    • Т-клетки гуманизированного химерного антигенного рецептора (CAR).

      Козани П.С., Козани П.С., О’Коннор Р.С. Козани П.С. и др. J Cancer Immunol (Уилмингтон). 2021;3(4):183-187. J Cancer Immunol (Уилмингтон). 2021. PMID: 35128536 Бесплатная статья ЧВК.Аннотация недоступна.

    • SILAC Phosphoproteomics раскрывает уникальные сигнальные цепи в CAR-T-клетках и ингибирование активирующего В-клетки фосфорилирования в клетках-мишенях.

      Гриффит А.А., Каллахан К.П., Кинг Н.Г., Сяо К., Су Х., Саломон А.Р. Гриффит А.А. и соавт. J Протеом Res. 2022 4 февраля; 21 (2): 395-409. doi: 10.1021/acs.jproteome.1c00735. Epub 2022 11 января. J Протеом Res.2022. PMID: 35014847

    Типы публикаций

    • Поддержка исследований, Национальный институт здравоохранения, заочная
    • Поддержка исследований, за пределами США правительство

    термины MeSH

    • Множественная миелома* / терапия
    • Рецепторы, Антиген, Т-клетка / генетика
    • Рецепторы, химерный антиген* / генетика

    вещества

    • Рецепторы, Антиген, Т-Клетка
    • Рецепторы, химерный антиген

    LinkOut — больше ресурсов

    • Полнотекстовые источники

    • Медицинские

    • Исследовательские материалы

    • Разное

    [Икс]

    Укажите

    Копировать

    Формат: ААД АПА МДА НЛМ

    Первый подробный анализ сигналов Т-клеток CAR предлагает способы улучшения иммунотерапии

    СИЭТЛ — авг.21 ноября 2018 г. — Терапия CAR Т-клетками, которая перепрограммирует иммунные клетки для борьбы с раком, показала большие перспективы у людей с некоторыми видами рака крови, которые не реагировали на другие виды лечения. Но до сих пор основные биологические пути, обеспечивающие противораковые реакции, не были тщательно изучены.

    Понимание этих путей важно для разработки будущих поколений CAR Т-клеточной терапии, включая уменьшение побочных эффектов, предотвращение рецидивов после лечения и обеспечение их эффективности против более распространенных видов рака, таких как солидные опухоли.

    В исследовании, опубликованном 21 августа в журнале Science Signaling, исследователи из Онкологического исследовательского центра Фреда Хатчинсона сравнили паттерны передачи сигналов Т-клетками в двух разных конструкциях CAR, сокращенно от «химерных антигенных рецепторов», используя лабораторные модели. Это первое в своем роде профилирование для сравнения двух распространенных конструкций CAR, которые используются в клинике.

    «За последние несколько лет в области иммунотерапии произошел всплеск интереса как к новому столпу лечения рака, и возникло стремление протестировать CAR Т-клеточную терапию в клинике», — сказал д-р.Стэнли Ридделл, ведущий автор статьи и научный руководитель Интегрированного исследовательского центра иммунотерапии Фреда Хатча.

    «Когда мы начали это исследование в 2014 году, мы стремились понять биологию CAR Т-клеточной терапии. Теперь, когда мы лучше понимаем, как это работает, у нас появилось новое понимание того, как улучшить это новое лекарство, что крайне важно, поскольку область движется к разработке CAR-Т-клеточной терапии для большего количества типов рака, включая солидные опухоли», — сказал Ридделл.

    CAR представляют собой синтетические рецепторы, встроенные в тип иммунной клетки, называемый Т-клеткой.Часть CAR, торчащая из Т-клетки, распознает раковые клетки среди здоровых клеток. Часть CAR, которая находится внутри Т-клетки, имеет разные компоненты. Среди них есть сигнальная единица Т-клеток, называемая костимулирующим доменом, которая представляла интерес в статье Science Signaling.

    В своем исследовании исследователи изучили различия между CAR, построенными с помощью двух наиболее часто используемых костимулирующих доменов. В частности, они изучили, как эти две конструкции CAR, называемые CD28 и 4-1BB, сигнализируют своим Т-клеткам о мобилизации против рака и как они влияют на поведение и эффективность Т-клеток против раковых клеток человека в лабораторных чашках и у мышей.

    «Был большой интерес к нацеливанию Т-клеток на рак, но мало что известно об инструкциях, которые CAR дают Т-клеткам», — сказал Алекс Солтер, первый автор и доктор медицинских наук. студент Фреда Хатча и Вашингтонского университета. «Я хотел изучить, как CAR передают инструкции Т-клеткам».

    Исследователи обнаружили, что одни и те же сигнальные пути инициируются обоими типами CAR, но время и интенсивность сигнала различаются: конструкция CAR CD28 демонстрирует более быструю и сильную активность, а CAR 4-1BB демонстрирует более медленную и мягкую активацию.Дальнейшее тестирование на мышиной модели лимфомы показало, что 4-1BB CAR более эффективен в уничтожении раковых клеток.

    Исследователи также обнаружили:

    • Сигнальный белок в Т-клетках, называемый Lck, модулирует интенсивность ответа Т-клеток в дизайне CD28 CAR, и исследователи могли манипулировать им для точной настройки ответа CD28 CAR.
    • Т-клетки 4-1BB CAR показали большую экспрессию генов, связанных с Т-клеточной памятью, что позволяет предположить, что передача сигналов 4-1BB CAR может привести к Т-клеткам, которые могут жить дольше и сохранять свои противораковые эффекты.

    «Наши результаты показывают, как разные конструкции CAR могут использоваться для разных целей», — сказал Солтер. «Более быстрый и сильный ответ CAR CD28 может принести пользу при определенных видах рака, тогда как более медленный и продолжительный CAR 4-1BB может принести пользу другим».

    Всесторонний анализ белков, участвующих в передаче сигналов Т-клеток, стал возможен благодаря методу, называемому масс-спектрометрией, экспертом которого является соавтор доктор Аманда Паулович из Fred Hutch. В статье Science Signaling впервые используется масс-спектр для измерения того, как тысячи белков активируются в клинически значимых Т-клетках для выполнения функций Т-клеток.

    «Мы надеемся, что, разработав набор целевых анализов фосфопротеинов, участвующих в передаче сигналов Т-клеток, мы сможем помочь продвинуть область иммунотерапии в разработке более эффективных CAR Т-клеточных методов лечения для пациентов», — сказал Паулович, член Клинических исследований Фреда Хатча. Разделение.

    Исследователи предупреждают, что их результаты не означают, что один CAR лучше другого в качестве лечения, но что результаты подтверждают клинические наблюдения за тем, как CAR действуют на пациентов, и дают представление о том, почему некоторые пациенты испытывают более сильные побочные эффекты от CAR T. и почему некоторые рецидивы после лечения.

    Команда Фреда Хатча сейчас изучает, как спроектировать следующие поколения CAR. Для этой работы исследователи используют масс-спектрометрию для мониторинга множественных реакций, отдельную методику, разработанную Пауловичем для более быстрого изучения конструкций CAR следующего поколения. Эти тесты дополнят другие тесты, разработанные ее лабораторией для количественного определения белков, влияющих на функцию иммунной системы в опухолях.

    Национальные институты здравоохранения финансировали исследование вместе с подарком от семьи Безос.Ученые Фреда Хатча сыграли свою роль в разработке этих открытий, и Фред Хатч и некоторые из его ученых могут получить финансовую выгоду от этой работы в будущем.

    Исследование было проведено Фредом Хатчем. Дополнительными соавторами Фреда Хатча являются доктор Рафаэль Готтардо, Ричард Айви, Джейкоб Кеннеди, доктор Валентин Войле, Ануша Раджан, Ульяна Войтович, доктор Ченвей Лин и доктор Джеффри Уайтакер. Текущие связи других соавторов: Ева Олдерман из Juno Therapeutics, теперь принадлежащей компании Celgene; Др.Даниэль Зоммермейер из Medigene Immunotherapies GmBH и Линфэн Лю из Университета Фудань.

    # # #

    Продукты для исследования передачи сигналов CAR: R&D Systems

    Перенос Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR) имел успех в качестве лечения лейкемии и лимфомы, но солидные опухоли были более сложными из-за редкости истинных опухолеспецифических молекул-мишеней и иммуносупрессивный характер микроокружения опухоли. Лучшее понимание сигнальных путей CAR и того, чем они отличаются от сигнальных путей Т-клеточного рецептора (TCR), необходимо для лучшего информирования будущих стратегий, основанных на CAR, нацеленных на солидные опухоли.Например, какие аспекты эндогенной передачи сигналов TCR отсутствуют? Отличается ли профиль секреции цитокинов между CAR Т-клетками и обычными Т-клетками? Наши массивы антител Proteome Profiler идеально подходят для решения подобных вопросов, обеспечивая беспристрастный анализ ответов как внутриклеточных, так и внеклеточных Т-клеток.

    Домашняя страница клеточной терапии

     

    Профилометр протеома Массивы антител

    Наши массивы антител на мембранной основе не требуют специального оборудования и устраняют необходимость в многочисленных экспериментах по Вестерн-блоттингу.Наборы массивов антител содержат буферы, детектирующие антитела и мембраны, отмеченные в двух экземплярах высококачественными захватывающими антителами. Матрицы используют хемилюминесценцию для обнаружения, а мембраны могут быть оценены на содержание белка таким же образом, как и традиционные вестерн-блоты. Наши массивы антител широко цитируются в первичной литературе, что подчеркивает их полезность и популярность.

    Анализ внутриклеточной сигнализации

    Быстро сравнивайте и противопоставляйте сигнализацию нижестоящих CAR и обычных TCR, чтобы помочь направить более эффективные стратегии разработки CAR.Наш фосфоспецифический профилировщик протеома Массивы антител позволяют одновременно оценивать статус фосфорилирования до 59 сигнальных молекул.

    Увеличить Профиль передачи сигнала лейкозных клеток. Клетки острого Т-клеточного лейкоза человека Jurkat не подвергались обработке или обрабатывались 2 мМ H 2 O 2 в течение 2 минут. Клеточные лизаты анализировали с использованием набора Human Phospho-Kinase Array Kit (№ по каталогу ARY003B).
    Просмотреть все массивы, специфичные для фосфора

    Мониторинг профилей секреции цитокинов

    Определите сходства и различия между профилями секреции цитокинов CAR Т-клетками и обычными Т-клетками, используя наш Proteome Profiler Массивы антител, чтобы узнать больше об ответах CAR Т-клеток. Одновременно измеряйте уровни экспрессии до 111 цитокинов, чтобы сэкономить образец и время.


    Увеличить
    Профиль секреции цитокинов лейкозными клетками. клеток острого моноцитарного лейкоза человека THP-1 не обрабатывали или обрабатывали 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого IFN-гамма (каталожный номер 285-IF) в течение 16 часов. Супернатанты клеток анализировали с использованием набора Human XL Cytokine Array Kit (№ по каталогу ARY022).
    Просмотреть все массивы, специфичные для цитокинов

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка браузера на прием файлов cookie

    Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

    Объединенный скрининг CAR Т-клеток выявляет ненативные сигнальные домены для иммунотерапии нового поколения

    ВВЕДЕНИЕ

    Адаптивная клеточная терапия с использованием Т-клеток, созданных с помощью химерного антигенного рецептора (CAR), произвела революцию в лечении В-клеточных лейкозов и лимфом (Ahmad et al. др., 2020; Азими и др., 2019). CAR в настоящее время в клинике используют внутриклеточный костимулирующий домен 4-1BB или CD28, оба из которых происходят от естественных, хорошо изученных костимуляторных рецепторов Т-клеток. Костимуляция является критическим компонентом иммунной активации, и CAR, лишенные «сигнала 2» от костимулирующего домена, быстро становятся анергическими при стимуляции (Chen and Flies, 2013). CAR, содержащие внутриклеточные домены 4-1BB и CD28, используются в CAR второго поколения, которые вызывают более сильную и устойчивую активацию Т-клеток, чем исходные CAR, содержащие только CD3ζ.Хотя CD28- и 41BB-содержащие CAR являются эффективными терапевтическими средствами, существуют существенные различия в развитии их синапсов, цитотоксичности, метаболическом состоянии и клинической эффективности (Davenport et al., 2018; Kawalekar et al., 2016; Weinkove et al., 2019; Чжао и др., 2020). Текущее состояние литературы указывает на то, что Т-клетки, экспрессирующие CD28 CAR, изначально быстрее пролиферируют и убивают опухолевые клетки, но страдают от снижения долгосрочного приживления трансплантата и повышенного истощения после длительной активации (Maude et al., 2014, 2018; Парк и др., 2018 г.; Солтер и др., 2018; Ин и др., 2019).

