5 самых удивительных и страшных концептов LADA — Фан зона

• Фан зона
• Староход

Довольно сложно представить, что творится в головах у автодизайнеров, когда они работают над прототипами. Порой, в своих смелых творениях они заходят настолько далеко, что среднестатистическому человеку формы, представшие перед ним, непонятны и сложны. Впрочем, он просто не видел концепты LADA.

Да, как же хорошо, что не все концепт-кары доживают до серийного производства в том виде, в котором были показаны. Не смейтесь: у АВТОВАЗа прошлого тоже были дизайнеры. Они, как и другие, могли заглядывать в будущее. Но судя по концептуальным моделям, это будущее весьма, и весьма далекое. И, возможно, даже не автомобильной отрасли планеты Земля.

ИКСЫ ИЗ ПРОШЛОГО

Конечно, может быть из некоторых отечественных автофантазий вполне могло бы получиться что-нибудь толковое. Но только не из минивена ВАЗ Х! Каплевидный автомобиль был представлен в 1990 году. Однако его скругленные формы кузова, огромная площадь остекления, «монодворник» и фары головного света, расположенные аккурат под лобовым стеклом, смотрелись футуристично и, в тоже время, странно. Фишкой минивена был салон, который предлагал выдающиеся возможности трансформации.

Автомобиль был сделан в масштабе 1:4, но благодаря мастерству фотографа смотрелся, как настоящий. К моменту создания полноразмерной модели ВАЗ Х инженеры обещали поставить кондиционер и интуитивный круиз-контроль.

Впрочем, дальше пары нерабочих макетов «Икса» дело не дошло. А спустя 8 лет отечественный автогигант выпустил полноприводный минивен ВАЗ «Надежда», который выглядел более приземлено, а в его конструкции были использованы агрегаты от «Нивы». Правда, и он не оправдал надежд — было выпущено немногим больше 8 000 экземпляров, которые, впрочем, сочувственно можно встретить на улицах городов и сейчас.

ПРИВЕТ ИЗ СКАЗКИ

Девяностые года — в стране упадок и разгул бандитизма. «Криминал» раскатывает на Jeep Cherokee, Mitsubishi Pajero и ждет первый «Лупатый» Mercedes-Benz Е-класса. Между тем, АВТОВАЗ представляет концепт, построенный в 1992 году на базе малолитражки «ОКА», под названием «Гном».

ВАЗ 1151 «Гном» являясь ее укороченной версией, получил стеклопластиковый кузов и 650-кубовый бензиновый двигатель мощностью 30 л. с. Весил автомобиль действительно, как гном автомобильного мира — всего 490 кг. Стоит отметить, что автомобиль весьма приглянулся посетителям Московского автосалона 1992-го. Но завод нещадно грабили, и средств на выпуск модели попросту не нашлось.

ДВОЕ ИЗ ЛАРЦА

ВАЗ 1152 «Эльф» стал логичным продолжением концепции «Гнома». Автомобиль получил увеличенный дорожный просвет; из него выкинули второй ряд сидений, освободив больше места под багаж; установили дуги безопасности, на которые натягивался тент; и, как подобает пляжному кроссоверу, «Эльф» был лишен дверей. Ну прямо мини-Wrangler, не иначе!

Впрочем, самое интересное скрывалось под капотом «Эльфа» — это 34-сильный электромотор на 25 кВт. Электричество аккумулировали никель-кадмиевые батареи, общий вес которых достигал 315 кг. Максимальная скорость «Эльфа» составляла 90 км/ч. Но свои максимальные 110 километров пробега на одном заряде электрокар делал, двигаясь на скорости не более 40 км/ч. В послужном списке «Эльфа» — почетное 2-е место на ралли электромобилей в Монте-Карло. Но это его единственная самая большая заслуга. Впоследствии, «Эльф», как и «Гном» сгинул в небытие.

НАЗАД В БУДУЩЕЕ

LADA «Рапан» — прототип, представший перед общественностью в 1998 году на Парижском автосалоне. И это была поистине фантастическая концепция, чьи «фишки» и решения расхватали на «цитаты» сильные мира автомобилей. Скажем, дизайн «Рапана» до сих пор прослеживается в некоторых компактных концепт-карах Toyota, а руль со статичной ступицей и вовсе использовали в автомобилях Citroёn.

Двери «Рапана» открывались против хода автомобиля, а его передние кресла разворачивались на 360 градусов, облегчая пассажирам посадку. Так же интересным и широко обсуждаемым решением в автомобильной среде было интегрировать приборную панель в неподвижную ступицу рулевого колеса. При этом в ступице осталось место и для подушки безопасности. Круто, не так ли? А еще «Рапан» оснастили 34-сильным электромотором. На одной зарядке автомобиль мог проехать порядка 100 километров.

Разумеется, в серию столь необычный шоук-кар не пошел — «Рапан» был создан в единственном экземпляре.

СНЕСЛО ГОЛОВУ

LADA Roadster появился на свет в 2000 году, и был создан на базе LADA Kalina. Впрочем, от донора в отечественном родстере была только начинка.

Внешне Roadster выглядел весьма спортивно. А большей эффектности ему придавала складывающаяся в багажник крыша, которая ни сколько не уменьшала его объема. Передняя оптика концептуальной модели была заимствована у Volkswagen Golf, а безрамочные двери ей достались от Alfa Romeo GTV. А вот «десяточную» раму лобового стекла не спутать ни с чем. Впрочем, это все подробности о новинке тех годов. Характеристики двигателя озвучены не были, но известно, что работать он должен был в паре с секвентальной коробкой передач с последовательным переключением.

Кстати, именно этот конепт-кар АВТОВАЗа имел большие шансы выйти в серию, но, увы, не случилось.

37319

37319

ВАЗовский концепт, которым можно гордиться

Шокировав общественность в 1998 году концептом «Лада Рапан», АвтоВАЗ не стал останавливаться на достигнутом и пару лет спустя выдал следующий проект под загадочным названием «Лада Петер Турбо».

Евгений Яблоков

В отличие от «полноценного» предшественника «Лада Рапан», имевшего вполне осязаемый салон и электрическую «начинку», новоиспеченный «Лада Петер Турбо» был всего лишь макетом, по которой можно было судить о стилистических предпочтениях вазовских дизайнеров на рубеже третьего тысячелетия. Показанный публике на Московском международном автомобильном салоне 2000 года, макет большого футуристического седана «Лада Петер Турбо» даже не имел прозрачных окон. И тем не менее, он привлек колоссальное внимание посетителей.

Живая реакция отечественной публики стала дополнительным стимулом для организации международных смотрин «Лада Петер Турбо», которые состоялись во Франции. Причем, концепт, представленный на парижской выставке, был основательно доработан. У него появились прозрачные стекла, дополнительные элементы экстерьера и имитация салона, что позволило глубже раскрыть замысел создателей — творческого коллектива дизайнеров научно технического центра АвтоВАЗа под руководством С. Синельникова. Нельзя сказать, что привередливая европейская публика была шокирована «российским чудом» так же как наша, но определенный интерес «Лада Петер Турбо» у нее вызвал. Более того, на тольяттинский концепт обратили внимание западные автомобильные обозреватели и дизайнеры. Поговаривают, что сам маэстро Джуджаро удостоил данный экспонат некоторого повышенного внимания. И было за что. «Лада Петер Турбо», вслед за «Рапаном», смело крушил стереотипы аскетизма, свойственные российской автомобильной продукции того времени. Он наглядно и красноречиво демонстрировал всему миру, что и в России имеются стилисты, способные смотреть в будущее и видеть его.

Прежде всего «Лада Петер Турбо» восхищал своей передней частью. Казалось бы, простые решения — массивный с интегрированной радиаторной решеткой, узкие фары и габаритные огни, короткий скругленный капот — а какой элегантный ансамбль в результате.

Но особенно создатели концепта покорпели над поясной линией. Слабо выраженная в носовой части автомобиля, она бурно разрастается по бокам и достигает своего апогея на корме, где становится импровизированным спойлером. Ребро, визуально разделяющее кузов на две половины, верхнюю и нижнюю, было декорировано своеобразными элементами. Возле передних кузовных стоек находились зеркала заднего вида, корпуса которых фактически представляли собой часть дверной панели. Оригинальное ли это решение или радикальная переработка идеи, использованной на Opel Vectra второго поколения — в любом случае получилось весьма эффектно.

Еще одной «изюминкой» дизайна стал блок дверных ручек. Стильный элемент антуража недвусмысленно намекал, что передние двери у машины открываются как обычно, а задние — против хода. Кстати, двери у «Лада Петер Турбо» стали открывающимися лишь после очередных «постпарижских» доработок. Любопытна кинематика: за счет «хитрых» петель дверь не только поворачивается на определенный угол, она еще и сдвигается вперед. Совпадение или нет, но нечто подобное вскоре появилось на авангардном французском Renault Avantime.

Корма у «Лада Петер Турбо», сама по себе, как говорится, на любителя, но еще один элемент «ватерлинии», а именно широченный стоп-сигнал, встроенный в спойлер, существенно ее облагораживает. Воздуховод на передних дверях с украшением в виде продольных полосок поддерживает стиль, задаваемый радиаторной решеткой. Похоже, что решение навеяно сопоставимым элементом у знаменитой Ferrari Testarossa.

Еще одна интересная особенность «Лада Петер Турбо» — немного вогнутая крыша. Это не столько эстетический ход, сколько функциональное решение для улучшения обтекаемости. Расчетный коэффициент аэродинамического сопротивления составил 0,2, что является отменным показателем. У «Приоры», к примеру, он равен 0,32. К слову, аналогичным обратным прогибом крыши «щеголяет» суперкар Dodge Viper.

Двухцветный небесно-черный окрас концепта хорошо гармонировал с обтекаемым кузовом. Так же, неплохо дополняли футуристический облик пухлые и широкие колеса на изящных легкосплавных дисках. 

Проработка салона у «Лада Петер Турбо» была так себе, но для концепта это простительно. Тем более, что ход дизайнерской мысли ярко выражался ключевыми стилистическими ориентирами, такими как пять полноценных раздельных сидений, односпицевое рулевое колесо, изящная передняя панель в виде парящей чайки, огромная площадь остекления и так далее. О том, что находится под капотом перспективного седана оставалось только догадываться. Приставка «Турбо» в названии и сдвоенный выхлоп в задней части машины красноречиво говорили о том, что в качестве силового агрегата планируется использовать двигатель внутреннего сгорания.

Ну а странное имя концепта объясняется просто: «Лада Петер Турбо» создавался под впечатлением от романа В. Аксенова «Остров Крым», главный герой которого, аристократ и гонщик Лучников, «рассекает» на уникальном автомобиле «Питер-турбо». Это не седан, а «ярко-красный с торчащим хвостом спортивный зверь». Оригинальная идея «сквозит» в обоих транспортных средствах. Правда, одно из них «ожило» хотя бы на книжных страницах, а второе так и осталось макетом.