    Существует значительное разнообразие костимулирующих доменов и доказательства как количественных, так и качественных различий в костимуляторной передаче сигналов в контексте CAR (Weinkove et al., 2019). 4-1BB и CD28 используют два отдельных сигнальных пути (TRAF и PI3K/Lck), однако эти пути сходятся на консервативных промежуточных звеньях передачи сигналов, что позволяет предположить, что костимулирующие домены из других иммунных клеток также могут передавать сигналы в Т-клетках.В других исследованиях были охарактеризованы дополнительные костимуляторные домены Т-клеток индивидуально в пределах CAR или проведен поиск мутантных доменов с улучшенными свойствами (Dawson et al., 2020; Guedan et al., 2014, 2018, 2020; Kagoya et al., 2018). Однако масштабы этих поисков были ограничены выбранными доменами, ориентированными в первую очередь на рецепторы с известными функциями в Т-клетках.

    Объединенные скрининги стали мощным инструментом для исследования биологии Т-клеток, включая использование нокаутов CRISPR и переключающих рецепторов (Roth et al., 2020; Шифрут и др.), но еще не применялись к CAR-инжинирингу. Объединенные анализы предлагают как повышенную пропускную способность, так и прямое сравнение клеток от одного и того же донора крови, протестированных в точно таких же условиях. Скрининг большого количества доменов для оценки их влияния на множественные внутриклеточные фенотипы Т-клеток поможет определить оптимальные конструкции CAR для клинического применения. В то время как объединенные измерения могут быть применены ко многим аспектам архитектуры CAR, сигнальные домены, которые являются небольшими, имеют минимальную вторичную структуру и состоят из коротких и модульных сигнальных мотивов (Diella et al., 2008), поддаются объединенной характеристике с использованием больших библиотек синтетических ДНК (Kosuri and Church, 2014). Целые домены, отдельные мотивы и общие принципы дизайна, определенные из данных, могут быть затем использованы для создания целевых наборов CAR для углубленного анализа in vitro и in vivo и потенциала для клинического применения.

    Отсутствие персистентности и долгосрочной эффективности у пациентов является центральной проблемой современной терапии CAR T (Kershaw et al., 2006; Парк и др., 2007). Чтобы имитировать затянувшийся стресс от хронического воздействия антигена в трудно поддающихся элиминации солидных опухолях, мы разработали четырехнедельный анализ in vitro с повторной стимуляцией и измерили выработку, пролиферацию и персистенцию цитокинов для выявления костимулирующих доменов, которые улучшили долгосрочные результаты. противоопухолевая активность CAR Т-клеток. Мы собрали библиотеку косигналов, состоящую как из ингибирующих, так и из стимулирующих доменов, из ряда врожденных и адаптивных иммунных клеток, которые используют общий сигнальный механизм, присутствующий в Т-клетках (Chen and Flies, 2013).Затем мы провели набор объединенных анализов на первичных Т-клетках CD4 или CD8 человека, содержащих эту библиотеку CAR, создав первый систематический обзор ландшафта костимуляции Т-клеток CAR. Мы обнаружили, что определенные костимуляторные домены обладают расширенными возможностями в CD4 или CD8 Т-клетках и что сигнальные домены, обычно связанные с другими иммунными линиями (макрофагами, В-клетками, NK-клетками), способны сильно активировать Т-клетки. Мы идентифицируем набор мощных костимулирующих доменов из семейства рецепторов TNF, которые приводят к усиленной пролиферации и цитотоксичности и имеют динамику отторжения in vivo, равную 4-1BB и CD28 в модели солидной опухоли.Кроме того, мы идентифицируем KLRG1, ингибирующий домен, который подавляет активацию и удерживает Т-клетку в наивном транскрипционном состоянии. Наконец, профили экспрессии одноклеточной РНК и поверхностного белка среди этих кандидатов показали, что CAR T, использующие сигнальный домен из BAFF-R, обогащены высокоцитотоксической сигнатурой экспрессии. Эта характеристика, связанная с продукцией IFN-γ и врожденным фенотипом, подобным NK-клеткам, ранее была связана с усиленным приживлением 4-1BB CAR T и улучшенным ответом против меланомы в клинических исследованиях.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Объединение CAR: Создание и скрининг объединенной библиотеки CAR с разнообразным набором костимулирующих доменов

    Врожденные и адаптивные иммунные клетки используют дополнительные рецепторы для активации критических клеточных функций. Эти рецепторы часто используют модульные линейные сигнальные мотивы и сигнальные белки, которые сохраняются в иммунной системе (Chen and Flies, 2013; Diella et al., 2008). Мы изучили 40 внутриклеточных доменов костимулирующих и коингибирующих рецепторов из разных семейств белков и функциональных классов, связанных с несколькими типами иммунных клеток, включая NK-клетки, В-клетки и врожденные иммунные клетки (рис. 1А, 1В).Чтобы создать эту библиотеку «CAR Pooling», мы синтезировали и клонировали домены в каркас CAR второго поколения и с помощью Т-клеток от двух доноров-людей трансдуцировали лентивирусную библиотеку, содержащую весь пул доменов, в отдельные культуры Т-клеток CD4 и CD8. (Рисунок 1С). CAR-положительные Т-клетки сортировали на основе маркера T2A-GFP для определенного диапазона экспрессии CAR и выдерживали в течение 5 дней, прежде чем приступить к стимуляции опухолевых клеток. После создания эти новые CAR изучали на предмет их влияния на пролиферацию и истощение Т-клеток после продолжительной стимуляции по сравнению с клиническими эталонными CAR с костимулирующими доменами 4-1BB или CD28.

    Рисунок 1: Объединение CAR: Создание и скрининг объединенной библиотеки CAR с разнообразным набором костимулирующих доменов ), один из 40 различных внутриклеточных доменов и домен CD3ζ (слева). Косигнальные домены со всего протеома человека были идентифицированы, оптимизированы по кодонам, синтезированы, объединены в плазмидную библиотеку и упакованы для создания лентивируса.

    B) Диаграмма Венна, показывающая естественную экспрессию членов библиотеки по типам иммунных клеток. Паттерны экспрессии индивидуально перечислены в (Таблица S1).

    C) Первичные Т-клетки CD4 и CD8 человека отдельно выделяли из РВМС двух доноров-людей и лентивирусно трансдуцировали библиотекой. Затем клетки очищали с помощью FACS с использованием флуоресценции 2A-GFP в пределах одного логарифма средней экспрессии для снижения вариабельности.

    D) Объединенную библиотеку неоднократно стимулировали 1:1 опухолевыми клетками CD19+ или CD19-K562 для количественного определения антигенспецифической активации (CD69), продукции цитокинов CD4 (IFN-γ, IL-2) и пролиферации (клеток фиолетовый след — CTV).Библиотека также подвергалась массовому секвенированию в указанные моменты времени для измерения относительного расширения отдельных конструкций в образце.

    E) Процент CD8+ T-клеток, экспрессирующих различное количество маркеров истощения (PD1, TIM3, LAG3, CD39) после повторного анализа стимуляции облученными CD19+ опухолевыми клетками K562. Т-клетки, экспрессирующие CD28, 4-1BB или CD3ζ-только CAR, сравнивают с нетрансдуцированными клетками. Серые прямоугольники соответствуют моментам времени, когда в культуре не осталось живых клеток.См. рисунок S1A/B для второго донора и данные для CD4+ Т-клеток.

    F) Мы использовали FlowSeq, объединенный рабочий процесс количественной оценки на основе FACS и NGS, для количественной оценки обогащения путем сортировки библиотеки по ячейкам флуоресцентного сигнала, соответствующим функциональному показателю, как показано цветными прямоугольниками на репрезентативных гистограммах. Затем мы напрямую амплифицировали костимулирующий домен с помощью экстракции геномной ДНК и ПЦР и выполнили секвенирование ампликона NGS в каждом бине, чтобы оценить фенотип для каждого члена библиотеки.

    Рисунок S1: Повторяющаяся стимуляция воспроизводимо вызывает истощение и вызывает дифференцированную пролиферацию и экспансию в библиотеке вариантов CAR-T

    A) Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) для четырех маркеров истощения клеточной поверхности (CD39, LAG3, PD1, TIM3) в анти-CD19 CAR Т-клетках, полученных от двух доноров, измеренных после многократной стимуляции облученными клетками K562, экспрессирующими CD19. CAR содержали костимулирующие домены 4-1BB или CD28, не имели костимулирующего домена (т.е. только CD3ζ) или представляли собой нетрансдуцированные Т-клетки того же донора, что и контроль.

    B) Совокупные измерения для S1A, отображаемые как процент клеток, экспрессирующих 0-4 маркера истощения, для каждого донора, момента времени и CAR.

    C) Корреляция между репликами в объединенных скринингах для начальной пролиферации на 3 или 4 день (d3/d4) и относительной экспансии в пуле через две и три недели, показана отдельно для CD4 и CD8 Т-клеток. Репликация A — это донор 1, реплика B — это донор 2, а C — вторая реплика библиотеки в доноре 2, которая была запущена впоследствии.Измерения в каждом повторе были индивидуально масштабированы от 0 до 1, где 0 соответствует наименее пролиферативному/расширенному, а 1 соответствует наиболее пролиферативному/расширенному.

    D) Измерение FlowSeq процентного содержания клеток CD69+ для каждого домена библиотеки CAR как в клетках CD4, так и в клетках CD8, через 18 часов после добавления облученных клеток K562 с CD19 или без него. Клетки ранжируют на основе разницы в процентном содержании клеток CD69+ в условиях CD19+ и CD19-.

    E) Вулканические графики, показывающие относительную пролиферацию или размножение (в соответствии с метками панелей) CD4 или CD8 Т-клеток, экспрессирующих CAR, содержащие разные костимулирующие домены, во время анализа повторяющейся стимуляции с помощью CD19+ K562.Ось X показывает рассчитанную разницу в логарифмическом 2-кратном пролиферации/экспансии, а ось Y показывает связанное скорректированное значение P, рассчитанное с помощью алгоритма DESeq2.

    F) Сравнение пролиферации CAR Т-клеток от дней 0 до 3 в библиотеке со стимуляцией CD19 и без нее. На левых графиках показана масштабированная пролиферация, усредненная по каждому повтору (как на С), но сохраняются различия в относительной пролиферации между условиями CD19- и CD19+, которые были измерены одновременно в нашем анализе FlowSeq CTV.Правые графики показывают средний рейтинг CAR отдельно для условий CD19- и CD19+. Помечены самые эффективные мощные костимулирующие CAR на рисунке 2E. Слева ось Y усечена из-за более высокой относительной пролиферации в состоянии CD19+.

    Дополнительная таблица 1. Экспрессия отдельных косигнальных рецепторов по типу клеток.

    Список всех костимулирующих доменов в нашей библиотеке с указанием того, экспрессируются ли они различными типами иммунных клеток. Обратите внимание, что некоторые рецепторы могут иметь низкую экспрессию или экспрессироваться только при определенных обстоятельствах отдельными типами клеток.

    Чтобы имитировать состояние истощения, встречающееся у пациентов с высокой опухолевой массой, мы проводили повторяющиеся длительные стимуляции CAR Т-клеток в течение 24–33 дней. Это было достигнуто с помощью модели повторного заражения in vitro , где Т-клетки стимулировали дополнительными клетками CD19+ или CD19-K562 при постоянном соотношении Т-клеток и мишени 1:1 каждые три дня (рис. 1D). Клетки К562 перед добавлением облучали для снижения их пролиферативной способности и предотвращения быстрого истощения среды.После тестирования Т-клеток CD28 и 4-1BB CAR в этом анализе в течение 33 дней повторных стимуляций Т-клетки становились все более истощенными, основываясь на измерении четырех маркеров истощения (PD1, TIM3, LAG3, CD39) (рис. 1E, S1A, S1B). ). Кроме того, CAR, содержащий только сигнальный домен CD3ζ, проявлял значительный фенотип истощения к 15-му дню и не выживал после 24-го дня культивирования, что указывает на то, что эффекты костимуляции, которые имеют решающее значение для устойчивых ответов in vivo , по крайней мере, частично захваченный этой моделью in vitro (Esensten et al., 2016; Финни и др., 1998 г.; Лафферти и Каннингем, 1975 г.; Вайнкове и др., 2019).

    Чтобы эффективно охарактеризовать библиотеку «Объединение CAR» для нескольких анализов и моментов времени, мы использовали FlowSeq, подход к объединенным измерениям, который сочетает в себе FACS и секвенирование ампликонов для количественного измерения любых показаний на основе флуоресценции в генетически разнообразной популяции клеток (Goodman и др., 2013). Мы использовали FlowSeq для измерения различных маркеров функции Т-клеток, таких как активация (CD69), продукция цитокинов (IFN-γ и IL-2) и пролиферация с использованием красителя Cell Trace Violet (CTV).Для каждого объединенного анализа клетки сортировали либо по двум ячейкам (для экспрессии маркера), либо по четырем ячейкам (для разбавления красителя CTV) и раздельно секвенировали для сравнения функциональных различий между доменами для каждого анализа (рис. 1D, 1F). Этот мультиплексный подход к скринингу позволил нам сравнить степень, в которой домены по-разному влияют на активность CAR T между типами CD4 и CD8 T-клеток, а также между ранними и поздними стадиями стимуляции и экспансии антигена.

    Многомерное сравнение косигнальных доменов в течение нескольких недель экспансии идентифицирует подмножество с мощной костимулирующей активностью

    Антиген-индуцированная пролиферация варьируется в зависимости от CAR Т-клеток, экспрессирующих разные костимулирующие домены (рис. 2А).Несмотря на вариабельность доноров, относительная величина пролиферации в повторах была постоянной (рис. S1C), причем канонические костимулирующие домены CD28 и 4-1BB часто были среди доменов, которые способствовали наибольшей пролиферации (рис. 2А). Мы также измерили секрецию IL-2 и IFN-γ в CD4 CAR T-клетках (рис. 2B) и экспрессию CD69 как в CD4, так и в CD8 T-клетках (рис. S1D). CD28 CD4 CAR Т-клетки экспрессировали высокие уровни цитокинов, продуцируя больше IL-2, чем любой другой домен. Хотя некоторая секреция цитокинов желательна, высокие уровни продукции цитокинов ранее были связаны с гибелью клеток, вызванной активацией CD28 CAR T (AICD) (Künkele et al., 2015), истощение Т-клеток (Beltra et al., 2014; Liu et al., 2021) и более высокие показатели синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ) у пациентов (Zhao et al., 2020). Это говорит о том, что перепроизводство цитокинов может быть менее идеальным для клинического использования. Примечательно, что 4-1BB, BAFF-R, TACI и NTB-A показали более умеренную, но повышенную продукцию цитокинов по сравнению со средним показателем в популяции.

    Рисунок 2: Многомерное сравнение доменов, передающих сигнал, в течение нескольких недель расширения идентифицирует подмножество с мощной костимулирующей активностью.

    A) Измерение FlowSeq пролиферации CD4 (слева) и CD8 (справа) Т-клеток, содержащих различные домены библиотеки CAR, отдельно стимулированных in vitro с облученными CAR T в течение 3 или 4 дней (см. рис. 1C). Процент клеток с разным числом делений рассчитывали на основе секвенирования ампликонов отсортированных ячеек CTV. CAR ранжированы слева направо по среднему количеству клеточных делений в клетках CD4 или CD8 от самого высокого (слева) до самого низкого (справа). CAR CD28 и 4-1BB выделены синим цветом.Справа два донора показаны отдельно вместе с рейтингами CD28 и 4-1BB.

    B) Измерение FlowSeq внутриклеточного накопления цитокинов в доменах библиотеки в клетках CD4 через 18 часов после первоначального добавления облученных CD19+ или CD19 клеток K562. Клетки ранжируют на основе разницы в проценте цитокин-позитивных клеток в условиях CD19+ и CD19-.

    C) Относительное увеличение во времени библиотеки доменов CAR в CD4 и CD8 T-клетках, основанное на среднем кратном изменении численности библиотеки по сравнению с исходной библиотекой до стимуляции.Среднее из 3 повторов и двух доноров. 6 доменов CAR с наибольшей и наименьшей относительной экспансией отмечены зеленым и розовым цветом соответственно, а CD28 и 4-1BB отмечены синим цветом.

    D) Сравнение ранней и поздней антигенстимулированной пролиферации. Ось X измеряет общее расширение к 14 или 16 дню (d14/16) с более сильными CAR справа и менее сильными CAR слева. Ось Y измеряет отношение поздней пролиферации (d9-d16) к ранней пролиферации (d0-d3).CAR выше 0 по оси Y более расширены в библиотеке в более поздние моменты времени, а CAR ниже 0 более расширены ранее. Верхний правый квадрант указывает на то, что наиболее активные пролифераторы в целом демонстрировали относительно менее раннюю экспансию в первые три дня, в то время как менее активные CAR находятся в нижних квадрантах, демонстрируя более раннюю экспансию.

    E) Сравнение пролиферации и размножения CD4 и CD8 после стимуляции CD19+ K562. CAR, выделенные зеленым цветом, имеют статистически значимое увеличение экспансии (DESeq2) в анализе CD4 или CD8 Т-клеток.Зеленые точки большего размера соответствуют конструкциям, которые имеют значительно лучшую эффективность как в CD4, так и в CD8. Ось X представляет собой среднее кратное изменение CD4 и CD8 Т-клеток, а ось Y представляет собой соотношение между увеличением количества CD8 и CD4.

    F) Иерархическая кластеризация анализов CD19+ по доменам библиотеки CAR в Т-клетках CD4 и CD8. Все 40 доменов были сгруппированы на основе их z-показателей в каждом анализе, идентифицируя отдельный кластер из 8 сильнодействующих костимулирующих доменов, показанных справа (зеленая полоса).Небольшой набор доменов, плохо выполняющих различные функции CAR, показан слева (розовая полоса). Члены семейства рецепторов TNF отмечены черными точками.

    Отсутствие длительной персистенции Т-клеток CAR часто называют основной причиной антиген-позитивного рецидива у пациентов (Jafarzadeh et al., 2020). Измерение изменений в составе библиотеки с течением времени объединяет несколько аспектов динамики Т-клеток CAR, которые лежат в основе персистенции, включая пролиферацию и продолжительность жизни клеток. Секвенирование библиотеки ампликонами непосредственно перед стимуляцией позволило оценить базовое распределение библиотеки, а состав библиотеки впоследствии был измерен после первой, шестой и восьмой последующих стимуляций (дни 3 или 4, 14 или 16 и 24 соответственно).Используя эти измерения, мы смогли отследить относительное расширение и сжатие каждого CAR в библиотеке (рис. 2C). Многие из костимулирующих доменов, которые предпочтительно увеличивались после первой стимуляции, уменьшались в библиотеке после многократной стимуляции, что указывает на то, что начальная пролиферация плохо коррелировала с долгосрочной пролиферативной способностью и устойчивостью (рис. 2D). Мы также увидели различия между динамикой распространения CD4 и CD8 (рис. 2E). Большинство костимулирующих доменов в целом демонстрировали большую экспансию в Т-клетках CD8, за заметным исключением Т-клеток CD30, CD40 и 4-1BB CAR, которые после 24 дней стимуляции размножались в 2 раза больше в CD4, чем в CD8.Как отмечалось в предыдущих исследованиях, эти результаты подразумевают, что использование различных комбинаций костимулирующих доменов между CD4 и CD8 Т-клетками может улучшить общую терапевтическую эффективность CAR T (Guedan et al., 2018).

    Антиген-независимая пролиферация также значительно различалась среди клеток, экспрессирующих отдельные костимулирующие домены. В то время как общая пролиферация была повсеместно ниже без антигена, сильно пролиферативные домены также демонстрировали повышенную пролиферацию при совместном культивировании с клетками CD19-K562 (ρ Спирмена = 0.63-0,75, p = 1,3e -5 ), что указывает на то, что более высокая антиген-зависимая пролиферация сильно коррелирует с повышенной базальной пролиферацией (рис. S1F). Среди наиболее эффективных костимулирующих доменов CD28 и TACI продемонстрировали самую высокую степень неспецифической пролиферации, а CD40 — самую низкую (рис. S1F).

    Подсчет CAR по объединенным измерениям идентифицирует косигнальные домены с отчетливой стимулирующей или ингибирующей активностью

    Чтобы обобщить функциональность всех доменов в библиотеке по повторяющимся стимуляциям, была выполнена иерархическая кластеризация на основе относительной эффективности всех доменов (рис. 2F).Подмножество CAR, содержащих CD28, 4-1BB и несколько дополнительных доменов, четко сгруппировано в мощную костимулирующую группу, демонстрируя усиленные функции Т-клеток по сравнению со средним костимулирующим доменом в библиотеке (рис. 2F, справа). Меньший набор доменов сгруппирован в коингибирующую группу со сниженной пролиферацией и секрецией цитокинов в нескольких анализах (рис. 2F, слева). В описанной выше группе мощных костимуляторов иерархическая кластеризация дополнительно разделила домены на три подмножества.Первый состоял из доменов 4-1BB, CD30 и CD40, которые демонстрировали меньшую начальную пролиферацию и раннюю секрецию цитокинов, но были значительно обогащены после нескольких недель повторяющейся стимуляции, особенно в Т-клетках CD4. Вторая подгруппа мощных костимулирующих доменов — CD28, CD2 и NTB-A — демонстрировала более сильную начальную пролиферацию, экспрессию CD69 и секрецию цитокинов, но менее длительное расширение и устойчивость в пуле после повторной стимуляции. Последняя подгруппа — BAFF-R и TACI — имела промежуточный фенотип с повышенной начальной пролиферацией в CD8, аналогичной CD30, умеренной продукцией цитокинов и повышенной экспрессией CD69 в CD4, сравнимой с CD28.В целом, шесть наиболее мощных костимулирующих доменов CAR были распределены по спектру между сильным ранним ответом CD28 и усиленной экспансией на поздней стадии и смещением CD4 4-1BB, что позволяет предположить, что между этими двумя аспектами CAR T могут существовать неотъемлемые компромиссы. Мероприятия.

    Для дальнейшего сравнения общей эффективности различных костимулирующих доменов был проведен анализ основных компонентов (PCA) для всех объединенных измерений как со стимуляцией антигеном, так и без нее (рис. 3A, рис. S2A-C).PCA показал, что отдельные домены распределены по разнообразному костимуляторному ландшафту, при этом PC1 связан с ранней пролиферацией, секрецией цитокинов, активацией CD69 и тонической передачей сигналов, тогда как PC2 связан с долгосрочной экспансией CD8, меньшей секрецией цитокинов и ранней пролиферация и относительное отсутствие тонической передачи сигналов (рис. S2A). PC2 также показал значительную корреляцию с размером костимулирующего домена, предполагая, что увеличение расстояния между мембраной и CD3ζ снижает силу ранней активации и тонической передачи сигналов (рис. S2C).Это подтверждается недавней работой, показывающей, что изменение положения отдельных мотивов ITAM в CD3ζ может модулировать дифференцировку и формирование памяти (Feucht et al., 2019; Holst et al., 2008; James, 2018; Xu et al., 2008).

    Рисунок S2: Функциональная характеристика костимулирующего ландшафта и пролиферации, экспрессии CAR и метаболизма CAR с выбранными костимулирующими доменами стимуляция) к каждому основному компоненту графика PCA на рисунке 3A, S2B и S2C.Вклады сгруппированы по донорским репликам и разделены по разным временным точкам, пролиферации (CTV FlowSeq), экспансии (изменение относительной численности библиотеки с течением времени), внутриклеточных цитокинов FlowSeq и активации (CD69 FlowSeq).

    B) Изменение цвета рисунка 3A в соответствии с активностью предметной области (фигуры) и типами предметной области (цвета) в библиотеке, как показано на рис. 1A. Выбранные CAR показаны более крупными символами.

    C) Изменение цвета рисунка 3A в соответствии с длиной аминокислоты каждого костимулирующего домена, показывающее корреляцию между длиной домена (от синего до красного от самого короткого до самого длинного) и вторым основным компонентом.

    D) Относительное увеличение числа членов библиотеки CD28, 4-1BB, BAFF-R, TACI, CD40, CD30 и KLRG1 в течение 24 дней повторной стимуляции облученными клетками CD19-K562, как показано на рисунке 3B. Расширение количественно определяли путем расчета кратности изменения доли каждого CAR в библиотеке в каждый момент времени (ось X) по сравнению с исходным уровнем относительно среднего CAR в объединенной библиотеке. Библиотеку измеряли в первичных Т-клетках человека CD4 и CD8 по отдельности в 2-3 биологических повторах.

    E) Cell Trace Violet Гистограммы проточной цитометрии, как на рисунке 3C, для обоих доноров, всех типов Т-клеток и всех временных точек.