Хочу получать самые интересные статьи

Международный московский автосалон — 2012 / Цифровой автомобиль

⇡#Концепты

Весной текущего года АвтоВАЗ объявил об открытии собственной дизайн-студии в Москве. На тот момент уже было известно, что шеф-дизайнер автомобилей «Лада» Стив Маттин занимается созданием нового кроссовера. Также мы знали, что автомобиль появится на Международном московском автосалоне. Но кто же мог подумать, что он будет настолько красив!

Впервые можно откровенно жалеть, что этот автомобиль с символом ладьи на передней решетке на улицах страны все же не встретишь. Перед нами всего лишь концепт, но он стоит всех ранее созданных концептов «Лады». Шутка ли, когда-то Стив Маттин отвечал за облик важнейших моделей Mercedes-Benz и Volvo! Но выехать на былой славе дизайнеру не удастся. Перед профессионалом стояла очень сложная задача — создать новое направление в облике автомобилей «Лада». В долгих поисках вдохновения Стив решил поставить на «Ладах» крест. Необычная идея выгорела — «икс» морде концептуального кроссовера пришелся впору.

Красивый проект называется Lada XRAY. Как и дизайн, имя выбрал Маттин. «Икс» появился благодаря визуальному облику и предназначению автомобиля — с намеком на повышенную проходимость. Все вместе получается «x-ray» — рентгеновское излучение. Уже позже под удобное и запоминающееся название была подбита аббревиатура от recreation, activity и youth — «отдых, активность, юность».

Несмотря на очевидную отдаленность Lada XRAY от текущих дизайнерских решений продукции тольяттинского завода, Стив Маттин все же ассоциирует концептуальный кроссовер с прошлыми и текущими моделями. По его мнению, одной из характерных черт почти всех серийных моделей «Лада» является соседство передних фар непосредственно с черной передней решеткой. Между ними нет лишнего пространства и металлических кузовных панелей. От первых моделей ВАЗ Стив также позаимствовал обилие хромированных элементов.

Во внешности Lada XRAY можно обнаружить и следы Volvo. Чего хотя бы стоят забравшиеся на стойки крыши задние фонари! Про плагиат заикаться не стоит — концепт уникален на 100%. Еще больше скандинавского дизайна в салоне. Лаконичность форм будоражит воображение: а что если «Лада» действительно когда-нибудь станет такой? Пока можно лишь мечтать. Концепт показывает нам только примерное направление, в котором будет работать команда известного маэстро. Это даже не означает, что в обозримом будущем АвтоВАЗ планирует создать модель, сколько-нибудь напоминающую XRAY. Сам Стив Маттин уверен, что его проект с точностью рентгеновского луча обнажает происходящие внутри автозавода перемены.

Первые реальные плоды работы нового художника появятся в 2015 году. Тогда тольяттинцы обещают начать производство преемника «Приоры». Но сколько раз АвтоВАЗ не сдерживал свои слова? Через три года должен появиться и компактный кроссовер «Лада», созданный на единой с будущей «Приорой» платформе.

Если Вы заметили ошибку — выделите ее мышью и нажмите CTRL+ENTER.

★ Лада концепт цена | Информация

Пользователи также искали:

lada 4×4 vision характеристики, lada 4×4 vision, lada xcode, lada 2018, новая, lada granta, концепты, 4х4 vision, lada 4×4 vision цена, новая лада x6, концепты лада 2019, лада 4х4 vision цена, цены, концепт, лада, цена, концепта, цену, лада концепт, цене, лада концепт цена, лада цена, лады, концепт лады, цен, концептов, ладе, концепт лада, цена концепта, новые модели лада 2019,

Лада концепт-санкция.

Автоновости, новости, видео

Содержание статьи:

Фото

Лада концепт санкция. Рекомендации, авто новинки, видео

Видео

Похожие статьи

Лада концепт санкция. АвтоВАЗ показал шесть новых концепт-каров — ЯПлакалъ.  Lada C Concept [Ваз ЛАДА С Концепт ] обзор, характеристики. Редкие и уникальные авто России Данный концепт разработали в году и на Женевском автошоу. Итак, концепты: Lada Xray Sport Concept, Lada Vesta Sport Concept объясните, почему концепты Лады выглядят охуительно, но в серию идет что-то иное.

Lada C Concept [Ваз ЛАДА С Концепт ] обзор, характеристики. Редкие и уникальные авто России Данный концепт разработали в году и на Женевском автошоу. Итак, концепты: Lada Xray Sport Concept, Lada Vesta Sport Concept объясните, почему концепты Лады выглядят охуительно, но в серию идет что-то иное. Будущие возможные новинки российского автопрома: внедорожники, универсалы, седаны, спортивные автомобили под брендом LADA.

Самые интересные концепт-кары Лада. Кроссовер XCode и другие самые значимые концепции Автоваза. Крупнейший в России Отечественный автопроизводитель на автосалоне в Москве представил большое количество оригинальных концепт-каров, которые собрали рекордное количество отзывов и откликов на автошоу.  Концепт-кары линии Lada Cross Concept. Помимо кроссовера Lada XCode, в Москве были представлены концепт-кары серии Cross Concept.

Отличия от уже серийной Vesta — пластиковые накладки на колесных арках и по периметру, а также увеличенный клиренс. Также Автоваз заявил, что в этом году на рынке появится эксклюзивная версия Лады Веста, которая получит дорогую отделку салона: Правда, как и многие новинки, машина была представлена в качестве концепции. Что ждет китайскую компанию GAC на российском рынке А ниву надо просто доработать, дать ей новый движок, новый салон, безопасность улучшить.

АВТОВАЗ показал концепт внедорожника LADA 4х4 VISION.

Прообраз будущей Нивы?

Редкие и уникальные авто России Данный концепт разработали в году и на Женевском автошоу. Будущие возможные новинки российского автопрома: В салоне также есть отличия: Р едкий случай, когда название полностью оправдывает суть.

Как думаете если их введут что будет с акцими АвтоВАЗа? Но пока только с роботизированной коробкой передач. Я ничего не помню. Поиск изображения по сайту. Xray Cross — также пластиковые накладки, увеличенные колеса, сдвоенный патрубок выхлопной трубы.

Вторая линейка концепт-каров — Sport. В плане экстерьера, да и интерьера, она гораздо сильнее отличается от уже серийных Vesta и Xray, нежели линейка Cross. Автовазовские кроссовер и седан, выполненные в спортивной стилистике, получили полностью новые обвесы кузова. Особенно сильно это заметно на примере Vesta — седан стал агрессивным и дерзким, и даже получил две выхлопных трубы. Также красные вставки получили спортивные сиденья. Особая гордость спортивной линейки — черные кованые диски.

А качество сборки какое будет? Все равно не выйдет ни хуя. АвтоВАЗ издревле славился своими концепт-карами: А вот это вообще прекрасно: Технологический прорыв, чёрт возьми! Чубайс вон вам даже завод построил по производству литиевых аккумуляторов, причём завод этот уже обанкротиться успел, пока вы там тянете резинового кота за хвост в долгий ящик!

Что же в них концептуального? Просто добавят какой нибудь копеечной хуеты ,а цены поднимут в два раза. ЗЫ Вот уже шпалы полетели. Кому то не понравилось. Наверно выдал коммерческую тайну. По-моему не сильно удачно седан кросс. А каковы собсно существенные отличия эттх концептов от выпускаемой в данный момент продукции? X-ray cross это как? Частые вопросы и ответы. Как обойти запрет на ЯП. Все материалы добавляются пользователями. При копировании необходимо указывать ссылку на источник. АвтоВАЗ показал шесть новых концепт-каров.

Презентация прошла в рамках Московского международного автосалона, открывшегося сегодня. Так что в плане количества представленных моделей этот автосалон — рекордный для Lada. Заточенная на внедорожный облик линейка концептов Lada имеет слово Cross в названии.

Самый интересный концепт-кар из линейки Cross — это Vesta в кузове седан. Потому что примеров седанов повышенной проходимости мировой автопром знает не так много. Отличия от уже серийной Vesta — пластиковые накладки на колесных арках и по периметру, а также увеличенный клиренс.

Vesta Cross универсал наделена все теми же отличиями. Только зарегистрированные и авторизованные пользователи могут оставлять комментарии. Авторизуйтесь , пожалуйста, или зарегистрируйтесь , если не зарегистрированы. Россиянам разрешат производить электроэнергию на основе солнца и И снова о лунной афере! А что там, за смертью Пучков высказался про ублюдка. E-mail не будет опубликован обязательно. Подпишитесь на RSS или введите адрес электронной почты, чтобы получать рассылку новостей, статей и обновлений об автомобилях по почте.

Так же рекомендуем новинки авто , где собраны обзоры самых интересных моделей автомобилей.

Российский дизайнер показал концепт суперкара Lada Questa

Лада концепт. Советы, отзывы, фотографии

Содержание статьи:

Фото

Шокирующие концепты «АвтоВАЗа» — DRIVE2

Видео

Похожие статьи

Концепт-кары линии Lada Cross Concept. Помимо кроссовера Lada XCode, в Москве были представлены концепт-кары серии Cross Concept. Например, компания Автоваз представила в качестве исследования внедорожную версию концепта Лада Веста (в кузове седан).  Лада Веста в кузове универсал с внедорожным пакетом также выглядит вполне современно и определенно в ней что-то есть.

Lada 4×4, lada vision, авто, автоваз, автомобили, ваз, концепт, лада за от RedBull на ASTKRAS.RU  Концепт Lada 4×4 Vision получился довольно брутальным, но при этом внешний облик прототипа выполнен в новом фирменном марки. Прототип получил икс-фейс и икс-образные же выштамповки по бокам, как у Vesta и Xray. 0.

Классическая Нива, уже много лет скромно именуемая Ладой 4×4, до сих пор пользуется спросом. Но готовить ей что-то на замену нужно. Внедорожник нового поколения слишком далёк от премьеры, проект только развивается. Зато шеф-дизайнер компании Стив Маттин создал шоу-кар, предвещающий реинкарнацию легенды.

По мере того как прототип принимал законченные формы, а попутно приближалась дата открытия Московского автосалона, становилось ясно, что ВАЗ может блеснуть на нем еще одним концепт-каром. А как насчет спортивной модели Лада? Но и в заключение хотели бы сказать несколько слов о новом пикапе Автоваза, который создан на базе Нива 4х4. Это позволило бы легко и дешево изменять внешность автомобиля в соответствии с пожеланиями заказчика или проводя рестайлинг. Перед вами первый серийный пикап от Автоваза созданный на базе Нива 4х4.