    F) Отношение поверхностной экспрессии CAR (путем окрашивания методом проточной цитометрии myc tag) к флуоресценции GFP для каждого CAR. Все варианты CAR были нормализованы к среднему значению для каждой временной точки, донора и типа Т-клеток (CD4 или CD8). Экспрессия с CD19+ K562, CD19-K562 и без клеток-мишеней показана отдельно.

    G) Нормализованная относительная метаболическая митохондриальная зависимость для CD4 и CD8 Т-клеток, измеренная среди выбранных CAR.Этот показатель основан на измерении синтеза белка с помощью метода SCENITH, который рассчитывает изменение общего метаболического выброса с добавлением и без добавления олигомицина, митохондриального ингибитора.

    Рисунок 3: Новый набор косигнальных доменов по-разному влияет на пролиферацию, долговременную экспансию, маркеры памяти и истощение и CD8 в условиях стимуляции как CD19+, так и CD19-, всех доноров и всех временных точек анализа.Выбранные CAR больше и показаны репрезентативными цветами.

    B) Относительное увеличение количества членов библиотеки CD28, 4-1BB, BAFF-R, TACI, CD40, CD30 и KLRG1 в течение 24 дней повторной стимуляции облученными клетками CD19+ K562 в объединенном скрининге. Расширение количественно определяли путем расчета кратности изменения доли каждого CAR в библиотеке в каждый момент времени (ось X) по сравнению с исходным уровнем относительно среднего CAR в объединенной библиотеке. Измерено в первичных Т-клетках человека CD4 и CD8 индивидуально в 2-3 биологических повторах.

    C) Временная шкала экспериментов для комплексных анализов пролиферации (описанных в D и E). Первичные Т-клетки CD4 и CD8 человека трансдуцировали отдельно CD28, 4-1BB, BAFF-R, TACI, CD40, CD30, KLRG1 или CD3ζ-только CAR. Затем очищенные CAR Т-клетки стимулировали 1:1 облученными клетками CD19+ или CD19-K562 каждые три дня. Пролиферацию оценивали с помощью CTV каждые 9 дней.

    D) Относительная пролиферация каждого CAR, определяемая количественно по относительному снижению MFI (т.е., разведение красителя CTV) между двумя донорами CD4 или CD8 Т-клеток. Более пролиферативные клетки отмечены желтым цветом, менее пролиферативные — темно-синим. Ось X указывает день окрашивания клеток. Белые прямоугольники представляют Т-клетки CAR, которые прекратили пролиферацию и выпали из культуры к этому моменту времени.

    E) Гистограммы окрашивания CTV Т-клеток CD4 или CD8 CAR у репрезентативного донора. Данные обобщены на панели D.

    F) Количественная оценка кумулятивной экспансии Т-клеток CD4, сконструированных с помощью CAR CD40 (фиолетовый), 4-1BB (светло-синий) или CD28 (темно-синий) и стимулированных, как описано на панели С.Совместные культуры измеряли каждые три дня, начиная с 3-го дня, с помощью проточной цитометрии и подсчета шариков. По оси Y измеряется кумулятивное кратное расширение каждые три дня (см. Методы).

    G) Клетки трансдуцировали и стимулировали, как описано на панели C. Каждые 9 дней в культуре клетки выдерживали в течение 6 дней без дополнительной стимуляции и оценивали поверхностную экспрессию PD1, LAG3 и TIM3 (известные маркеры истощения T клетки).

    H) Количество Т-клеток CD8 CAR, экспрессирующих 0-3 маркера истощения PD1, TIM3, LAG3 после 6-го и 15-го дня, как описано в G.Все CAR, маркеры и временные точки показаны на рисунке S3A и S3B.

    I) Поверхностная экспрессия CD27 на Т-клетках CD8 CAR, измеренная в течение 33 дней в культуре с использованием того же протокола, что и на панели G. Процент клеток с высоким содержанием CD27 показан для каждого CAR и дня справа, показывая, что CAR CD28 и 4-1BB со временем теряют экспрессию CD27 по сравнению с CAR BAFF-R и TACI. Все CAR и временные точки показаны на рисунке S3D.

    Рисунок S3: Характеристики истощения и дифференцировки CAR с выбранными костимулирующими доменами , измеренный после повторной стимуляции экспрессирующими CD19 облученными K562.

    B) Количество CAR Т-клеток, экспрессирующих 0–3 маркеров истощения PD1, TIM3 и LAG3, после разного количества дней в культуре, как показано на рисунке 3I, на основе протокола, описанного на рисунке 3G.

    C) Дифференцировка Т-клеток в разные моменты времени в течение повторного анализа стимуляции. Подмножества дифференцировки (наивные, центральная память (TCM), эффекторная память (TEM), эффекторная память RA-положительные (TEMRA)) были рассчитаны с использованием поверхностной экспрессии CD45RA и CD62L, как показано в таблице внизу панели.

    D) MFI CD27 для всех Т-клеток, временных точек и вариантов CAR T, как на рисунке 3I.

    Не было заметной кластеризации, основанной на специфической экспрессии клеточного типа или структуре семейства белков, за исключением вышеупомянутого обогащения членов семейства TNF в группе с сильными костимуляторами (рис. S2B). Примечательно, что некоторые домены, которые, как известно, являются ингибирующими в своем естественном контексте, такие как PD1 и CTLA4, существенно не снижали активацию или пролиферацию CAR.В то время как ранее было показано, что PD1 и CTLA4 функциональны в ингибиторном формате CAR в транс (Fedorov and Themeli, 2013) , все CAR в этой работе используют шарнирный и трансмембранный домен CD8 и содержат C-концевой домен CD3ζ, которые могут значительно изменить их сигнализацию. Однако некоторые домены, такие как KLRG1 и NKR-P1A, способны значительно снижать пролиферацию и активацию.

    Новый набор косигнальных доменов по-разному влияет на пролиферацию, долговременную экспансию, маркеры памяти и истощение. .Мы включили домены из каждого из трех подмножеств мощных костимулирующих доменов, описанных выше, и выбрали те из них, которые обладают повышенной устойчивостью к истощению. Эти домены включали BAFF-R (светло-зеленый), TACI (темно-зеленый), CD40 (светло-фиолетовый) и CD30 (темно-фиолетовый). Кроме того, KLRG1 (розовый) был включен в качестве верхнего потенциального ингибирующего домена, поскольку Т-клетки, экспрессирующие этот CAR, последовательно демонстрировали самую низкую начальную пролиферацию, активацию и продукцию цитокинов (рис. 2F). KLRG1 также представляет интерес, поскольку сильная ингибирующая кососигнализация может быть использована для остановки, ослабления или динамической модуляции функций Т-клеток (Fedorov and Themeli, 2013).Т-клетки, экспрессирующие различные CAR, продемонстрировали переменную относительную динамику размножения в объединенной библиотеке, при этом клетки, экспрессирующие BAFF-R, TACI, CD40 и CD30, проявляли повышенную устойчивость к 24 дню (фиг. 3B). Кроме того, Т-клетки, экспрессирующие выбранные CAR, также демонстрировали ряд пролиферативных фенотипов в отсутствие антигена, при этом CD30 демонстрировал наиболее независимую от антигена экспансию, а CD40 демонстрировал выраженное сокращение без стимуляции антигеном (рис. S2D). Наконец, 4-1BB, CD28 и CD3ζ CAR первого поколения были включены в качестве эталонов из-за их клинической значимости и обилия описаний в литературе (Kawalekar et al., 2016; Сан и др., 2020). Все CAR были сходны по экспрессии на поверхности и флуоресценции репортера T2A-GFP (рис. S2F).

    Расширенный анализ повторяющейся стимуляции in vitro был выполнен индивидуально для этих 8 CAR, чтобы подтвердить их пролиферативную активность в CD4 и CD8 Т-клетках. Пролиферацию измеряли еженедельно с использованием CTV в течение 33 дней повторяющейся антигенной стимуляции у двух отдельных доноров Т-клеток (рис. 3C, S2E). Репрезентативные измерения разбавления CTV для одного донора показаны вместе с количественными оценками среднего изменения MFI окрашивания Cell Trace Violet (рис. 3D, 3E).Эти распределенные стимуляции привели к относительной пролиферации, которая была аналогична объединенному скринингу, при этом CD28 демонстрировал меньшую пролиферацию в CD4 в более поздние моменты времени, CD40 вызывал сильную пролиферацию в CD4, 4-1BB и BAFF-R демонстрировали более сильную пролиферацию на поздней стадии в течение 33 дней. и KLRG1 демонстрируют значительно меньшее деление клеток в целом (рис. 3D). Наконец, вопреки нашим объединенным данным, CD30 вызывал первоначальный всплеск пролиферации, в первую очередь CD4, но в последующие недели он не сохранялся (рис. 3D, 3E).

    В дополнение к измерению пролиферации с помощью разведения CTV мы подсчитывали количество Т-клеток в культуре каждые 3 дня до повторной стимуляции дополнительными опухолевыми клетками K562 с помощью проточной цитометрии и гранул для подсчета клеток. Мы использовали эти подсчеты для расчета общего кумулятивного расширения каждого CAR. Подобно измерениям относительного расширения в нашем объединенном скрининге, здесь учитываются как пролиферация, так и устойчивость к гибели клеток. В Т-клетках CD4 от обоих доноров 4-1ВВ имели более высокую степень кумулятивной экспансии и персистенции, чем CD28, в соответствии с клиническими данными о том, что 4-1ВВ CAR Т являются лучшими долговременными пролифераторами in vivo и более устойчивы к истощение, чем CD28 CAR Ts.Тем не менее, мы обнаружили в течение 33 дней, что CD4 CAR Т-клетки с костимуляцией CD40 удвоились в среднем в 1,8 раза по сравнению с таковыми с 4-1BB или CD28 (92 601 p 92 602 = 3,3 × 10 92 166 -3 92 167), что указывает, как и в наш объединенный эксперимент, повышенная склонность к пролиферации и устойчивость к гибели клеток во время длительной антигенной стимуляции (рис. 3F).

    Недавнее исследование прочно связало различия в митохондриальном метаболизме с различиями в долговременной пролиферации (Kawalekar et al., 2016).Мы использовали SCENITH, метод, который использует олигомицин для ингибирования митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS) (Argüello et al., 2020), чтобы определить относительный вклад OXPHOS в общий метаболический выход вариантов CAR T через 21 день в культуре. Как и ожидалось, CD3-ζ-только CAR T продемонстрировал отчетливо низкий уровень митохондриального метаболизма как в CD4, так и в CD8, что указывает на повышенную зависимость от гликолиза. 4-1BB и CD28 CAR T были смещены в сторону OXPHOS или гликолитического метаболизма соответственно, как ранее отмечалось в литературе (Kawalekar et al., 2016). Т-клетки BAFF-R CAR продемонстрировали даже более высокую митохондриальную зависимость, чем 4-1BB, через 21 день, что соответствует их длительному сохранению в культуре после повторных стимуляций (рис. S2G).

    BAFF-R и TACI CAR сохраняют маркеры, связанные с персистенцией, и демонстрируют экспрессию маркера отсроченного истощения , CD39) и маркеры дифференцировки (CD62L, CD45RO, CD45RA, CD27, CCR7) в течение 33 дней длительной стимуляции (фиг. 3G, S3A-D).В то время как CAR демонстрировали относительно схожую дифференциацию с течением времени (рис. 3C), BAFF-R CAR Ts имели более медленное увеличение экспрессии маркера истощения, чем 4-1BB и CD28, о чем свидетельствует общее меньшее количество маркеров истощения на 6 и 15 дни в как CD4, так и CD8 (рис. 3H, S3B). Кроме того, как BAFF-R, так и TACI CD8 CAR Т-клетки демонстрировали устойчивую экспрессию CD27 с течением времени, в отличие от CD28 и 4-1BB, в которых экспрессия CD27 постепенно снижалась (рис. 3I). Мы не наблюдали эту тенденцию в CD4 (рис. S3D).Экспрессия CD27 была связана с выживанием CD8 T-клеток после экстенсивной пролиферации и устойчивостью к конечной эффекторной дифференцировке и сокращению (Carr et al., 2006; Dolfi et al., 2008; Hendriks et al., 2000, 2003). Наконец, как видно из наших анализов пролиферации, истощение KLRG1 CAR T и экспрессия маркера дифференцировки были наиболее сходны с нетрансдуцированными Т-клетками, что позволяет предположить, что KLRG1 ингибирует активацию, опосредованную доменом CD3ζ, удерживая большую часть популяции в наивном состоянии или памяти. состояние (рис. S3A, S3B, S3C, S3D).

    Сравнение секреции цитокинов и токсичности

    in vitro для косигнальных доменов

    Помимо пролиферации и персистенции, мы стремились измерить различия в цитотоксической активности CAR T как по секреции цитокинов, так и по способности уничтожать опухолевые клетки. Мы измерили продукцию цитокинов в Т-клетках CD4 у двух доноров с помощью внутриклеточного окрашивания после 1, 2, 3, 6 и 9 повторных стимуляций в культуре (рис. 4А, S4A). Большинство CAR демонстрировали максимальную продукцию цитокинов на 4-й день, после второй стимуляции антигеном.Хотя сравнения можно проводить в ранние сроки, ни один из CAR, включая те, которые содержат костимулирующие домены CD28 и 4-1BB, не продуцировал значительных количеств IFNγ, IL2 или TNFα, как было измерено внутриклеточным окрашиванием после 3 или более in vitro. стимуляции.

    Рисунок S4: Динамика продукции цитокинов, цитотоксичности и транскрипционной активности для CAR с выбранными костимулирующими доменами

    A) Средняя продукция цитокинов показана для всех Т-клеток, временных точек и вариантов CAR T, как на рисунке 4A.

    B) Цитотоксичность Т-клеток CD4 CAR количественно определяли через 80 часов (вверху) с репрезентативными графиками (внизу) для всех четырех доноров, экспрессирующих BAFF-R, TACI, CD28 или 4-1BB, как на рис. 4C и рис. 4D . Цвета для каждого CAR указаны на рисунке S4A. CAR ранжируются в каждый момент времени от наименее цитотоксического до наиболее цитотоксического (слева направо). Вертикальные пунктирные линии указывают анализируемые моменты времени.

    C) Мы инъецировали опухолевые клетки мезотелиомы 4e6 M28 подкожно в бок мышей NSG, как показано на фиг. 4E-G и S4D.Семь дней спустя мы внутривенно вводили 6e6 сконструированные 4-1BB CAR Т-клетки, нацеленные либо на ALPPL2, либо на CD19. Нетрансдуцированные Т-клетки и необработанные мыши были включены в качестве контроля. Опухоли измеряли штангенциркулем каждые 7 дней в общей сложности 30 дней.

    D) Размер опухоли показан через 49 дней после инъекции опухоли для всех Т-клеток, временных точек и вариантов TRAC-нокаутных CAR T, как на рисунках 4F-4G.

    E) Активность фактора транскрипции в процентах по отношению к нетрансдуцированным репортерным клеткам Jurkat показана для всех временных точек и вариантов CAR T, как показано на рисунке 4H.Цвета для каждого CAR указаны на рисунке S4A. В каждом столбце указана отдельная стимуляция: либо клетки CD19+ K562 (слева), клетки CD19-K562 (в центре), либо только среда (справа).

    Рисунок 4: Сравнение косигнальных доменов по показателям секреции цитокинов, сигнальных Т-клеток-репортеров, in vitro цитотоксичности и in vivo клиренса солидных опухолей

    A) Средняя продукция цитокинов через 1, 4 и 10 дней, измеряли у двух доноров с помощью окрашивания внутриклеточных цитокинов.Каждый CAR стимулировали K562, как показано на рисунке 3C, а цитокины накапливали внутриклеточно с помощью брефельдина и монензина перед окрашиванием и FACS (см. Методы). Процент цитокин-позитивных клеток каждого типа усредняли между двумя донорами.

    B) График экспериментов для анализов цитотоксичности in vitro . Первичные Т-клетки CD4 или CD8 человека трансдуцировали конструкцией CAR, отбирали с помощью FACS и подвергали повторным стимуляциям облученными K562.Один раз в неделю часть Т-клеток очищали от совместной культуры с помощью FACS и оставляли на ночь. Затем эти Т-клетки культивировали в соотношении 1:1 с mKate+ CD19+ K562 и визуализировали каждые 60 минут с помощью Incucyte в течение следующих 3-5 дней (см. панели C и D).

    C) Цитотоксичность CD4 (слева) или CD8 (справа) Т-клеток CAR количественно определяли через 80 и 32 часа, соответственно, путем расчета процента опухолевых клеток mKate+ в каждый момент времени по отношению к контрольным условиям без T клетки. CAR ранжируются в каждый момент времени от наименее цитотоксического до наиболее цитотоксического (слева направо).

    D) Репрезентативные графики анализа цитотоксичности Incucyte у двух доноров на 8-й и 22-й день для CD4 (слева) и на 0-й и 29-й день для CD8 (справа), отображающие процент опухолевых клеток mKate+, оставшихся по отношению к лунке с опухолевые клетки, но не Т-клетки (серые). Вертикальные пунктирные линии обозначают временные точки, проанализированные на панели C.

    E) Экспериментальная временная шкала для моделей опухолей in vivo . Мы инъецировали 4e6 опухолевые клетки мезотелиомы M28 подкожно в бока мышей NSG и через семь дней перенесли 6e6 сконструированные TRAC-нокаутные CAR Т-клетки внутривенно в хвостовую вену.Опухоли измеряли штангенциркулем каждые 7 дней, всего 49 дней.

    F) Опухоли либо не лечили, либо обрабатывали нетрансдуцированными Т-клетками, либо обрабатывали сконструированными CAR Т-клетками. Размер опухоли контролировали в течение 49 дней после инъекции опухоли. Показаны Т-клетки CAR, содержащие мощные костимуляторные домены, по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками и без контроля Т-клеток.

    G) Размер опухоли, как на F, демонстрирующий только контроль CD3ζ и CAR, ингибирующий KLRG1, по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками и без Т-клеток.

    H) Репортерные клеточные линии Jurkat транскрипционной активности для AP1, NFAT и NFκB трансдуцировали с каждым CAR и сортировали в пределах одного логарифма экспрессии GFP. Клетки стимулировали CD19+ K562 в течение 0, 8, 24 или 48 часов, а затем оценивали активность с помощью проточной цитометрии. Активность фактора транскрипции в процентах относительно нетрансдуцированных репортерных клеток Jurkat отложена на оси Y. Покоящиеся и CD19-K562-стимулированные Т-клетки CAR представлены на рисунке S4E.

    KLRG1 показал сниженную продукцию IFNγ, IL2 и TNF по сравнению с Т-клетками CD4 CAR, содержащими только CD3ζ, в каждый момент времени.С другой стороны, CD28 CAR Т-клетки продуцировали значительно более высокий уровень IL2 и IFNγ в течение первых двух недель стимуляции, что соответствует данным наших объединенных скринингов и в соответствии с предыдущими наблюдениями в литературе и у пациентов с CAR T ( Ин и др., 2019). Высокая продукция цитокинов в CAR Т-клетках была связана с более высокими показателями CRS во время начального ответа и повышенной склонностью к истощению Т-клеток на поздних стадиях. Т-клетки CD4 CAR с костимулирующими доменами BAFF-R и TACI демонстрируют такой же уровень секреции цитокинов, как и клетки с 4-1BB.

    Затем мы попытались провести продольное измерение цитотоксических способностей каждого CAR в культуре после интервалов повторной антигенной стимуляции до одного месяца. Для прямого измерения цитотоксичности in vitro мы использовали систему визуализации живых клеток Incucyte, которая позволяет проводить долгосрочную визуализацию флуоресцентно меченных опухолей и кокультур Т-клеток внутри инкубатора. В несколько моментов времени после повторной стимуляции антигеном мы сортировали с помощью FACS Т-клетки CD4 или CD8 из совместной культуры с облученными опухолевыми клетками K562 и оставляли их на ночь.На следующий день мы объединили отсортированные Т-клетки с красными флуоресцентными живыми опухолевыми клетками K562 в соотношении 1: 1 и выполнили покадровую микроскопию живых клеток совместной культуры, чтобы наблюдать уничтожение клеток (рис. 4B). Затем мы количественно определили процент опухолевых клеток, убитых либо через 80 часов (CD4), либо через 32 часа (CD8) после различного количества предшествующих повторных стимуляций (рис. 4C). Динамика гибели от нескольких репрезентативных экспериментов с визуализацией в реальном времени для двух доноров показана на рисунке 4D как процент опухолевых клеток K562, убитых с течением времени.

    Несмотря на то, что мы наблюдали различия в цитотоксичности между двумя донорами-людьми, BAFF-R и TACI постоянно демонстрировали более высокую цитотоксичность по сравнению с другими CAR, как по скорости уничтожения, так и по общему проценту уничтоженных опухолевых клеток, особенно после нескольких раундов продолжительной терапии. стимуляция антигеном (рис. 4C, 4D). Это было особенно заметно в Т-клетках CD4, где BAFF-R и TACI часто считались двумя главными цитотоксическими доменами (рис. 4С). Мы повторили эти анализы с двумя дополнительными донорами в CD4, сравнив четыре верхних домена (CD28, 4-1BB, BAFF-R, TACI) и подтвердили, что последние два нестандартных костимуляторных домена показали эквивалентное или усиленное уничтожение клеток (рис. S4C). ).

    Кроме того, мы увидели, что KLRG1 резко снижает цитотоксичность, часто убивая от 0 до 20% опухолевых клеток K562, по сравнению с CAR, содержащим только CD3ζ, с которым примерно 75% опухолевых клеток погибали в каждый момент времени (рис. 4C). . В сочетании с данными о пролиферации, истощении и дифференцировке это подтверждает гипотезу о том, что KLRG1 ингибирует домен CD3ζ и значительно ослабляет функцию Т-клеток CAR.

    BAFF-R и TACI CAR очищают

    in vivo модель солидной опухоли

    Для подтверждения наших наблюдений in vivo была использована установленная модель солидной опухоли мезотелиомы (M28), которая, как известно, вызывает стойкие опухоли, требующие CAR персистентность, а не быстрая начальная пролиферация (Hyrenius-Wittsten et al., 2021). Более медленная динамика роста модели М28 дает больше времени для определения клинической эффективности в отношении солидных опухолей и склонности к рецидивам. Чтобы использовать систему M28, мы экзогенно экспрессировали CD19 на клетках M28 и отсортировали клетки с экспрессией CD19, аналогичной K562. Мы инъецировали мышам NOD- scid IL2Rgamma null (NSG) 4×10 6 клеток M28 и через 7 дней обрабатывали их 6×10 6 анти-CD19 CAR Т-клетками. Чтобы сравнить динамику отторжения и убедиться, что CAR, нацеленные на экзогенно экспрессируемый антиген CD19, сопоставимы с CAR, нацеленными на эндогенно экспрессируемый антиген ALPPL2, мы организовали параллельный эксперимент in vivo с использованием либо анти-ALPPL2 4-1BB, либо анти-ALPPL2 4-1BB. Лечение CD19 4-1BB CAR.Мы не увидели различий в росте опухоли или динамике отторжения между обработками CAR, нацеленными на два антигена (рис. S4D). Подтвердив сходное отторжение опухоли между CAR, нацеленными на сконструированные и природные лиганды, мы сравнили различные костимулирующие домены CAR в модели M28 CD19 (рис. 4E). Мы не смогли различить разницу между 4-1BB и CD28 CAR в моменты времени, показанные здесь, несмотря на большое количество доказательств из исследований на людях, что 4-1BB увеличивает долговременную гибель и персистенцию.И 4-1BB, и CD28, а также наши новые методы лечения TACI и BAFF-R CAR продемонстрировали сходное исчезновение опухоли и ремиссию в течение 50 дней (рис. 4F). Кроме того, KLRG1 отражал результаты анализа цитотоксичности in vitro и продемонстрировал заметное увеличение опухолевой массы по сравнению со всеми CAR, включая CAR, содержащий только CD3ζ, при этом демонстрируя умеренную эффективность по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками (рис. 4G, S4E).