Концепт Lada 4×4 Vision предсказал будущий внедорожник — ДРАЙВ

Читая много инфы про отечественный автопром, наткнулся на множество интересных задумок от ваз, разумеется большинство из которых так и остались на бумаге или в единичных экземплярах. Несколько лет тому назад АвтоВАЗ представил публике свои домыслы по поводу будущего отечественной автомобильной техники. Было представлено несколько машин, в том числе Lada C concept. Буква С означает одновременно 3 вещи: Честно говоря, дизайн у обеих машин просто поразил — наши до этого ничего подобного не делали!

Так же очень интересный вариант Lada Roadster Sbarro Работу, которая шла по методике маэстро Сбарро, возглавляли проектировщик Сергей Нужный и дизайнер Михаил Пономарев.

Надо сказать, что указанная методика исключает постройку макета. Объем носителя наращивается легко обрабатываемым материалом, образующим задуманные поверхности. Что-то, наоборот, подлежит устранению или же перемещению. По мере того как прототип принимал законченные формы, а попутно приближалась дата открытия Московского автосалона, становилось ясно, что ВАЗ может блеснуть на нем еще одним концепт-каром.

Незаинтересованность завода и отсутствие реальной поддержки не позволили довести до ума ходовую и поработать над интерьером. Однако родстер получился довольно легкий снаряженная масса кг. Его оснастили 2-литровым мотором ВАЗ в л. С другой стороны, из-за отсутствия необходимой оснастки червячную передачу, использованную в механизме подъема и опускания крыши, так и не смогли сделать с требуемыми допусками. Главное, было доказано, что можно создавать прототипы в рекордно короткие сроки без внушительных затрат.

После Московского автосалона, где АвтоВАЗ показал макет спортпрототипа для ралли-рейдов, завод официально объявил о программе подготовки к марафону Дакар. Автомобиль будет построен по всем законам раллийного жанра: Серийный мотор развивает л.

Коробка передач — известной в раллийных кругах французской фирмы Sadev. Силовой агрегат разместят спереди продольно, но в пределах колесной базы — чтобы улучшить развесовку по осям. Для унификации и простоты ремонта приводные валы, главные передачи, верхние и нижние рычаги подвесок будут одинаковыми спереди и сзади. Предполагалось участие осенью в Desert Challenge, а зимой — в Дакаре.

Так же мега проэкт — Lada Revolution. Автомобиль снабжен 2-литровым двигателем с максимальной мощностью л. В основе лежит стальная рама, основной материал кузова — пластик. Пока автомобиль находится в стадии концепт, но завод уже способен организовать мелкосерийное производство. Что касаемо независимых проэктов, это Marussia B2.

Это 3,6-литровый V6, который будет предлагаться в нескольких вариантах мощности — л. Так же был представлен концепт внедорожника Marussia F2.

По словам представителей Marussia, в данный момент ведутся переговоры с одной из японских компаний о поставках двигателей V6 объемом 3. По всей видимости, речь идет о двигателях Toyota Land Cruiser Prado. Подвеска русского внедорожника пружинная, дорожный просвет составляет мм. В заключении боевая версия Лады Гранты Спорт. В качестве силового агрегата на гоночной версии Лада Гранта выбран устанавливаемый на автомобилях LADA Priora клапанный двигатель объёмом 1,6 литра — это хорошо известный двигатель ВАЗ , форсированный, благодаря установке турбины, до мощности лошадиных сил.

Презентация Lada X-Ray Concept

Концепт высокого хэтчбека LADA XRAY. История создания » LADA Xray | Лада Х Рей

Первый концепт-кар под названием LADA XRAY, который обозначил новое «лицо» будущих моделей LADA, АВТОВАЗ показал в 2012 году на Московском автосалоне. Спустя два года на ММАС-2014 был представлен еще один концепт с таким же названием. Но теперь это был автомобиль, который максимально приближен к будущему серийному авто. То есть если первый концепт LADA XRAY демонстрировал будущее развитие стиля автомобилей LADA, то второй концепт-кар стал первым воплощением этого стиля на готовящемся к выпуску серийном авто.

По сути концепт LADA XRAY 2 – это проект BM-Hatch, а именно высокий переднеприводный хэтчбек, разрабатываемый АВТОВАЗом на основе автомобиля Renault Sandero, но с собственным дизайном.

Показанный на ММАС-2014 концепт LADA XRAY изготовили в Италии в городе Турин в студии Vercarmodel. Там же был изготовлен и первый концепт Лада Икс Рей. Но в этот раз АВТОВАЗ заказал итальянской студии изготовление не одного концепт-кара, а целых пяти. В частности было изготовлено по два концепт-кара LADA XRAY и LADA Vesta, а также концепт гоночного автомобиля LADA Vesta WTCC. В Москве было показано три концепт-кара. Как рассказал главный дизайнер АВТОВАЗа Стив Маттин, копии Весты и LADA XRAY также были отправлены в Тольятти, чтобы сотрудники АВТОВАЗа также смогли увидеть будущее компании.

Как и первый концепт, второй LADA XRAY является шоу-каром. Он построен построенные с помощью обходных, «выставочных» технологий. В автомобиле начинка максимально упрощена. Внешность же машины дизайнеры, наоборот, немного приукрасили. Стив Маттин отмечает: «Так могла бы выглядеть серийная топ-версия, будь у нас в бюджете чуть больше денег».

У концепта кроссовера LADA XRAY реальные габариты, практически серийные интерьеры, полноценные кресла, двери, багажники. Длина XRAY достигает 4,2 метров. Расстояние между осями – 2,6 метров. Вместе с тем в концепт-каре нет ни одной серийной детали: под внешними панелями стальной каркас, пенопласт и электромоторы.

Оригинальный дизайн XRAY разработал Евгений Ткачев. Он же два года назад работал и над концептуальной Ладой. Для финальной доводки дизайна LADA XRAY, чтобы вазовский дизайн «подружить» с жестким бюджетом французской платформы проект отдали более опытному специалисту – французу Жульену Друару, который ранее проработал 11 лет в парижском дизайн-центре Renault. В команде Маттина именно он отвечает за экстерьеры новинок.

Вазовцы, получив исходную платформу, пытались сделать LADA XRAY дешевле и лучше, чем Sandero. Французы этому сопротивлялись. Но в итоге в автомобиле распознать в Икс Рее французский Логан сложно. Панель пола, подвеска, моторный щит, посадка и задний диван в LADA XRAY почти без изменений французские. Вместе с тем у Икс Рея шире колея. Задняя стойка крыши у Sandero – глухая, а у а XRAY — с дополнительными окошками, двери в Сандеро заходят на крышу, а в Икс Рее – нет, оконные рамки у французской модели не зачерненные, а в LADA XRAY от этой идеи отказались, ради сохранения легкости силуэта. Оригинальными у LADA XRAY будут приборы, руль, передняя панель. С серию пойдет проект интерьера LADA XRAY, который готовил Николай Суслов. Он же является создателем интерьера концепт-кара XRAY образца 2012 года.

Под названием LADA XRAY на АВТОВАЗе планируют выпускать целое семейство автомобилей. «Просто» LADA XRAY – это переднеприводный хэтчбек, который в серию, как ожидается, пойдет в 2015 году. Следом за ним появится еще и XRAY Cross. Это будет полноприводный кроссовер на основе Дастера.

Предполагается, что серийный XRAY получит французские моторы и механическую коробку передач. Также известно, что дизайнеры и инженеры для работы над семейством XRAY летают в Бухарест, где располагается Dacia. Французская платформа по мнению разработчиков, открывает новые возможности на рынке, сулит экономию и синергию ресурсов.

Как и концепт LADA XRAY образца 2012 года, новый концепт создавался в ателье Vercarmodel по экспресс-технологии с использованием бутафорских кузовных элементов и деталей интерьера. На тележке с простым металлическим каркасом крепятся пенопластовые болванки. Затем на специальных станках от болванки отсекают все лишнее, ориентируясь на цифровую модель машины. Далее формируют внутреннюю полость автомобиля, куда в дальнейшем устанавливают сидения, приборную панель и прочие детали интерьера. В макет также устанавливают плексигласовые стекла, навешивают стеклопластиковые внешние панели.

Под капот концепта устанавливают электромотор и механическую коробку передач. Электродвигатель работает от обычных свинцово-кислотных аккумуляторов, расположенных в моторном отсеке и подполье багажника. Кресла изготавливаются на основе каркасов донорских сидений: их заново обклеивают поролоном и обтягивают кожей. Передняя панель создается из модельной пены, которую наносят на фанеру. Сверху панель покрывают кожей или имитирующей пластик пленкой. С помощью таких технологий создавался как первый, так и второй концепт LADA XRAY.

Введение в технологию флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и ее применение в биологических науках

Автор : Пол Хелд, доктор философии, отдел приложений, BioTek Instruments

Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) — физическое явление, впервые описанное более 50 лет назад, которое сегодня все чаще используется в биомедицинских исследованиях и открытии лекарств. FRET основан на зависящей от расстояния передаче энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Из-за своей чувствительности к расстоянию FRET использовался для исследования молекулярных взаимодействий. FRET — это безызлучательная передача энергии от молекулы-донора к молекуле-акцептору. Молекула-донор — это краситель или хромофор, который первоначально поглощает энергию, а акцептор — хромофор, которому впоследствии передается энергия. Это резонансное взаимодействие происходит на расстояниях, превышающих межатомные расстояния, без преобразования в тепловую энергию и без каких-либо столкновений молекул.Передача энергии приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции донора и времени жизни возбужденного состояния, а также к увеличению интенсивности излучения акцептора. Пару молекул, которые взаимодействуют таким образом, что возникает FRET, часто называют парой донор / акцептор.

Несмотря на то, что на FRET влияет множество факторов, основных условий, которые должны быть соблюдены для возникновения FRET, относительно немного. Молекулы донора и акцептора должны находиться в непосредственной близости друг от друга (обычно 10–100 Å).Спектр поглощения или возбуждения акцептора должен перекрывать спектр излучения флуоресценции донора (рис. 1). Степень их перекрытия называется спектральным интегралом перекрытия (J). Ориентации диполей донорного и акцепторного переходов должны быть примерно параллельны. Если предположить, что донорно-акцепторные пары совместимы, наиболее важным элементом, необходимым для возникновения FRET, является близость пар. Фёрстер продемонстрировал, что эффективность процесса (E) зависит от обратного шестого расстояния между донором и акцептором (см. Уравнение 1).[1]

Уравнение 1. E = Ro ⁶ / (Ro ⁶ + r ⁶ )

Где Ro — расстояние Ферстера, на котором передается половина энергии, а r — фактическое расстояние между донором и акцептором. Расстояние, на котором передача энергии эффективна на 50%, называется радиусом Ферстера (Ro). Величина Ro зависит от спектральных свойств донора и акцептора. Расстояние Ферстера от 20 до 90 Å наиболее полезно для изучения биологических макромолекул.Эти расстояния сопоставимы с диаметрами многих белков, толщиной биологических мембран и расстояниями между сайтами на мультисубъединичных белках. Любой процесс, который влияет на скорость передачи энергии, позволяет количественно оценить процесс. В результате FRET часто называют спектроскопической линейкой. Обратите внимание, что расстояние Ферстера (Ro) зависит от ряда факторов, включая квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора (fd), показатель преломления раствора (n), дипольную угловую ориентацию каждой молекулы. (k2) и спектральный интеграл перекрытия донора и акцептора (J).См. Уравнение 2.