    Репортеры транскрипции указывают на различия в динамике ранней передачи сигналов между костимулирующими доменами

    Хотя большинство наших анализов указывало на различия в фенотипах CAR Т-клеток после продолжительных периодов стимуляции in vitro и in vivo , мы стремились определить, существуют ли были ранние различия в передаче сигналов при начальной активации каждого CAR, которые могли помочь понять механизмы, лежащие в основе этих фенотипических различий.Мы трансдуцировали каждый из 8 CAR в три системы репортерных Т-клеток Jurkat, которые индивидуально измеряли транскрипционную активность активаторного белка 1 (АР-1), ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT) и ядерного фактора каппа-В (NFκB) (Hyrenius -Витстен и др., 2021). Затем мы стимулировали эти очищенные CAR-положительные репортеры Jurkat опухолевыми клетками CD19+ или CD19-K562 в течение 8, 24 или 48 часов и измеряли их активность с помощью проточной цитометрии (рис. 4H, рис. S4E). Мы наблюдали значительные различия между активностью каждого CAR, индуцирующего транскрипционный фактор (TF).Т-клетки KLRG1 CAR имели пониженную активность для всех трех репортеров фактора транскрипции по сравнению с Т-клетками, содержащими только CD3ζ CAR, и нетрансдуцированными Т-клетками. Кроме того, для всех трех репортеров BAFF-R и TACI показали как ускоренную динамику, так и более высокий общий процент клеток с активностью TF. Это увеличение репортерной активности TF было наиболее выраженным для NFκB, который тесно связан с передачей сигналов рецептора TNF. Как и ожидалось, мы также наблюдали более высокий уровень базальной передачи сигналов NFκB от CAR семейства рецепторов TNF и сниженный базальный сигнал AP1 от CD40, что коррелирует с отсутствием у него тонической передачи сигналов (рис. S4E).

    Одноклеточные RNAseq и CITEseq характеризуют функциональные различия между новыми костимулирующими доменами CAR

    Заметные различия между CAR в анализе транскрипционного репортера позволяют предположить, что глубокий и беспристрастный анализ ранних транскриптомных сигнатур может объяснить их долговременные функциональные различия в цитотоксичности , пролиферацию и истощение, которые мы наблюдали на протяжении всей нашей совместной культуры с повторяющейся стимуляцией. В предыдущих исследованиях использовалось секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для сравнения CAR, содержащих домены CD28 и 4-1BB, для выявления различий в передаче сигналов, метаболизме и дифференцировке (Boroughs et al., 2020). Чтобы достичь всестороннего понимания фенотипического ландшафта CAR Т-клеток, включающих эти новые сигнальные домены, мы измерили экспрессию РНК одиночной клетки и панель антител CITE-seq из 75 белков (Stoeckius et al., 2017), чтобы картировать объективный транскриптом. измерения на хорошо изученных поверхностных маркерах Т-клеток. Мы отдельно трансдуцировали каждый CAR в массу CD3 Т-клеток от двух доноров РВМС и выполнили 10-кратную scRNAseq Chromium 3’ v3 через четыре дня в культуре со стимуляцией или без нее, обеспечиваемой облученными CD19+ K562.(Рисунок 5А).

    Рисунок 5: Одноклеточные RNAseq и CITEseq характеризуют функциональные различия между новыми костимулирующими доменами CAR клетки от двух доноров, как описано на экспериментальной временной шкале слева. UMAP разделяется на четко очерченные доли CD4 и CD8 (левая и правая стороны встраивания). Основной UMAP разделен по цвету на 8 фенотипических кластеров CD4 и 9 CD8.Нижняя вставка: UMAP окрашены в зависимости от фазы клеточного цикла, идентичности донора и стимулированных клеток по сравнению с покоящимися. На рисунке S5A показана версия этого UMAP отдельно для каждого CAR и условия стимуляции.

    B) Тепловая карта экспрессии дифференциально экспрессируемых генов во всех кластерах CD4 и CD8. Для каждого кластера показаны 50 лучших дифференциально экспрессируемых генов, которые упорядочены по иерархической кластеризации Z-показателей псевдообъемной экспрессии для всех кластеров и обоих доноров. Гены из 50 лучших для нескольких кластеров включаются только для кластера с наивысшим Z-показателем.Для каждого кластера четыре гена из топ-50, представляющих общий фенотип кластера, нанесены в правые рамки.

    C) Графики UMAP показывают относительную экспрессию CITEseq для поверхностной экспрессии 6 маркеров, связанных с дифференцировкой и активацией Т-клеток.

    D) Средние z-показатели для модулей гена MSigDB, связанных с различными аспектами активации Т-клеток, метаболизма и передачи сигналов среди трех основных активированных фенотипических кластеров в CD4 и CD8 Т-клетках.

    E) Обогащение стимулированных CAR Т-клеток, содержащих разные косигнальные домены в каждом фенотипическом кластере. Размер каждой точки соответствует проценту стимулированных CAR-T-клеток в кластере и с костимулирующим доменом. Цвет каждой точки соответствует двойному логарифмическому обогащению или обеднению кластера этого CAR по сравнению с другими. Кластеры расположены с наиболее активными в центре, чтобы соответствовать UMAP на панели A. Аналогичные графики для покоящихся клеток и разбивки по донорам представлены на рисунках S5C и S5E соответственно.

    F) Корреляция сигнатур генов Т-клеток, указывающих на усиленное приживление CAR T (вверху), выживаемость меланомы (в центре) и врожденную транскрипционную сигнатуру лимфоцитов (внизу), с фенотипическими кластерами в CD4 и CD8 CAR T-клетках (средний столбец) ) или с CAR, содержащими разные костимулирующие домены (правый столбец). Цвета кластеров и CAR соответствуют цветам на панели E. Две точки в группе соответствуют донорам A и B.

    Рисунок S5: Одноклеточный анализ CAR с выбранными костимулирующими доменами со стимуляцией антигеном и без нее для каждого костимулирующего домена CAR и условия стимуляции.Точки окрашены так же, как на рисунке 5A. Также показано дополнительное условие стимуляции шариков CD3/CD28, которое было выполнено только у донора 2.

    B) Экспрессия генов перекрывается в 5 парах кластеров, которые очень похожи между CD4 и CD8 (наивные/CD62L, память, IFNG). , OXPHOS и гликолитик). Список 100 наиболее дифференциально экспрессируемых генов был рассчитан для каждого кластера среди всех клеток CD4 или CD8. На этом графике показано процентное перекрытие в этих списках генов между кластерами, демонстрирующее заметное зеркальное отражение экспрессии генов по оси CD4/CD8 среди 5 совпадающих кластеров в нижнем левом квадранте.

    C) Обогащение покоящихся CAR Т-клеток, содержащих разные косигнальные домены в каждом фенотипическом кластере, аналогично рис. 5C. Размер каждой точки соответствует проценту стимулированных CAR Т-клеток с определенным костимулирующим доменом, который относится к кластеру. Цвет каждой точки соответствует двойному логарифмическому обогащению или истощению этого CAR в кластере.

    D) Z-значения CITE-seq для различных поверхностных белков среди Т-клеток в разных активированных кластерах, сгруппированные по их функциональной классификации.Z-показатели для CD4 и CD8 Т-клеток рассчитывали отдельно.

    E) Разбивка частоты кластеров среди всех стимулированных и покоящихся вариантов CAR обоих доноров. Длина столбца на оси X представляет собой процент каждого костимулирующего варианта CAR (покоящегося и стимулируемого отдельно) в этом кластере, так что сумма каждого набора столбцов в каждом граненом прямоугольнике равна 1. Столбцы представляют средний процент для обоих доноров, в то время как синие и красные точки представляют собой индивидуальные проценты для каждого донора.Цвет каждого столбца соответствует относительному обогащению log2 для этого варианта CAR в этом кластере по сравнению с другими вариантами CAR.

    F) Тепловые карты UMAP отображают относительную экспрессию РНК отдельных клеток (в индивидуальном масштабе), показывая подмножество функционально важных транскриптов, которые активируются в подмножествах IFNG и Memory.

    Мы использовали подход кластеризации на основе взвешенного графа ближайших соседей для объединения данных CITE-seq и scRNAseq по 79 892 клеткам с последующим уменьшением размерности UMAP (Hao et al., 2021). Это комбинированное встраивание белка и РНК разделило клетки на четко очерченные доли CD4 и CD8 (левую и правую), с покоящимися клетками на внешних краях и стимулированными клетками CD4 и CD8 в центре внизу, в отдельных, но смежных областях (рис. 5A, S5A), предполагая, что Т-клетки CD4 и CD8 CAR сходятся к более сходному активированному фенотипу после стимуляции CAR. Кроме того, хотя клетки были сгруппированы в 8 кластеров CD8 и 9 кластеров CD4 (рис. 5A, 5B), мы заметили выраженное зеркальное отражение программ транскрипции в 5 парах кластеров между CD4 и CD8 (наивные/CD62L, память, IFNG, OXPHOS, и гликолитический) и, таким образом, описывают эти кластеры соответствующими метками (рис. S5B).Покоящиеся CAR Т-клетки были обнаружены почти полностью в наивных (наивные/CD62L и наивные/CD7) кластеры и кластеры памяти, в то время как стимулированные клетки попали в три основных кластера с различными цитотоксическими и метаболическими транскрипционными и поверхностными белковыми сигнатурами (обсуждается ниже), а также как и несколько других кластеров с фенотипами между наивным и полностью активированным (рис. 5A-C).

    Активированные CAR Т-клетки делятся на 3 отдельных кластера, общих для CD4 и CD8

    Как в CD4, так и в CD8 Т-клетках активированные CAR T-домены разделяются на 3 отдельных кластера, которые мы назвали Glycolytic, OXPHOS и IFNG, которые различаются по экспрессии несколько важных метаболических генов и сигнальных путей (рис. 5B-5D).Клетки в гликолитическом кластере дифференциально расширены гены, участвующие в аэробном гликолизе ( ARG2 , PGK1 , LDHA ), LDHA ), , SLC2A3 , ENO1 , ALDOC ), Митохондриальная автофагия ( BNIP3 ) , белковые маркеры, участвующие в костимуляции и активации Т-клеток ( IL2RA , CD69 ), и ингибирующие рецепторы ( PD1 , CTLA4 ) (фиг. 5B, 5D, S5E). Клетки в кластере OXPHOS активируют гены, участвующие в окислительном фосфорилировании и метаболизме аргинина ( SRM , C1QBP , ATP5MC3 , MT-CO3 ), а также пути Myc, MTOR и PI3K (рис. 5D).Третий активированный кластер, который мы назвали IFNG, обладает выраженной цитотоксической экспрессией, экспрессируя высокий уровень транскрипта IFNG, а также множественные гранзимы и цитотоксические молекулы, включая GZMB , GZMK , GZMH , NKG7 , и ПРФ1. Клетки CD4 и CD8 IFNG также обильно экспрессируют как РНК, так и белок для MHC класса II и CD74, шаперона MHC класса II, а также различных рецепторов интегринов и хемокинов, включая ITGB2 (CD29), ITGA2 (CD49b). , ITGA4 (CD49d), CXCR3 и CCR5 .Кластер IFNG больше похож на Glycolytic, чем на OXPHOS, но показывает дифференциальную и общую более низкую экспрессию различных маркеров ингибирующих и активационных белков, включая IL2RA, OX40, 4-1BB, PD1 и GITR, при этом экспрессируя более высокий уровень маркеров памяти, включая CD95. и CD45RO (рис. 5C).

    Идентифицировав различные состояния активации и транскрипционные сигнатуры в кластерах CAR, мы затем попытались идентифицировать те, которые были по-разному обогащены костимулирующими доменами (рис. 5E, рис. S5A, S5C, S5E).В то время как все 5 костимуляторных доменов присутствуют в трех наиболее активированных кластерах, CAR, содержащие костимулирующий домен CD28, были обогащены гликолитическими кластерами CD4 и CD8, в то время как CAR BAFF-R особенно обогащен цитотоксическими кластерами IFNG. BAFF-R также является наиболее обогащенным кластером памяти после стимуляции, что указывает на то, что большая часть CAR Т-клеток, содержащих этот домен, оставалась в менее активированном и менее дифференцированном состоянии после стимуляции CAR. Это расхождение в обогащении BAFF-R и CD28 наблюдалось у обоих доноров (рис. S5E).

    Кластер IFNG соответствует множественным признакам улучшенного клинического ответа, приживлению CAR

    Ни ксенотрансплантаты мышей, ни анализы in vitro не являются идеальным показателем для сравнения эффективности терапии адоптивного переноса у пациентов, но получены беспристрастные и многомерные данные секвенирование отдельных клеток дает возможность идентифицировать транскрипционные сигнатуры, которые коррелируют с положительными клиническими исходами у пациентов. Мы обнаружили, что цитотоксический кластер IFNG близко соответствует генным сигнатурам, связанным с эффективностью TIL и CAR, выявленным в двух недавних исследованиях.Исследование клональной кинетики у пациентов, проходящих иммунотерапию CAR T, выявило сигнатуру гена, обогащенную клонами CAR T, которые преимущественно размножались (IRF, повышенная относительная частота) у пациентов через 1–2 недели после инфузии (Sheih et al., 2020). Мы обнаружили, что эта сигнатура гена IRF показала отчетливое и значительное перекрытие с нашими кластерами CD4 и CD8 IFNG (p = 1×10 -9 ), и что BAFF-R CAR показал особое обогащение этой сигнатурой экспансии CAR (рис. 5F). ). Второе исследование, проведенное Николетом и его коллегами, выявило сигнатуру экспрессии Т-клеток, которая, как было показано, приводит к повышенной секреции IFNγ и повышению выживаемости у пациентов с меланомой (Nicolet et al., 2020). Их исследование связало эту подпись цитотоксического гена с интегрином CD29. В кластере IFNG и, в частности, в Т-клетках BAFF-R CAR мы наблюдаем заметную активацию CD29, а также CD49d, которые вместе образуют гетеродимерный интегриновый комплекс VLA-2, который связан с более сильными эффекторными ответами Т-клеток памяти. (Рисунок S5D, S5F) (Кассиотис и др., 2006; Ян и др., 2008).

    Помимо повышенной экспрессии генов MHC и интегринов, кластеры IFNG и Memory также экспрессируют несколько рецепторов, более типичных для NK-клеток, в том числе KLRB1 , который кодирует CD161.CD161 экспрессируется подмножеством Т-клеток с характерным возвращением к тканям (Billerbeck et al., 2010) и повышенной цитотоксичностью (Fergusson et al., 2014), а недавняя работа показала, что CD8+CD161+ T-клетки определяют мощную подгруппу эффекторной памяти. с повышенной эффективностью Т-клеток CAR (Konduri et al., 2021). Для дальнейшего изучения этого вопроса мы обратились к недавнему исследованию, в котором был выявлен непрерывный градиент экспрессии генов врожденности лимфоцитов от Т-клеток к NK-клеткам (Gutierrez-Arcelus et al., 2018). Эта врожденная программа экспрессии генов лимфоцитов в значительной степени перекрывается с транскриптами, обогащенными в наших кластерах IFNG и памяти, транскриптами, обогащенными активированным BAFF-R CAR, а также клиническими признаками приживления CAR T и экспрессии CD29/IFNγ, которые мы идентифицировали из недавней литературы (рис. 5F, S5F).Неожиданное совпадение этих разрозненных данных свидетельствует о связи между врожденной экспрессией генов и полезными цитотоксическими фенотипами CAR. В целом, мы показываем, что эти новые сигнальные домены CAR способствуют измененным состояниям клеток, в том числе тем, которые связаны с потенциально полезными противораковыми реакциями.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Костимуляция необходима для долгосрочной пролиферации, дифференцировки и выживания Т-клеток, и известно, что она значительно повышает эффективность CAR Т-клеток.В то время как канонические костимуляторные домены Т-клеток, такие как 4-1BB и CD28, хорошо изучены, широкий спектр известных косигнальных доменов еще предстоит протестировать в CAR, и степень, в которой сигнальные домены из других типов клеток могут действовать на Т-клетки, плохо изучена. понял. Здесь мы идентифицировали несколько новых косигнальных доменов посредством скрининга объединенных библиотек в первичных Т-клетках человека, которые повышают персистенцию или цитотоксичность по сравнению с теми, которые используются в текущем поколении CAR, одобренных FDA. Путем скрининга 40 доменов мы показываем широту косигнального ландшафта в первичных Т-клетках CAR человека.Мы заметили, что многие из измеренных наиболее мощных костимулирующих доменов принадлежали к семейству рецепторов TNF, к которому также принадлежит 4-1BB. Известно, что передача сигналов 4-1BB увеличивает персистенцию Т-клеток и пролиферацию на поздних стадиях по сравнению с CD28 (Weinkove et al., 2019), и наш скрининг показывает, что это свойство распространяется на несколько других членов семейства рецепторов TNF, особенно CD40 и BAFF- Р. Основываясь на результатах нашего объединенного скрининга, мы выбрали 4 новых стимулирующих CAR из семейства рецепторов TNF, а также новый ингибирующий CAR и выполнили всестороннюю характеристику их пролиферации, персистенции, дифференцировки, истощения, продукции цитокинов и цитотоксичности in vitro и in vivo в течение 4-5 недель.Характеристика этих доменов отдельно в CD4 и CD8 позволила нам выявить эффекты, характерные для каждого типа клеток. Мы обнаружили, что сигнальные домены BAFF-R и TACI обладают повышенной цитотоксичностью, CD40 обладает повышенной персистенцией в CD4, а KLRG1 может сильно ингибировать передачу сигналов на основе ITAM, предотвращая многие характерные признаки активации и дифференцировки Т-клеток.

    Чтобы определить различия в экспрессии генов, вызванные нашим курируемым набором костимулирующих доменов, мы исследовали транскриптомный профиль каждого CAR и экспрессию поверхностных белков с помощью scRNAseq и CITEseq как до, так и после воздействия антигена.Мы наблюдали явные различия в экспрессии генов и белков между 8 CAR и клетками, разделенными на кластеры, в зависимости от степени их дифференцировки, активации, цитотоксичности и метаболизма. Мы наблюдали характерное зеркальное отражение многих из этих кластеров по оси CD4-CD8. Активированные Т-клетки CAR попали в три отдельных кластера, которые различались по экспрессии ключевых метаболических и цитотоксических генов. Мы назвали эти кластеры Glycolytic, OXPHOS и IFNG. Кластер IFNG был значительно обогащен CAR, содержащими костимуляторный домен BAFF-R, который также показал сильную цитотоксическую и пролиферативную активность в наших предшествующих анализах in vitro и in vivo .Затем мы обнаружили значительное совпадение между этим кластером IFNG и генными сигнатурами из нескольких других недавних исследований инфузионных продуктов 4-1BB CAR и эффективности TIL у больных раком, предполагая, что эта сигнатура коррелирует с более высоким приживлением, персистенцией и отторжением опухоли. По сравнению с 4-1BB, BAFF-R CAR-T-клетки примерно вдвое обогащены (в 3 раза по CD4, в 1,5 раза по CD8) по этой сигнатуре гена, что позволяет предположить, что инфузионный продукт BAFF-R CAR будет иметь гораздо большую долю клетки в этом гиперэффективном состоянии, что может привести к улучшению результатов лечения пациентов.Самое удивительное, что эта генная сигнатура, а также сигнатуры других коррелирующих клинических исследований, картируется на врожденной программе лимфоцитов, более родственной iNKT, γδ Т-клеткам и NK-клеткам, чем αβ Т-клеткам. Хотя эта ассоциация остается коррелятивной, а взаимосвязь между эффективностью CAR и экспрессией NK-подобных генов сложна (Fergusson et al., 2014; Konduri et al., 2021; Mathewson et al., 2021), она предполагает захватывающее пересечение между различными Фенотипы костимулирующей передачи сигналов CAR и многообещающая эффективность CAR-NK-клеток (Xie et al., 2020).

    Хотя «объединение CAR» позволяет нам напрямую сравнивать беспрецедентное количество сигнальных доменов, могут возникать расхождения между производительностью доменов в пуле и в массиве. Например, мы наблюдали сильное долгосрочное увеличение количества CD30 в объединенных скринингах, но более быстрое истощение в последующем скрининге с решеткой. Потенциально это может быть связано с паракринными сигналами или продукцией цитокинов соседними CAR Т-клетками в пуле. Таким образом, последующее комплексное тестирование CAR может иметь решающее значение для исключения паракринных эффектов.Другой стратегией может быть буферизация или нормализация паракринных эффектов путем объединения библиотеки с большей долей нетрансдуцированных или CD3ζ Т-клеток первого поколения. Кроме того, мы также наблюдали некоторые различия между эффективностью in vitro и in vivo , такие как отсутствие противоопухолевой эффективности in vivo в отношении CD40. Чтобы устранить такие несоответствия, объединенный скрининг экспансии и персистенции CAR Т-клеток также может быть выполнен непосредственно in vivo. Измерения цитотоксичности (посредством продукции цитокинов, гранзимов или CD107a) также могут быть выполнены ex vivo после внутриопухолевого размножения библиотеки.

    Хотя мы в первую очередь занимаемся здесь идентификацией улучшенных костимулирующих доменов, важно отметить, что новый CAR KLRG1 является не просто отрицательным контролем, но потенциальным инструментом для контроля активности CAR. Такой инструмент может быть полезен для уменьшения синдрома высвобождения цитокинов, отмены внеопухолевой активации вне опухоли и даже для генерации посттрансляционных колебаний активности CAR, которые будут имитировать естественную динамику передачи сигналов TCR. Таким образом, объединенные скрининги можно использовать не просто для нахождения наилучшего костимулирующего домена, а скорее в качестве инструмента открытия для понимания того, как сигналы различных рецепторов изменяют биологию Т-клеток и как эти сигналы можно модулировать для манипулирования функцией Т-клеток помимо оптимизации одного химерного антигенного рецептора.

    Большая часть существующей литературы склоняется к одномерному сравнению CAR как более или менее эффективных в целом, в то время как вместо этого мы наблюдали, что отдельные CAR часто превосходили определенные тесты или когда экспрессировались в разных типах Т-клеток. Эта многомерность костимуляции была несколько неожиданной, подтверждая, что то, что обычно называют монолитным «сигналом 2», вместо этого представляет собой множество гетерогенных путей, иногда противоположных, которые можно индивидуально настроить для оптимизации различных аспектов функции Т-клеток.Это также говорит о том, что будущая инженерия могла бы изолировать отдельные сигнальные мотивы для усиления специфических фенотипов Т-клеток и создания синтетических комбинаторных доменов, которые оптимизированы для конкретных ScFv, типов опухолей или для лучшей борьбы с функциональными недостатками, наблюдаемыми в CAR для солидных опухолей. Наконец, в дополнение к разработке лучших терапевтических средств, будущие высокопроизводительные исследования помогут выяснить «правила дизайна» для синтетических рецепторов и сигнальных мотивов, создать новые мощные инструменты для манипулирования Т-клетками для фундаментальных исследований в области иммунологии и привести нас к более глубокому пониманию. дифференцировки Т-клеток, их развития и иммунозависимых заболеваний.

    МЕТОДЫ

    Создание библиотеки

    Внутриклеточные костимулирующие домены (ICD) были синтезированы в виде фрагментов гена gBlock от Integrated DNA Technologies. Эти фрагменты амплифицировали с обычными праймерами, имеющими гомологию с клонирующей основой E. coli, и продукты ПЦР индивидуально клонировали в основу в 96-луночных планшетах, после чего колонии проверяли последовательность после клонирования с помощью секвенирования по Сэнгеру. Каждый клонированный костимулирующий домен культивировали и препарировали отдельно, а затем объединяли в молярном соотношении 1:1.Фрагмент, содержащий промотор SFFV и N-концевую часть CAR вплоть до костимуляторного домена, вставляли перед объединенной плазмидной библиотекой ICD с использованием сборки Golden Gate и электропорации. Затем эту завершенную клонирующую CAR плазмиду расщепляли для отделения промотора, CAR и нижестоящего маркера GFP от основной цепи. Расщепленную библиотеку плазмид, наконец, экстрагировали из геля и вставляли посредством рестрикционного клонирования и электропорации в расщепленный и извлеченный из геля лентивирусный скелет pHRSIN.Мы оптимизировали процедуру клонирования, чтобы обеспечить надлежащее покрытие библиотеки, в среднем не менее 1000 КОЕ на члена библиотеки на каждом этапе объединенной электропорации.

    Краситель CellTrace Violet (CTV)

    Т-клетки брали из культуры, ресуспендировали и промывали PBS. Мы ресуспендировали культуру до 1e6 клеток/мл 5 мкМ раствора Cell Trace Violet (CTV) в PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение двадцати минут в темноте. Затем мы добавили 5 мл Т-клеточной среды сверху на каждые 1e6 окрашенных клеток и инкубировали еще 10 минут в темноте.Затем клетки осаждали центрифугированием при 500 g в течение 5 минут, ресуспендировали и высевали в Т-клеточную среду при 1e6 клеток/мл. Чтобы стимулировать пролиферацию, мы высевали равное количество K562 по отношению к общему количеству Т-клеток в каждой лунке, с экспрессией CD19 или без нее, при конечной концентрации 0,5e6 K562s/мл и 0,5e6 T-клеток/мл. Мы оценили пролиферацию через 3 дня после стимуляции CD4 с помощью проточной цитометрии. Мы повторно стимулировали Т-клетки дополнительной дозой K562 через 3 дня после первоначальной стимуляции.Чтобы определить пролиферацию после длительного совместного культивирования, а не останавливать, мы сохранили часть клеток отдельно в культуре и окрашивали на 9-й день (CTV2), 18-й день (CTV3) или 27-й день (CTV4) после начальной стимуляции. Мы анализировали пролиферацию на 16-й день (CTV2), 24-й день (CTV3) или 33-й день (CTV4) с помощью проточной цитометрии.