Уравнение 2. Ro = 9,78 x 10 ³ (n ^-4 * fd * k ² * J) ^1/6 Å

Рис. 1. Схематическое изображение интеграла перекрытия спектров

В качестве примера влияния расстояния на эффективность передачи энергии можно использовать некоторые произвольные числа для расстояния Ферстера (Ro) и фактического расстояния (r). Если Ro произвольно установлен на 1 (Ro = 1), и расстояние между донором и акцептором также равно 1, тогда r = Ro, и уравнение для эффективности будет E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 1 ⁶ ), что равно 0.5 (т.е. 50%). Эта половина максимального значения и есть то, что определяется как расстояние Фёрстера. Если расстояние в 10 раз меньше (например, r = 0,1Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 0,1 ⁶ ) = 0,999999, что значительно эффективнее. Однако, если расстояние между донором и акцептором на 10 раз больше (т.е. r = 10Ro), то E = 1 ⁶ / (1 ⁶ + 10 ⁶ ) = 0,0000001. Эта чрезвычайная чувствительность к расстоянию — это то, что позволяет использовать FRET для экспериментов с приближением.

Обычно донорная и акцепторная части различаются, и в этом случае FRET можно обнаружить по появлению флуоресценции акцептора или по тушению донорной флуоресценции. Зонд-донор всегда представляет собой флуоресцентную молекулу. Обратите внимание, что люминесцентные молекулы ведут себя как флуоресцентные молекулы в отношении своего излучения. При соответствующем возбуждении его электроны перескакивают из основного состояния (So) на более высокий колебательный уровень. Очень быстро (в течение пикосекунд) эти электроны распадаются на самые низкие колебательные уровни (S1) и, в конечном итоге, распадаются (в течение наносекунд) обратно в состояние So, и излучается фотон света.Когда выполняются условия для возникновения FRET, затухание флуоресценции донора и передача энергии акцептору будут конкурировать за спад энергии возбуждения. При резонансной передаче энергии фотон НЕ излучается, а энергия передается молекуле-акцептору, электроны которой, в свою очередь, возбуждаются, как описано для молекулы-донора. При последующем возврате в основное состояние излучается фотон (рис. 2).

Рис. 2. Схематическое изображение состояний колебательной энергии электрона, возникающих во время FRET.

Измерение

Обнаружение и количественное определение FRET, безусловно, может быть выполнено различными способами. Поскольку FRET может приводить как к уменьшению флуоресценции молекулы донора, так и к увеличению флуоресценции акцептора, может быть выполнено определение метрики соотношения двух сигналов. Преимущество этого метода заключается в том, что измерение взаимодействия не зависит от абсолютной концентрации датчика.Поскольку не все акцепторные части являются флуоресцентными, их можно использовать в качестве средств для гашения флуоресценции. В этих случаях те взаимодействия, которые приводят к тому, что флуоресцентная донорная молекула приближается к такой молекуле, могут привести к потере сигнала. И наоборот, реакции, которые устраняют близость флуоресцентного донора и тушителя, могут привести к увеличению флуоресценции. Одним из таких примеров могут быть анализы протеазы. Эти анализы обычно включают флуоресцентный фрагмент на одном конце и гасящую молекулу на другом конце, разделенные пептидом, содержащим последовательность расщепления протеазой.

Некоторые примеры

Генетически кодируемые флуоресцентные красители, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и родственные молекулы синего, голубого, желтого и красного цветов, обеспечивают способность выполнять FRET in vitro, особенно в живых клетках [2]. Эти белки образуют пары FRET друг с другом, а также с обычными красителями. Они могут быть связаны с другими белками генетически или ковалентно, но при этом сохранять свою флуоресцентную способность. Эти красители могут быть генетическими элементами, которые могут быть связаны с другими генами с образованием химерных белков.Эти химерные белки содержат GFP (или связанный с ним флуоресцентный белковый элемент) и предполагаемый связывающий домен. С различными химерными белками (один донор и один акцептор) можно исследовать белок-белковые взаимодействия. Только когда пары донор / акцептор взаимодействуют посредством белок-белковых взаимодействий, результатом будет FRET. (Рисунок 3)

Рис. 3. Схематическое изображение взаимодействия двух различных флуоресцентных белковых химер. Белок-белковые взаимодействия между белками, помеченными A и B, приводят к тому, что синий флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок находятся на достаточно близком расстоянии, чтобы обеспечить возможность возникновения FRET.В этом примере возбуждение синего флуоресцентного белка приводит к испусканию флуоресценции зеленым флуоресцентным белком.

Органические цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, которые излучают в красном диапазоне (> 550 нм), обладают рядом преимуществ. Их диапазон излучения таков, что часто снижается фоновая флуоресценция. Кроме того, большие расстояния (> 100 Å) могут быть измерены в результате высоких коэффициентов экстинкции и хороших квантовых выходов. Даже донорно-акцепторные пары с разделенными спектрами излучения (т.е. низкий интеграл перекрытия) приводят к приемлемым расстояниям Фёрстера. Например, Cy3, который излучает максимум на 570 нм, и Cy5, который излучает на 670 нм, имеют расстояние Ферстера> 50 Å. Большое расстояние между парами позволяет измерять излучение акцептора в результате FRET без помех от излучения донора. Кроме того, эти молекулы могут быть напрямую связаны с определенными участками в синтетически полученных нуклеиновых кислотах, что позволяет использовать FRET для оценки отжига нуклеиновых кислот.

Рисунок 4.Схематическое изображение FRET, возникающего между флуоресцентными фрагментами Cy3 и Cy5 при отжиге меченых олигонуклеотидов.

В примере, изображенном на фиг. 4, два комплементарных олигонуклеотида РНК помечены Cy3 и Cy5 соответственно. Когда эти меченые молекулы не отожжены (рис. 4A), возбуждение РНК-олигонуклеотида, меченного Cy3, светом с длиной волны 540 нм приводит только к испусканию света Cy3 с длиной волны 590 нм, в то время как комплементарный олигонуклеотид РНК, меченный Cy5, не излучает любой свет с длиной волны 590 нм или его истинная длина волны излучения 680 нм.Однако, когда двум олигонуклеотидам позволяют отжигаться, непосредственная близость молекул позволяет происходить переносу FRET. Это приводит к испусканию света с длиной волны 680 нм, когда отожженная молекула возбуждается светом с длиной волны 540 нм. Обратите внимание, что не все излучение Cy3 на длине волны 590 нм теряется, но значительная его часть теряется.

Рисунок 5. Схематическая диаграмма активности FRET, используемой ВСП

Зонды датчика напряжения

(VSP) — это технология анализа на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), используемая для обнаружения лекарств с высокопроизводительным ионным каналом. Донор FRET представляет собой связанный с мембраной кумарин-фосфолипид (CC2-DMPE), который связывается только с внешней стороной клеточной мембраны. Акцептор FRET представляет собой мобильный отрицательно заряженный гидрофобный оксонол [либо DiSBAC ₂ (3), либо DiSBAC ₄ (3)], который будет связываться с любой стороной плазматической мембраны в ответ на изменения мембранного потенциала (рис. 5). В ВСП используется зависимость от расстояния. FRET может иметь место только тогда, когда акцептор DISBAC ₂ (3) расположен на внешней стороне клеточной мембраны.Покоящиеся клетки обладают относительно отрицательным потенциалом, поэтому два зонда связываются с внешней стороной клеточной мембраны, что приводит к эффективному FRET. Возбуждение донорного зонда CC2-DMPE (при ~ 400 нм) генерирует сильный красный сигнал флуоресценции (при ~ 590 нм) от зонда-акцептора оксонола. Когда мембранный потенциал становится более положительным, как это происходит при деполяризации клеток, оксонольный зонд быстро перемещается (в субсекундном временном масштабе) на другую сторону мембраны (рис. 5). Таким образом, каждый оксонольный зонд «чувствует» и реагирует на изменения напряжения в ячейке.Эта транслокация разделяет пару FRET, поэтому возбуждение донорного зонда CC2-DMPE теперь генерирует сильный синий сигнал флуоресценции (при ~ 460 нм) от зонда CC2-DMPE. Ожидается, что деполяризация клетки, которая заставляет DISBAC ₂ (3) перемещаться на внутреннюю сторону мембраны, приведет к снижению активности FRET.

Соединения лантанидов, такие как европий и тербий, эффективно используются в качестве доноров в реакциях FRET. Эти соединения обеспечивают очень хорошее соотношение сигнал / шум в результате их длительного периода полураспада флуоресценции и спектральных характеристик.Эмиссия этих соединений имеет резко пиковый профиль с большим стоксовским сдвигом от возбуждения. Кроме того, длительный период полураспада флуоресценции позволяет начать измерение после прекращения возбуждающего света. Задержка между возбуждением и измерением (диапазон мсек) позволяет рассеяться фоновой флуоресценции от молекулы органического акцептора с периодом полураспада в наносекундном диапазоне. Таким образом, при соответствующей задержке измеряется только донорно-акцепторная эмиссия.

Донорная молекула не всегда должна включать флуоресцентное соединение.Люминесцентные молекулы излучают фотоны очень похоже на флуоресценцию. Основное различие состоит в том, что электронное возбуждение не является результатом поглощения фотона, а, скорее, высвобождением химической энергии, содержащейся в молекуле. Когда возбужденные электроны возвращаются к своему основному состоянию, энергия может быть высвобождена в виде фотона света или передана через RET молекуле-акцептору, если условия верны. Хотя количество молекул, которые можно использовать, более ограничено, эта технология имеет то преимущество, что отсутствует внешнее возбуждение молекулы акцептора.