    CD69

    Для определения степени активации каждого CAR мы стимулировали антиген-наивные Т-клетки с помощью K562, либо с экспрессией CD19, либо без нее, в соотношении 1:1. Через 24 часа после посева совместной культуры клетки центрифугировали при 500g в течение 5 минут, дважды промывали проточным буфером (PBS + 2% FBS) и окрашивали антителами против CD69 при 4°C в течение 20 минут.Мы дважды промывали клетки проточным буфером и запускали на проточном цитометре.

    Цитокины

    Чтобы определить степень продукции цитокинов при активации каждого CAR, мы стимулировали антиген-наивные Т-клетки с помощью K562, либо с экспрессией CD19, либо без нее, в соотношении 1:1. Через 3 дня мы повторили совместное культивирование со вторичным болюсом K562 (см. вышеприведенный метод). Затем через 12 часов мы добавили 2 раза брефельдин А еще на 6 часов. Мы центрифугировали клетки при 500 g в течение 5 минут, дважды промывали проточным буфером (PBS + 2% FBS), окрашивали антителами против CD4 или -CD8 при 4°C в течение 20 минут.Мы дважды промывали клетки проточным буфером и добавляли 100 мкл фиксатора (50 мкл проточного буфера + 50 мкл Invitrogen IC fix) в каждую лунку. Инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. После фиксации мы вращали клетки при 600g в течение 5 минут и ресуспендировали в Cytolast для продолжения окрашивания на следующий день. Чтобы пермеабилизировать клетки, мы добавили 200 мкл 1x пермеабилизационного буфера в каждую лунку, сразу же центрифугировали при 600 g в течение 5 минут и окрашивали на внутриклеточные антигены антителами против IL-2, -TNF□ и -IFNγ, разведенными в буфере для пермеатизации.Мы окрашивали в 50 мкл при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. Затем мы дважды промывали буфером Permeabilization и запускали его на проточном цитометре.

    Incucyte

    50 мкл 5 мкг/мл фибронектина распределяли в каждую используемую лунку 96-луночного планшета. Планшет инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре и удаляли фибронектин, после чего инкубировали еще 60 минут при комнатной температуре. Как Т-клетки CAR, так и живые клетки-мишени K562 (либо экспрессирующие mKate и CD19, либо только mKate) центрифугировали и ресуспендировали в среде Jurkat + 30 ед/мл IL-2; Среда Jurkat (среда RPMI-1640 + 10% FBS + 1% PenStrep + 1X Glutamax) имеет меньшую флуоресценцию, чем среда на основе X-VIVO-15.Клетки подсчитывали и разбавляли до 0,25e6/мл каждую, и по 100 мкл каждой (Т-клетки и мишени) добавляли в каждую лунку до конечного объема анализа 200 мкл. Каждое условие выполнялось в двух экземплярах до тех пор, пока было доступно достаточное количество клеток. Мы позволили планшетам отстояться при комнатной температуре в течение 30 минут перед началом анализа инкуцитов. Изображения делались каждые 60 минут с использованием программного обеспечения Incucyte в ходе экспериментов (см. соответствующие цифры для общего времени анализа, которое варьировалось в зависимости от условий).

    Расщепление/Посев

    Образцы крови в виде лейкопаков были получены от здоровых мужчин и женщин-добровольцев с помощью STEMCELL Technologies. Т-клетки выделяли с помощью набора для отрицательной селекции CD4 или CD8 и замораживали. Мы стимулировали Т-клетки через 24 часа после оттаивания с помощью 25 мкл гранул CD3/CD28 (термофишерские гранулы Dynabeads) на 1e6 Т-клеток. Концентрированный лентивирус добавляли через 48 часов после оттаивания для достижения скорости трансдукции ниже 15% для экспериментов с объединенной библиотекой и от 30 до 50% для матричных скринингов.Вирус удаляли в течение 18 часов после добавления, и клетки размножались. Через пять дней после оттаивания шарики удаляли с помощью магнитной сепарации и клетки сортировали по экспрессии GFP, по крайней мере, на половину логарифмического уровня выше, чем у отрицательной популяции, и с охватом не более логарифма MFI. Клетки высевали при 0,5e6 клеток/мл и делили каждые три дня до этой плотности до 10-14 дней после оттаивания.

    Для объединенных экспериментов мы начали стимуляцию на 10-й день, а для объединенных экспериментов мы начали стимуляцию на 14-й день.Для стимуляции Т-клеток мы объединили их 1:1 с облученными К562 (см. следующий метод), которые либо экспрессировали, либо не экспрессировали поверхностный человеческий CD19, и высевали с плотностью 0,5e6 Т-клеток/мл. Каждые три дня мы вращали, ресуспендировали и подсчитывали культуры, чтобы разделить Т-клетки и добавить больше облученных K562. Мы подсчитывали Т-клетки, добавляя аликвоту ресуспендированной культуры к гранулам CountBright и подсчитывая количество Т-клеток с помощью анализа на проточном цитометре BD X-50. Культуры повторно стимулировали добавлением дополнительных облученных К562 в соотношении 1:1 к общему количеству Т-клеток в каждой культуре.Их пересевали при плотности 0,5e6 Т-клеток/мл. Это повторялось в течение 3-33 дней.

    Используемая среда: X-VIVO 15 + 5% hAb сыворотка + 10 мМ NAC, нейтрализованная 1 н. раствором NaOH + 0,5% пен/стрептококк + 1X бета-меркаптоэтанол.

    Облучение Ks

    Живые клетки K562 (ATCC® CCL-243™) выращивали в колбах T182 до слияния. Клетки ресуспендировали до концентрации 10e6/мл на льду и облучали с помощью облучателя Cesium-137 в течение 20 минут (приблизительно 200 рад/мин) в соколе объемом 50 мл, общая доза составляла приблизительно 4000 рад.Затем клетки разделяли на аликвоты и замораживали в среде IMDM, содержащей 10% ДМСО и 10% FBS в жидком азоте, до тех пор, пока они не понадобятся в протоколе.

    Экстракция/секвенирование ДНК

    После анализов сортировки клеток с активированной флуоресценцией, после выращивания in vitro с клетками-мишенями или после трансдукции в качестве базовой меры численности библиотеки Т-клетки, содержащие библиотеку CAR, центрифугировали в осадок, удаляли супернатант и замораживали при -80°С. Затем из клеток получали геномную ДНК с использованием колонки Machery-Nagel Nucleospin Tissue XS, колонки Machery-Nagel Nucleospin или планшета для экстракции тканей Nucleospin 96.Соблюдались протоколы производителя, за исключением добавления 10 мкг полиаденилированной РНК к каждому образцу для увеличения выхода.

    После подготовки гДНК для количественного определения экстрагированной геномной ДНК использовали Picogreen и планшетный флуоресцентный ридер. Первичную ПЦР-амплификацию области костимулирующего домена из разных образцов (ПЦР1) проводили в 3 серии с разным количеством циклов (12, 16 или 22 цикла) в зависимости от концентрации геномной ДНК. ПЦР проводили с Takara ExTAQ, чтобы можно было использовать максимальную концентрацию матрицы в реакции ПЦР.Реакции проводили в 70 мкл с использованием от 200 до 1000 нг ДНК в качестве матрицы в зависимости от партии, как описано выше.

    Для последующей ПЦР с добавлением штрих-кодов и адаптеров Illumina к продуктам (ПЦР2) все продукты из ПЦР1 были разведены в 15 раз, и 25 мкл матрицы было использовано в 50 мкл реакции с Takara ExTAQ. Для каждого образца для ПЦР2 использовались разные прямые и обратные праймеры, чтобы добавить к каждому образцу уникальные пользовательские последовательности штрих-кодов Illumina I5 и I7.

    Наконец, продукты ПЦР2 снова были количественно определены с использованием Picogreen в планшетном флуоресцентном ридере.Эти продукты объединяли в молярном соотношении 1:1, разбавляли, загружали и запускали на картридже MiniSeq 2×150 циклов, используя стандартные протоколы производителя.

    Анализ секвенирования

    После демультиплексирования последовательности костимулирующих доменов CAR в формате FASTQ для каждого образца были обрезаны с помощью адаптера, отсортированы, дедуплицированы и выровнены с использованием пользовательских сценариев Python и BWA-mem. Затем эти выравнивания были преобразованы в таблицы подсчета и проанализированы с использованием DESeq2 и пользовательских сценариев R (https://github.com/dbgoodman/tcsl-lenti).

    scRNAseq: очистка и трансдукция Т-клеток

    Эксперименты для каждого донора проводились отдельно в разные дни. Т-клетки CD3 очищали от РВМС, экстрагированных либо из лейкопак, либо из остатков TRIMA, как более подробно описано выше. Затем CAR лентивирусно трансдуцировали в объемные CD3 с использованием тех же методов, которые были описаны ранее, и через пять дней после трансдукции Т-клетки подвергали FACS-сортировке через пять дней после трансдукции на основе экспрессии маркера GFP, основанной на диапазоне в один логарифм от среднего значения. выражение во всех конструкциях.Нетрансдуцированные Т-клетки не сортировали.

    scRNAseq: стимуляция Т-клеток и 10-кратная подготовка

    Через пять дней после сортировки (всего 10 дней после трансдукции) клетки 2e6 высевали либо с 2e6 облученными клетками CD19+ K562 (описано выше), либо повторно высевали в свежую среду без клеток K562, при плотность 1e6 Т-клеток/мл, всего 18 состояний на донора Т-клеток: 6 CAR второго поколения (исключая CD30), CAR только CD3ζ и нетрансдуцированные Т-клетки, как с сокультурой K562, так и без нее.Для второго донора также выполняли условия стимуляции CD3/CD28 Dynabead с нетрансдуцированными клетками в соответствии с инструкциями производителя. Для обоих доноров также был получен контрольный образец, содержащий только K562. После совместного культивирования в течение 48 часов клетки в каждом состоянии индивидуально подсчитывали и окрашивали CD3, DRAQ7 и уникальными комбинациями двух хэштег-антител TotalSeq-B (Biolegend) в соответствии с инструкциями производителя. После окрашивания клетки объединяли примерно в равных соотношениях на основании подсчета, проведенного до окрашивания.Затем объединенные клетки сортировали на основе FSC/SSC, CD3, GFP и DRAQ-7-отрицательных ворот для удаления мертвых клеток и облученных K562. Наконец, отсортированные клетки окрашивали с использованием панели антител BD Bioscience ABseq, загружали и обрабатывали с помощью стандартного конвейера секвенирования Chromium V3 3’. На каждого донора загружали две дорожки по 60000 клеток на дорожку. Клетки можно было загружать с такой высокой плотностью, потому что дублеты можно было идентифицировать на основе коллизий штрих-кодов HTO между образцами. Для каждого донора была проведена одна 200-цикловая дорожка секвенирования Novaseq S4 Illumina (всего приблизительно 6e9 прочтений).

    scRNAseq: загрузка и очистка данных

    Счетчики UMI были сгенерированы с помощью CellRanger v5.0.1 с использованием стандартных настроек и импортированы в Seurat v4, R v4.0.4, Rstudio v1.4. Комбинации штрих-кодов деконволюционировали с использованием пользовательских скриптов, а потенциальные двойники определялись и удалялись на основе коллизий штрих-кодов (https://github.com/dbgoodman/tcsl-lenti). Клетки CD4 и CD8 идентифицировали на основании экспрессии РНК и ADT CD4/CD8, а дважды положительные клетки исключали из рассмотрения.Клетки, чьи UMI происходили из митохондриальных генов более чем в 25% случаев, были удалены. Всего после удаления потенциальных дублетов и клеток, обогащенных митохондриальной РНК, осталось 79 892 клетки.

    scRNAseq: интеграция и кластеризация мультидонорских и мультимодальных данных

    Встраивание UMAP в данные RNAseq и CITEseq выполнялось с использованием функций SCTransform и FindMultiModalNeighbors Seurat v4. Была проведена регрессия генов клеточного цикла (Seurat cc.genes ).Затем FindClusters использовался для генерации начальных кластеров с алгоритмом 3, разрешением кластера 1.3. В целях изучения исходных данных эта процедура встраивания и кластеризации UMAP выполнялась отдельно для активированных CD4, активированных CD8, всех CD4, всех CD8 и, наконец, всех клеток (последние генерировали встраивание, показанное на рисунке 5A).

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.