Проблемы

При разработке экспериментов FRET необходимо учитывать ряд вопросов. Самая очевидная проблема — это близость. В зависимости от схемы анализа, непосредственная близость будет либо установлена, либо устранена во время анализа, что приведет к изменению сигнала, который можно измерить. Необходимо выбрать подходящие пары донор / акцептор. Пары должны иметь достаточное спектральное перекрытие для эффективной передачи энергии, но при этом иметь достаточную разницу в спектрах, чтобы их можно было отличить друг от друга.Выбор фильтров для выбора длины волны флуоресценции также имеет решающее значение для успеха или неудачи экспериментального обнаружения FRET. Фильтр возбуждения для донора должен иметь возможность избирательно возбуждать молекулу донора, сводя к минимуму прямое возбуждение молекулы акцептора. Загрязняющее прямое возбуждение акцепторной молекулы может быть учтено с помощью соответствующих контролей, но большие количества затрудняют интерпретацию данных. Как показано на рисунке 1, фильтры, используемые для возбуждения Cy3, минимизировали возбуждение Cy5, обеспечивая при этом достаточный сигнал возбуждения для Cy3.

Еще одна важная проблема, связанная с обнаружением FRET, связана с концентрацией аналита. Только те молекулы, которые взаимодействуют друг с другом, приведут к FRET. Если присутствуют большие количества донорных и акцепторных молекул, но они не взаимодействуют, количество происходящего FRET будет довольно низким. В этом примере, хотя донорные и акцепторные молекулы могут быть очень легко обнаружены по отдельности, фактического количества активности FRET может быть недостаточно для обнаружения. Что касается FRET, фактически измеряемым «аналитом» являются пары донор / акцептор, а не отдельные компоненты.Кроме того, как донорные, так и акцепторные молекулы должны быть в достаточной концентрации для того, чтобы иметь место FRET. Большинство связывающих событий — это динамический процесс, который достигает устойчивого состояния. Если одного из компонентов реакции не хватает, то общее связанное количество будет естественно низким. Например, временные трансфекции с двумя разными генетическими элементами, которые приводят к тому, что один из элементов не эффективно транслируется в белок, приведут к низким уровням FRET. Клеточная локализация также может иметь значение.Если одна молекула находится в цитоплазме, а другая — в ядре, взаимодействия друг с другом не будет, несмотря на достаточное количество каждой из них.

Приложения FRET

• Структура и конформация белков [3]
• Пространственное распределение и сборка белков [4]
• Взаимодействия рецептор / лиганд [5]
• Иммуноанализ [6]
• Структура и конформация нуклеиновых кислот [7]
• ПЦР в реальном времени и обнаружение SNP [8,9]
• Гибридизация нуклеиновых кислот [10]
• Распределение и транспорт липидов [11]
• Анализы слияния мембран [12]
• Определение потенциала мембраны [13, 14]
• Анализ флуорогенных протеаз [15]
• Индикаторы циклического AMP [16]

Узнать больше о Synergy HTX
Многорежимный считыватель

Ссылки

1. Förster, T.(1948) Межмолекулярная миграция энергии и флуоресценция Ann. Phys 2: 55-75.
2. Tsien, R. (1998) Ann. Обзор Biochem, 67: 509-544
3. Jonsson T, Waldburger CD, Sauer RT, (1996) Нелинейные отношения свободной энергии в разворачивании репрессора Arc подразумевают существование нестабильных, нативных промежуточных продуктов сворачивания. «. Biochemistry 35: 4795-4802.
4. Watson BS, Hazlett TL, Eccleston JF, Davis C, Jameson DM, Johnson AE. (1995) Расположение макромолекул в аминоацил-тРНК.фактор элонгации Tu.GTP тройной комплекс. Исследование передачи энергии флуоресценции. Биохимия 34: 7904-7912
5. Berger W, Prinz H, Striessnig J, Kang HC, Haugland R, Glossmann H. (1994) Сложный молекулярный механизм связывания дигидропиридина с Ca (2 +) — каналами L-типа, выявленный с помощью резонансной передачи энергии флуоресценции. Биохимия 33: 1875-11883.
6. Ханна П.Л., Ульман Э.Ф. (1980) 4 ‘, 5’-Диметокси-6-карбоксифлуоресцеин: новый диполь-дипольный акцептор переноса энергии флуоресценции, пригодный для флуоресцентных иммуноанализов.Анальная биохимия 108: 156-161.
7. Клегг Р.М., Мурчи А.И., Лилли Д.М. (1994) Структура раствора четырехстороннего соединения ДНК в условиях с низким содержанием соли: анализ флуоресцентного резонансного переноса энергии. Biophys J 66: 99-109.
8. Ли Л.Г., Ливак К.Дж., Мулла Б., Грэм Р.Дж., Винаяк Р.С., Вуденберг TM. (1999) Семицветное, однородное обнаружение шести продуктов ПЦР. «Biotechniques 27: 342-349.
»
9. Мякишев М.В., Хрипин Ю., Ху С., Хамер Д.Х. 2001) Высокопроизводительное генотипирование SNP с помощью аллель-специфической ПЦР с универсальными праймерами, меченными переносом энергии.Genome Res 11: 163-169.
10. Parkhurst KM, Parkhurst LJ. (1995) Кинетические исследования резонансного переноса энергии флуоресценции с использованием олигонуклеотида с двойной меткой: гибридизация с олигонуклеотидным комплементом и одноцепочечной ДНК. Биохимия 34: 285-292.
11. Николс JW, Пагано RE. (1983) Анализ резонансной передачи энергии белково-опосредованного переноса липидов между везикулами. J Biol Chem 258: 5368-5371.
12. Uster PS (1993) Микроскопия резонансного переноса энергии in situ: мониторинг слияния мембран в живых клетках.Методы Энзимол. 221: 239-246.
13. Hoffman, R. и Held, P. Примечание по применению BioTek.
14. Gonzalez JE, Tsien RY. (1995) Измерение напряжения путем резонансного переноса энергии флуоресценции в отдельных клетках. Biophys J 69: 1272-1280.
15. Matayoshi ED, Wang GT, Krafft GA, Erickson J. (1990) Новые флуорогенные субстраты для анализа ретровирусных протеаз с помощью резонансной передачи энергии «Science 247, 954-958.
16. . Адамс С.Р. и др. (1993) Оптические зонды для циклического AMP, флуоресцентные и люминесцентные зонды для определения биологической активности, Mason W.T., Ed.С. 133-149.

КОНЦЕПЦИЯ ЧЕТЫРЕ ЛИЦА — Электронная книга / PDF — Независимые

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ:
Это электронная книга, а не физический продукт. Для электронной книги действуют следующие условия стоимости / оплаты:
1.	При покупке этого предмета плата за доставку не взимается. Доступ к продукту будет доступен для загрузки сразу после выполнения вашего заказа.Выберите любой способ доставки при заказе (это обязательная функция), но учтите, что стоимость доставки не будет применяться к стоимости вашего заказа.
2.	При покупке этого товара налог с продаж не взимается.
3.	Это название имеет право на участие в нашей программе оптовых скидок. Если этот товар приобретается вместе с другими названиями, программа скидок будет автоматически применяться ко всем товарам в вашем заказе.
4.	Этот заголовок имеет формат Adobe Acrobat и требует, чтобы на вашем компьютере была установлена ​​более новая версия Adobe Acrobat Reader. Если вам нужно скачать копию (это бесплатно), щелкните изображение справа.
ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ ЗАГРУЗКА БОЛЬШОЙ ZIP-ФАЙЛ. ZIP-ФАЙЛ ПРИМЕРНО 55 МБ И ЛУЧШЕ ЗАГРУЗИТЬ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОСКОРОСТНОГО ИНТЕРНЕТ-СОЕДИНЕНИЯ. ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ ЗАКАЗА ВАМ ПРЕДОСТАВЛЯЕТСЯ ССЫЛКА ДЛЯ ЗАГРУЗКИ ФАЙЛА.ЕСЛИ У ВАС ВОЗНИКНУТ ЛЮБЫЕ ПРОБЛЕМЫ С ЗАГРУЗКОЙ И / ИЛИ ДОСТУПОМ К НАЗВАНИЮ ПОСЛЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ЗАКАЗА, ПОЖАЛУЙСТА, ОБРАТИТЕСЬ К НАМ ДЛЯ ПОМОЩИ.

ОБРАЗЦЫ ИЗ ЭТОГО НАЗВАНИЯ
Примеры представлены в формате pdf и требуют установки Adobe Acrobat Reader.

The Four-Fret Concept — уникальное название, написанное Робертом Риглером. Он содержит 99 примеров импровизации на основе фундаментальной джазовой прогрессии 2-5-1.Вначале структура каждого исследования хорошо объясняется, затем каждый пример разбирается, анализируется и подробно объясняется. Примеры представлены в стандартных обозначениях, TAB, а также включены в файлы MP3, сопровождающие заголовок. 72 страницы и 17 файлов MP3.

ПРЕДИСЛОВИЕ К НАЗВАНИЮ
Научиться играть соло и импровизировать настолько легко и без головной боли, насколько это возможно — основная идея этой басовой книги. Он предназначен для того, чтобы дать начинающим и продвинутым электробасистам доступ к джазовой импровизации наиболее плавным способом.

Предполагаются определенные предварительные навыки:
В основном, эта книга адресована электрическим басистам, которые могут аккомпанировать странному стандарту (и, таким образом, знакомы с джазовой идиомой, по крайней мере, смутно), но съеживаются от перспективы соло (не для того, чтобы играть соло). упомяните такие симптомы, как сердечная аритмия, недостаточность кровообращения и обильное потоотделение).

Базовая гармоническая структура данных упражнений обеспечивается повсеместной прогрессией II-V-I, паттерном, который можно найти во многих джазовых стандартах, который, следовательно, будет лежать в основе нашего импровизационного внимания.Техника аппликатуры системы четырех ладов, сила которой заключается в визуальном распознавании ее паттернов, объясняется и демонстрируется в 99 моих любимых фразах (или «линиях»). Курт Эрлмозер анализирует структурный уровень импровизаций и, таким образом, дает глубокое понимание процесса.

Очевидно, что упражнения предназначены для удовлетворения теоретических и технических навыков учащегося. Однако фактическая цель должна заключаться в усвоении информации и создании собственных линий.

Как и вся теория (в музыке), цель должна заключаться в том, чтобы окончательно проглотить это, а затем забыть об этом и перейти к тому волшебному месту, к которому стремится каждый музыкант: к следующему такту! Просто шучу.

Развлекайтесь и избавьтесь от головной боли.

Лобзики Knew Concepts | ТОЧНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ

Лобзики

Knew Concepts производятся в США компанией Knew Concepts в соответствии с высочайшими стандартами. Их подход к дизайну заключается в том, что все улучшения «обратно совместимы» со старым продуктом.Таким образом, вы, заказчик, всегда получаете поддержку на протяжении всего жизненного цикла всего, что создано Knew Concepts. Эти инструменты предназначены для тех, кто стремится более эффективно и с пользой использовать свое время и навыки. Дополнительная информация

Пильные рамы Knew Concepts поставляются только с одним полотном! Полотна, которые вы найдете здесь:
Лобзик Blitz, Tornado и Finis
Лобзик Pegas

Почему пильные рамы иногда слегка изгибаются?

Небольшие изгибы пильных рам являются обычным явлением из-за тепла лазера при их резке.Незначительные изгибы, подобные изображенным на картинке, не влияют на производительность или точность пилы.

Лобзик 3 дюйма с натяжением винтов
сделано Knew Concepts
Пила для натяжения шнеков была источником линейки лобзиков Knew Concepts. Это экономическая модель. Он обеспечивает чрезвычайно точное натяжение полотна простым поворотом натяжной гайки с накаткой в ​​верхней части рамы.
Инструкция по установке пилы для натяжения шурупов (PDF 2,5 МБ)
Высота лука (глубина реза) 3 дюйма (75 мм)
для лезвия длиной 130 мм
Изображение слева 3-дюймовая пила

Код 322501

Цена ^∗ 69 €.00
Лобзик 5 дюймов с натяжением винта
То же, что и выше, но глубина пропила 5 дюймов (125 мм)
Изображение

Код 322511

Цена ^∗ 79,00 € Лобзик 3 дюйма с натяжением рычага
сделано Knew Concepts
Предназначен для быстрой и повторяющейся замены лезвия (например, при прокалывании). При переналадке полотна натяжение не меняется. Просто переверните рычаг вперед, чтобы ослабить натяжение, переместите и зажмите лезвие, затем переведите рычаг назад, и вы начнете пиление.
Инструкции рычаг натяжной пилы (PDF 2,5 МБ)
Высота лука (глубина реза) 3 дюйма (75 мм)
для лезвия длиной 130 мм
Изображение слева 3-дюймовая пила

Код 322502

Цена ^∗ 89,00 €
Лобзик 5 дюймов с натяжным рычагом
То же, что и выше, но глубина пропила 5 дюймов (125 мм)
Изображение

Код 322512

Цена ^∗ 95,00 €
Лобзик 3 дюйма с натяжным рычагом и зажимами для поворотного полотна
сделано Knew Concepts
Предназначен для отклонения задней части рамы в сторону.Возможность установить раму в «нейтральный угол» позволяет распиливать участки, которые раньше были невозможны. Он поворачивается на 45 ° вправо или влево и имеет фиксатор в положении «прямо вперед». Поистине лучшие пилы.
Когда вы собираетесь работать с мелкими деталями, такими как инкрустация или маркетри, и используете Optivisor для просмотра линии, повернув рамку в фиксированное положение под углом 45 градусов (правый или левый), рамка не упрется в ваш головной убор. Рисунок: работа с optiviser
Инструкция по работе с рычагом натяжной пилы (PDF 2.5 МБ)
Высота лука (глубина реза) 3 дюйма (75 мм)
для лезвия длиной 130 мм
Изображение слева 3-дюймовая пила

Код 322503

Цена ^∗ 119,00 €
Лобзик 5 дюймов с натяжным рычагом и поворотными зажимами для полотна
То же, что и выше, но глубина пропила 5 дюймов (125 мм)
Изображение

Код 322513

Цена ^∗ 132,00 €
3-дюймовая титановая лобзик с натяжным рычагом и поворотными зажимами
сделано Knew Concepts
Самая прочная и жесткая лобзиковая пила, доступная сегодня на рынке! Его позвоночник представляет собой сварную титановую балку, лезвие натягивается с помощью рычага, который может натягивать лезвия так сильно, что они «звенят» нотами, которых никогда раньше не слышали, делает повороты сильнее, чем когда-либо прежде, а зажимы лезвия фиксируются под углом 45 ° влево, 0 °, 45 ° вправо.Весит всего 6,0 унций (170 г).
Когда вы собираетесь работать с мелкими деталями, такими как инкрустация или маркетри, и используете Optivisor для просмотра линии, повернув рамку в фиксированное положение под углом 45 градусов (правый или левый), рамка не упрется в ваш головной убор.
Инструкции рычаг натяжной пилы (PDF 2,5 МБ)
Высота лука (глубина реза) 3 дюйма (75 мм)
для лезвия длиной 130 мм
Изображение слева 3-дюймовая пила

Код 322505

Цена ^∗ 249 €.00

Лобзиковые пилы для тяжелых условий эксплуатации Mk IV

Чем больше натяжение полотна на лобзике, тем точнее вы сможете резать им. Knew Concepts всегда славились сверхлегкими лобзиками, которые можно натянуть прилично, несмотря на их небольшой вес. Чем больше изгиб пилы, тем труднее добиться большего натяжения полотна. Вот почему полотна существующих лобзиков от Knew Concepts могут быть натянуты до величины, зависящей от размера лука пилы.Лезвия традиционных пил с 3-дюймовым дугом можно натянуть до прибл. 12 кг, на 5-дюймовом луке до 8 кг и на 8-дюймовом луке до 4 кг.

Напротив, пильные полотна новой линии MK IV могут иметь более чем вдвое большее натяжение, чем полотна традиционных пил, а именно. 25 кг для лука 8 дюймов и выше для двух меньших луков. Точные значения являются чисто теоретическими, потому что сила растяжения, превышающая 25 кг, может привести к поломке лезвия. Все это достигается за счет более толстой рамы, увеличенной длины и большего веса.Толщина новой рамы составляет 4,8 мм, ранее — 3,2 мм. Новая 3-дюймовая пила весит 195 г, ранее 130 г (5-дюймовая новая 240 г, ранее 145 г; 8-дюймовая новая 300 г, ранее 175 г). Новая общая длина для всех размеров составляет 37 см, ранее — 34 см. Как правило, новые пилы прочнее и менее подвержены вибрации.

Еще одним преимуществом новой линейки Mk IV является то, что теперь лезвия можно поворачивать на 360 ° с фиксирующими положениями каждые 45 °. Дополнительная длина является функцией полностью вращающихся зажимов лезвия.В раме должно быть дополнительное пространство, чтобы ручки могли вращаться в раме.

Эти данные не относятся к пилам с титановой дугой, допускающим натяжение полотна более 35 кг. Пилы для титана исключительно легкие, но неудивительно, что их цена намного выше, чем у стандартных пил.

Мы продолжим поставлять старые пилы: они действительно легкие и, благодаря их короткому формату, очень просты в обращении.

Лобзик для тяжелых условий эксплуатации MK IV Глубина пропила 75 мм
С натяжением кулачкового рычага
Зажимы для лезвий с поворотом на 360 °

Код 322551

Цена ^∗ 139 €.00 Лобзик для тяжелых условий эксплуатации MK IV Глубина пропила 125 мм
С натяжением кулачкового рычага
Зажимы для лезвий с поворотом на 360 °

Код 322552

Цена ^∗ 149,00 € Лобзик для тяжелых условий эксплуатации MK IV Глубина пропила 200 мм
С натяжением кулачкового рычага
Зажимы для лезвий с поворотом на 360 °

Код 322553

Цена ^∗ 169,00 €

Дополнительная информация

Для регулировки винтовых зажимов полотна или для перевода пилы в режим работы левой рукой вам понадобится обычный шестигранный ключ на 2 мм.Вот видео, как отрегулировать или повторно отрегулировать зажимы винта лезвия. В этом видео показано, как правильно установить и натянуть полотно. В этом видео показано, как преобразовать пилу с правосторонней работы в левостороннюю.

Почему бы также не взглянуть на бортовую пилу Knew Concepts!

Праймер для микроскопии молекулярных выражений

: специализированные методы микроскопии — FRET

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET)

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением.Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны.Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах. Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани.С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами. Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости.Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает донорный флуорофор в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения ближайшему акцепторному хромофору без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния.Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту. В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта.В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая обнаруживается с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора.Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредуется испусканием фотонов, и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным.Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение переноса энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и сокращении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора. Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансного переноса энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофора разделены расстоянием примерно 12 нанометров, слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами. Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET.На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка. Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белков соответствующими флуорофоры. Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в широком спектре типов клеток стали критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках.Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET. Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков.Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, оптики микроскопов и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках.В дополнение к исследованию взаимодействий белков-партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения ближайшему хромофору, акцептору.В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора, и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь. Теория, предложенная Теодором Ферстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Ферстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансная передача энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается усиленное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3). Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора.Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора в резонансном переносе энергии флуоресценции. Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками.Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3). Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Для того, чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть выполнены несколько критериев.В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения молекул донора и акцептора, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Ферстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между молекулами донора и акцептора уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их. Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор, составляющим приблизительно 10 нанометров.На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий. В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти.Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора. Согласно теории Ферстера, подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

K _T = (1 / t _D ) [R ₀ / r] ⁶

, где R (0) — критическое расстояние по Ферстеру, , t (D), — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры.Критическое расстояние Ферстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора. Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору посредством резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается посредством комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Ферстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии. Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц.Значение R (0) (в нанометрах) может быть вычислено из следующего выражения:

R ₀ = 2,11 x 10 ^-2 [k ² Дж (л) ч ^-4 Q _D ] ^1/6

, в котором k-квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (l) — интеграл перекрытия в области спектров излучения донора и поглощения акцептора (с длина волны, выраженная в нанометрах), h представляет собой показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , посредством уравнение:

r = R ₀ [(1 / E _T ) — 1] ^1/6

и E (T) оценивается как:

E _T = 1 — (t _DA / t _D )

, где t (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а t (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих широко применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами испускания донора и спектром поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов переходов донора и акцептора и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость резонансной передачи энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве энергии резонанса флуоресценции. передаточная пара. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в поворот зависит от k -квадрат, J (l) , h и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Ферстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает в себя выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от изменений в J (l) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Ферстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор Приемник Frster Distance (нанометры) Триптофан Дансил 2.1 IAEDANS (1) ДДПМ (2) 2,5 — 2,9 BFP DSRFP 3,1 — 3,3 Дансил FITC 3,3 — 4,1 Дансил Октадецилродамин 4.3 CFP GFP 4,7 — 4,9 CF (3) Техас красный 5,1 Флуоресцеин Тетраметилродамин 4,9 — 5,5 Cy3 Cy5 > 5.0 GFP YFP 5,5 — 5,7 КУЗОВ FL (4) КУЗОВ FL (4) 5,7 Родамин 6G Малахитовый зеленый 6,1 FITC Тиосемикарбазид эозина 6.1 — 6,4 B-фикоэритрин Cy5 7,2 Cy5 Cy5.5 > 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота (2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид (3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина) 4 (4 , 4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенности в оценке коэффициента ориентации ( к -squared) широко обсуждались в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства, что теория Frster является действительной, и применимо к измерению расстояния, этот переменный продолжают быть несколько спорными.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно даются для предполагаемого значения к в квадрате, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора за счет вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за отношения корня шестой степени к расстоянию Ферстера изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит к изменению рассчитанного расстояния только на 26 процентов, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимается значение 0,67. применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате k становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для отклонения в квадрате k . Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений k -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния, возможно, до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием резонансной спектроскопии переноса энергии и рентгеновской дифракции в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Ферстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит.С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для k -квадрат требуют полной флуоресцентной поляризации донора и акцептора, что маловероятно. Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( k -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

k ² = (cos q _T — 3cos q _D cos q _A ) ² = (sin q _D sin q _A cos f — 2cos q _D cos q _A ) ²

, где q (T) — угол между диполем эмиссионного перехода донора и диполем абсорбционного перехода акцептора, q (D) и q (A) — углы между этими диполями и вектором соединяющий донор и акцептор, а f — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (в шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донора и акцептора надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены с помощью FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, вычисленные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии по механизму Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результирующему эффекту.Расстояния Ферстера точно предсказываются по спектральным свойствам донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекул донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований к флуорофорам, образцу и режиму (режимам) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модифицировать для микроскопии FRET (см. Рисунок 7).Как правило, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что приводит к получению изображений со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способного наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культивирования тканей оснащен стандартной вольфрамово-галогенной лампой на столбе для исследования и записи ячейки, использующие стандартное светлое поле, фазовый контраст или дифференциальный интерференционный контраст ( DIC ) освещения.Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста могут использоваться в сочетании с флуоресценцией для выявления пространственного расположения флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с помощью мультиспектрального микроскопа, показанного на рисунке 7, с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых CCD-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы, и передаются в буфер на главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах явления, следует учитывать ряд важных практических моментов, когда измерения флуоресцентного резонансного переноса энергии проводятся с помощью оптического микроскопа:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.

• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.

• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.

• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным.Распространенным источником ошибок в измерениях методом FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.

• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.

• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.

• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.

• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации ( k -квадрат). Этому требованию удовлетворяют доноры, излучение которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.

• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.

• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы. Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что донорные и акцепторные молекулы расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.

• Живые клетки, меченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Чтобы феномен флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставил значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации.Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов. Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам.Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается сопутствующим уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора можно считать показателем резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET.Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора. Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванной тушением из-за передачи энергии.Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется установившимся режимом флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Соответствующие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения. Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия излучения между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит излучение акцептора.На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям. Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров.Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены путем слияния с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рисунок 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансной передачи энергии между двумя белками

.

Среди факторов, которые могут потенциально повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны для оптического микроскопа.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные данные, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии.Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и поэтому наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой. В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение тушения излучения донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, донор и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектрального просвечивания) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по резонансному переносу энергии флуоресценции. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением , которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся состоянии, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( t ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) определяется уравнением:

I (t) = I ₀ эксп (-t / t)

, где I (0) — это начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — это интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( t ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит потому, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. резонансной передачей энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (b) )) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной областей для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( f ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( t (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( t ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями резонансного переноса энергии флуоресценции являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование in vivo взаимодействия между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, и расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами можно определить по эффективности передачи энергии посредством измерений в установившемся режиме, как обсуждалось выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Несмотря на то, что для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в отношении методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают улучшить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Научный центр здравоохранения Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Мэрилендский университет и Институт биотехнологии Мэрилендского университета (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Томас Дж. Феллерс и Майкл У.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 г. Ист. Пол Дирак, доктор философии, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

---

НАЗАД К ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вопросы или комментарии? Отправить нам письмо.

© 1998-2019, автор — Майкл В. Дэвидсон и Государственный университет Флориды. Все права защищены. Никакие изображения, графика, сценарии или апплеты не могут быть воспроизведены или использованы каким-либо образом без разрешения правообладателей.Использование этого веб-сайта означает, что вы соглашаетесь со всеми юридическими положениями и условиями, изложенными владельцами.

Этот веб-сайт поддерживается нашей командой

по графике и веб-программированию
в сотрудничестве с оптической микроскопией в Национальной лаборатории сильного магнитного поля
.

Последнее изменение: пятница, 13 ноября 2015 г., 14:19

Счетчик доступа с 26 ноября 2004 г .: 82229

Для получения дополнительной информации о производителях микроскопов,

используйте кнопки ниже для перехода на их веб-сайты:

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Техника ладонной руки: Rhythm Concept 5 — Крис Буоно — Урок игры на гитаре

`, созданный(){ если это.$ root.member.meta && (this. $ root.member.meta.rhythmjamboree2020 && (this. $ root.member.meta.rhythmjamboree2020.rewards && (this. $ root.member.meta.rhythmjamboree2020.rewards.length)) )) this.currentBeans = this. $ root.member.meta.rhythmjamboree2020.rewards } }) новый Vue ({ el: ‘#countdownBarTemplate’, данные () { возвращаться { данные: tf.marketingData.countdown, titleStyle: ложь, subTitleStyle: ложь, timeLeft: ложь, timerCtaStyle: ложь, timerTimeStyle: ложь, refreshAlert: ложь, noAlert: ложь, член: ложь, buttonStyle: ложь, видимый: правда, исключить: [‘смотреть’, ‘в’, ‘ч’, ‘л’, ‘ритм-джамбори’], excludeAlert: [‘v’, ‘watch’, ‘h’, ‘l’, ‘dashboard’, ‘order’, ‘cart’, ‘order-complete’] } }, созданный(){ если (tf.член){ this.member = tf.member if (tf.member.private_deals && (tf.member.private_deals [0] && (tf.member.private_deals [0] .expires))) this.visible = false } this.titleStyle = ‘font-family:’ + this.data.titleFont + ‘! important; color: #’ + this.data.titleColor + ‘! important; font-size:’ + this.data.titleFontSize + ‘px !важный;’ this.subTitleStyle = ‘цвет: #’ + this.data.color + ‘! important’ this.timerCtaStyle = ‘цвет: #’ + this.data.timerCtaColor + ‘! important’ это.timerTimeStyle = ‘цвет: #’ + this.data.timerTimeColor + ‘! important’ this.buttonStyle = { backgroundColor: ‘#’ + this.data.buttonBackgroundColor, borderColor: ‘прозрачный’, цвет: ‘#’ + this.data.buttonTextColor } this.timer () пусть inExclude = false this.exclude.forEach (excludeView => {if (document.location.href.indexOf (‘/’ + excludeView)> -1) inExclude = true}) если (! inExclude) this.visible = true if (tf.member) { если (tf.member.private_deals && (tf.member.private_deals [0] && (tf.member.private_deals [0] .expires))) this.visible = false } }, методы: { timer () { if (typeof phpajax! = «undefined» && (phpajax.global.countdown)) { const currentTime = phpajax.global.server_time пусть timeLeft = phpajax.global.countdown.endtime — currentTime let secondsLeft = Math.floor (timeLeft / 1000% 60), minutesLeft = Math.floor (timeLeft / 1000/60% 60), hoursLeft = Math.floor (timeLeft / (1000 * 60 * 60)% 24), daysLeft = Математика.этаж (timeLeft / (1000 * 60 * 60 * 24)) if (secondsLeft {if (document.location.href.indexOf (‘/’ + excludeView)> -1) inExclude = true}) если (! inExclude) this.refreshAlert = true } phpajax.global.countdown.endtime + = 3600 * 1000 this.timer () } еще { tf.countdownTimeLeft = this.timeLeft // если (tf.countdownTimeLeft.indexOf (’00: 00 ‘)> -1) tf.countdownTimeLeft = tf.countdownTimeLeft.replace (’00: 00′, ’00’) phpajax.global.server_time + = 1000 setTimeout (это.таймер, 1000) } } }, перезагрузить страницу(){ location.reload () }, gtmClick () { const buttonUrl = this.data.buttonUrl, spaceStr = »; if (dataLayer) { dataLayer.push ({ событие: ‘promotionClick’, электронная торговля: { PromoClick: { Акции: [ { имя: this.data.title.indexOf (spaceStr)> -1? this.data.title.substring (this.data.title.indexOf (spaceStr) + spaceStr.length): this.data.title, creative: ‘countdownBarButton’, позиция: 1 } ] } }, eventCallback () { документ.location = buttonUrl } }) } else document.location = buttonUrl } }, смотреть: { noAlert () { if (this.noAlert) $ .cookie (‘no_countdown_alert’, 1, {путь: ‘/’, истекает: 21}) } } })

1. Дом
2. Курсы
3. {{course.title}}
4. {{lesson.title}}

Вид по умолчанию

Вкладка SyncClassic

Прогресс курса

Показать всеСкрыть завершенныеТолько незавершенныеТолько в процессеТолько завершенныеТолько избранные

Вернуться к {{конечно.title}}

Успеваемость по курсу

{{courseProgress}}%

{{courseProgress}}% Загрузить сейчас

Получите частный урок

Получите индивидуальные инструкции и индивидуальную оценку от {{course.educator}}

Узнать больше

Инди-курсы

Indie Courses — это видеокурсы, загруженные независимо от TrueFire.Эти продукты, которые часто записываются в домашних студиях преподавателей, представляют свежие образовательные концепции и эффективные методики обучения. Инди Курсы доступны исключительно для покупки в магазине каналов преподавателя и могут быть загружены через приложения TrueFire для Windows, Mac, iOS или Android. Инди-курсы НЕ включены в план стриминга с полным доступом, так как они созданы самостоятельно вне студий TrueFire.

{{конечно.педагог}}

Узнать больше Добавлено в избранное Добавить в избранное {{udText}} {{udText}} Добавить

Добавить в мои плейлисты

{{плейлист.title}}

---

Создать новый список воспроизведения Создать новый

Добавить Любимый! Избранное Прогресс

Отметить как

Марк Прогресс Вид

Классический вид

Вкладка Sync View

Успеваемость по курсу

{{courseProgress}}%

{{courseProgress}}%

---

Диаграмма

Сообщить об ошибке вкладки или другой проблеме Сообщить об ошибке вкладки или другой проблеме

Эта диаграмма слишком велика для просмотра в браузере.Нажмите кнопку Download Chart (PDF) выше, чтобы загрузить диаграмму.

Посмотрите онлайн-урок игры на гитаре по технике ладовой руки Криса Буоно из книги Focus On: Funk Guitar

. Как только медиатор начинает контролировать призрачные удары и царапает, самое время переключить внимание на ладовую руку для некоторых техник приглушения и длительности нот, которые работают с как одиночная нота, так и игра аккордов. Эти подходы помогут вашим ритмам звучать чисто и плотно, делая их еще более фанковыми! Что касается подхода с одной нотой, мы сделаем его очень простым в Ex.1 и сыграйте только одну ноту — пятый лад C на третьей струне, как мы это делали в Rhythm Concept 3. Для аккордов мы будем играть изменения между минорным и доминантным голосом в Exs. 2 и 3 сосредоточены на напуганной гемиоле, а также на общей вариации. Обязательно обратите внимание на недавно вставленные скользящие аккорды в каждом из вторых тактов. К тому времени, когда вы сможете приступить к выполнению этих трех упражнений, ваши ритмические навыки будут готовы к джемам в Разделе 4!

---

Распродажа! Сэкономьте {{course.Promo.Discount}}% с кодом «{{course.promo.Code}}» — Торопитесь, срок действия истекает через 11 дней, {{PromoTime}}

Скачать этот курс

Пожизненный доступ (диск + загрузка + потоковая передача) Пожизненный доступ (загрузка + потоковая передача)

Цена

Ваша цена ({{item.Discount_percentage}}% Скидка)

Получите частный урок

Получите индивидуальные инструкции и индивидуальную оценку от {{course.educator}}

Узнать больше

{{course.educator}}

Узнать больше Добавлено в избранное Добавить в избранное

Обсуждения ({{урок.comments.length}})

Используйте форму ниже, чтобы сообщить о проблеме, которую вы могли обнаружить с нашими вкладками, диаграммами или другим контентом. Спасибо!

ОтменитьОтправить отчет

Распродажа! Сэкономьте {{course.promo.Discount}}% с кодом «{{course.promo.Code}}» — Торопитесь, срок действия истекает через 11 дней, {{promoTime}}

Мы обновили и объединили настройки веб-плеера, чтобы упростить вам индивидуальную настройку.Нажмите значок шестеренки настроек вверху списка видеоуроков, чтобы открыть вверх на панели управления, где вы можете включить или выключить автовоспроизведение, выбрать качество видео, установить вид по умолчанию и выбрать, какие уроки отображать (бесплатные, в процессе, завершенные и т. д.). Если у вас есть Если у вас возникнут вопросы, свяжитесь с нашей службой поддержки по адресу [email protected]. Тренируйтесь с умом, играйте усердно!

известных концепций | Брайан Мик | Лобзик | Копировальная пила | Титан

Если вы пробовали резьбу, ручную резку «ласточкин хвост» или накладки на молдинги, вы столкнулись с решением купить лобзик или копировальную пилу где-то по пути.И если эти действия произошли в течение последнего десятилетия или около того, вы, вероятно, подумывали о покупке одного из стандартных инструментов с металлической рамой — ну, вы знаете, тех копировальных пил, которые можно недорого найти почти в любом хозяйственном магазине, — или алюминиевого лада с красной рамкой и копировальные пилы производства Knew Concepts. У них отличительная рама в виде фермы, которая больше похожа на мост, чем на балку, что делает пилы легче и намного прочнее, чем другие недорогие варианты.

Эти «красные» пилы были разработаны Ли Маршаллом, который всю жизнь работал машинистом и мастером-мастером, но изначально они не предназначались для деревообработки.Вместо этого они были компонентом прецизионной штамповочной пилы Маршалла, которую он поставлял ювелирам для выполнения контролируемых вертикальных пропилов металла. Это был побочный бизнес, которым Маршалл возился при создании небольших гидравлических прессов — в том числе и для ювелиров.

«Так я впервые познакомился с Ли», — говорит Брайан Мик, владеющий Knew Concepts с июля прошлого года. «Компания (Маршалла) до Knew Concepts — Bonny Doon Engineering — производила эти гидравлические прессы для рынка мелкосерийного производства ювелирных изделий.Они были абсолютно незаменимы при производстве ювелирных изделий ».

Мик, имеющий ученые степени в области ювелирного дела и обработки металлов, хотел стать профессором искусств в колледже. Чтобы помочь оплачивать счета в поисках работы учителя, он делал ювелирные украшения и помогал другим ювелирам делать их.

«Так же, как« серьезный »мир деревообработки довольно мал, и большинство людей знают друг друга,« серьезный »ювелирный мир еще меньше … было неизбежно, что (Ли и я) в конечном итоге узнают друг друга», — говорит Мик говорит.«Я знал, что Ли продал Бонни Дуна и возился с этими пилами, которые он придумал, поэтому я предложил помочь ему с механической обработкой на пару недель, пока я искал работу. Восемь лет спустя я все еще здесь ».

Когда они начали работать вместе, Маршалл делал свою первую пилу Mk.1 полностью вручную на ручном редукторе. Мик поделился своим опытом работы со станками с ЧПУ, графикой, производственным дизайном и фотографией, чтобы подкрепить усилия Маршалла. Сочетание навыков помогло бизнесу быстро расти.

«Мы заполнили пустые места друг друга, — вспоминает Мик, — и до того, как кто-либо из нас узнал об этом, прошло несколько лет, и я проектировал большую часть нашей производственной линии».

Изначально целью Маршалла при создании Mk.I было обслуживание производителей ювелирных изделий. Но переход от производства высокоточной пилы для резки металла к пиле, идеально подходящей для обработки дерева, не потребовал от Knew Concepts дополнительных усилий.

«Лобзики и ювелирные пилы — это абсолютно один и тот же кусок металла; это просто зависит от грубости лезвия, которым вы их заряжаете, и от того, что вы режете », — говорит Мик.

Затем последовала лобзиковая пила Mk.II, и это была первая модель с ферменной рамой, изготовленной на станке с ЧПУ, а не вручную. Mk.III последовал примерно в 2010 году в трех типоразмерах. Что сделало эту версию большим шагом вперед, так это то, что Маршалл и Мик придумали способ добавить быстросъемный рычаг натяжения для замены оригинального винтового натяжителя. Эта пила потребовала изменения конструкции рамы, чтобы приспособить ее к рычагам. Компания по-прежнему предлагает пилы Mk.III сегодня как «легкую» линейку с небольшими доработками.

«Нынешние пилы Mk.III на самом деле относятся к Mk.IIIk, если это хоть как-то указывает на количество незначительных исправлений, через которые они прошли», — говорит Мик.

Примерно в 2012 году Knew Concepts добавила в свой ассортимент свою первую копировальную пилу, когда компания инвестировала в токарный станок с ЧПУ, который был способен изготавливать когти для удерживания лезвий штифтового типа. «Как только мы начали делать (лобзики) и обнаружили, что плотники действительно испытывают потребность в приличных пилах, следующим очевидным шагом было создание копировальной пилы, которая действительно работала», — вспоминает Мик.

Примерно в то же время Маршалл и Мик «возились» с конструкциями для маркетри пилы с гораздо большей рамой. Эта пила не достигла стадии производства, но усилия по ее разработке привели к конструкции зажимов для лезвий, которые будут вращаться на 360 градусов. Эта особенность, а также модифицированная и более прочная конструкция алюминиевой рамы привели к появлению пил Mk.IV примерно четыре года спустя.

«Мы наняли инженера-строителя для проведения компьютерного анализа наших конструкций рамы, чтобы помочь нам разобраться в самой прочной и легкой конструкции рамы, которую мы могли… всех трех размеров (нового сверхмощного Mk.IV) испытывают примерно такое же усилие на своих лезвиях: 60 фунтов, более или менее », — говорит Мик. «Таким образом, у вас нет проблемы с тем, что традиционные пилы делают наши рамы более свободными и гибкими с увеличением глубины. 8-дюйм. Рама Mk.IV тянет так же сильно, как и 3-дюймовая. Рамка.»

Еще одно событие произошло в 2012 году: Knew Concepts начала производить титановые лобзики с ферменной рамой. Компания использовала излишки листового материала, которые были отклонены ВВС США из-за плохой термической обработки.Мик говорит, что металл не соответствовал требованиям для истребителя F-22, но был достаточно прочным для рамы ручной пилы. Однако, когда у компании закончились поставки недорогого листового титана, потребительский спрос на легкий и сверхпрочный металл упал. Вдобавок ко всему сопоставимый титан был в четыре раза дороже, чем металлолом, который Knew Concepts использовала ранее, а «плоские» стропильные рамы было трудно эффективно размещать, не тратя лишнего материала.

Решение проблемы пришло случайно и в припадке разочарования примерно через шесть месяцев проб и ошибок.Сложить пазл из плоского титанового каркаса фермы, чтобы сэкономить на материале, просто не получилось. «Некоторые (рамы) были прочными, но совсем не имели прочности на скручивание (скручивание)», — вспоминает Мик. Прорыв произошел, когда он согнул позвоночник в форме буквы «V» и приварил поперечины к долине зигзагообразно.

«Бинго! Эта ферма вообще не гнулась, и именно отсюда появились наши титановые лобзики Birdcage », — говорит Мик. Теперь компания продает их в трех типоразмерах, вместе с Mk.III и Mk. IV алюминиевые пилы.

В июне прошлого года, после непродолжительной борьбы с раком, Ли Маршалл скончался. Вскоре после этого Мик купил бизнес. Он говорит, что его планы на будущее — продолжить производство всей линейки пил Knew Concepts. Он также надеется в какой-то момент запустить маркетри, выпущенный ранее этим летом.

«Это последнее, над чем мы работали вместе с Ли», — говорит Мик. «Сейчас мы режем для него детали; просто нужно потратить машинное время на изготовление всех деталей.Он будет доступен в трех вариантах длины — 12, 18 и 24 дюйма — и все три размера могут выдерживать не менее 60 фунтов натяжения ».

Отвечая на вопрос о самой популярной деревообрабатывающей пиле компании, Мик поясняет, что ни лобзик, ни копировальная пила не справятся со всеми задачами с одинаковой точностью — лобзики лучше всего подходят для сложной работы и выполнения крутых поворотов, в то время как копировальные пилы справляются с грубой работой и прямыми пропилами. лучше. При этом он предлагает следующее предложение.

«Если у вас может быть только один, возьмите лобзик: он может упасть в вертикальное положение ласточкина хвоста, повернуться на 90 градусов внизу и масштабировать прямо через отходы.Копирующие пилы должны проходить с обеих сторон и при этом оставлять эту вершину посередине, чтобы справиться с ней ».

Какая модель самая популярная, спросите вы? Мик говорит, что это Mk. III или Mk. IV 5-дюйм. Лад с вертлюжками. «С большой долей вероятности», — добавляет он.

«5-дюйм. размер не намного тяжелее, чем 3 дюйма. модель, и это дает большую гибкость с точки зрения выполняемой работы. Если вы знаете, что будете убирать только отходы типа «ласточкин хвост», возьмите 3 дюйма. Если вы не знаете, что собираетесь делать, возьмите 5-дюймовые.”

Помимо предстоящей маркетри пилы, Мик сообщает, что в разработке находятся и другие новые продукты, а также расширения и усовершенствования существующих продуктов. Но теперь, когда Маршалл ушел, Мик проводит больше времени в офисе и упускает возможность выбраться на гастроли и посетить больше концертов.

No related posts.