LADA XRAY Cross (ЛАДА ИКС РЕЙ кросс) , цена от 703710 руб.

LADA XRAY Cross – современный и надежный кроссовер нового поколения с отличными техническими характеристиками, повышенной проходимостью и превосходной управляемостью.  Презентация новой модели состоялась на Московском автосалоне в августе 2018 года.
 
Главные особенности обновленной модели — увеличенный дорожный просвет (со 195 мм до 215 мм), модернизированный мощный подрамник и энергоемкое шасси.

Габаритные размеры автомобиля составляют:

• В длину – 4171 мм;
• В ширину – 1810 мм;
• В высоту – 1645.

Внедорожник Х-Рей оснащается расширенным комплексом инновационных систем активной и пассивной безопасности: двумя фронтальными AirBag, системами ABS, EBD, BAS, ESC, TCS, HSA, экстренным оповещением ЭРА-ГЛОНАСС, камерой заднего вида, дневными ходовыми LED-огнями, парковочным радаром и прочим.
 
Автомобиль демонстрирует отличную динамику благодаря 1,8-литровому бензиновому мотору с 16 клапанами мощностью 122 л.с., который работает в паре с 5-диапазонной механической коробкой передач. Двигатель соответствует нормам ЕВРО-5.

	1.8 л 16-кл. (122 л.с.), 5МТ
КУЗОВ
Длина / ширина / высота по антенне, мм	4171 / 1810 / 1645
Дорожный просвет, мм	215
ДВИГАТЕЛЬ
Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.	90 (122) / 6050
Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.	170 / 3700
Рекомендуемое топливо	бензин 92, 95
ДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Максимальная скорость, км/ч	180
Время разгона 0-100 км/ч, с	10,9
РАСХОД ТОПЛИВА
Смешанный цикл, л/100 км	7,5
ТРАНСМИССИЯ
Тип трансмиссии	5МТ
ШИНЫ
Размерность	215/50 R17 (91, H)

Технические характеристики автомобиля LADA XRAY Cross (Лада Х рей Кросс) указаны по данным производителя: мощность, размеры кузова и шин, тип трансмиссии и тормозов, вес (масса), клиренс, расход топлива на 100 км.

Заполнены не все обязательные поля

Спасибо. Сообщение отправлено.

Вам нужно пройти ReCaptcha

Нужно дать согласие на обработку персональных данных

LADA XRAY Cross — Технические характеристики

Кузов

Колесная формула / ведущие колеса

Расположение двигателя

Тип кузова / количество дверей

Количество мест

Длина / ширина (по зеркалам) / высота по антенне, мм

База, мм

Колея передних / задних колес, мм

Дорожный просвет, мм

Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом вариантах, л

Двигатель

Код двигателя

Тип двигателя

Система питания

Количество, расположение цилиндров

Рабочий объем, куб. см

Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.

Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.

Топливо

Динамические характеристики

Максимальная скорость, км/ч

Время разгона 0-100 км/ч, с

Расход топлива

Городской цикл, л/100 км

Загородный цикл, л/100 км

Смешанный цикл, л/100 км

Масса

Снаряженная масса, кг

Технически допустимая максимальная масса, кг

Максимальная масса прицепа без тормозной системы, кг

Максимальная масса прицепа с тормозной системой, кг

Объем топливного бака, л

Трансмиссия

Тип трансмиссии

Передаточное число главной передачи

Подвеска

Передняя

Задняя

Рулевое управление

Рулевой механизм

Шины

Размерность

Технические характеристики Лада Икс Рей Кросс (ВАЗ (Lada) XRay Cross) 2019 годов выпуска

Отзывы о ВАЗ (Lada) XRay Cross

ВАЗ (Lada) XRay Cross 2019

9.7 (9.7/10)

Жемчужина отечественного автопрома. Практически везде проходит. Движок не подводит. Дизайн крутой и современный, собрана на совесть. Как семейное авто идеальна!

22 сентября 2020 г.

ВАЗ (Lada) XRay Cross хэтчбек 2019 Luxe 1.8 MT

7.7 (7.7/10)

На редкость качественная (для Лады) машина, которая к тому же хорошо выглядит. Купил год назад, до сих пор не разочаровался.

4 марта 2020 г.

ВАЗ (Lada) XRay Cross хэтчбек 2019 Luxe Prestige 1.8 MT

9.6 (9.6/10)

Держал иномарки и не жалею что купил Х-рея Кросс. Новая она есть новая,все проблемы сразу отпадают. Клиренс самый веский аргумент и Красавец в моём понимании.

28 ноября 2019 г.

Will xray с полным приводом. Авто лада рентген с полным приводом. Новый Lada X-ray cross стал просторнее старого X-ray

.

В последнее время АвтоВАЗ вкладывает немало усилий в разработку современных автомобилей, которые составят конкуренцию зарубежным аналогам. Настоящей гордостью отечественного автопрома является Lada X Ray Cross 2018. Автомобиль имеет современный экстерьер и хорошее оснащение, он должен конкурировать с предложениями азиатского автопрома. Стоимость базового оборудования 594 000 руб.Давайте рассмотрим, в чем особенности нового поколения.

Отечественная модель

Технические характеристики

Технические характеристики Lada X Ray Cross 2018 тщательно скрываются от мировой общественности. Известна следующая информация:

• Автомобиль лучше подготовлен к тяжелым условиям эксплуатации за счет увеличения дорожного просвета.
• Установлены другие колеса по сравнению с предшественником.
• Использовали защитный пластиковый обвес и новую систему полного привода.
• Установлены моторы от АвтоВАЗа, у самого мощного 123 л.с. Кроме того, у Renault будет позаимствован двигатель мощностью 114 л.с.

Большинство улучшений касалось установки новых систем, отвечающих за безопасность движения.

	1,6 л (106 л.с.)	1,6 л (110 л.с.)	1,8 л (123 л.с.)
Кузов	хэтчбек	хэтчбек	хэтчбек
Кол-во дверей	5	5	5
Привод	передний	передний	передний
Зазор	195	195	195
Длина	4164	4164	4164
Ширина	1764	1764	1764
Высота	1570	1570	1570
Колесная база	2592	2592	2592
Объем багажника	376/1382 л	376/1382 л	376/1382 л
Масса	1200 кг	1190 кг	1250 кг
Количество цилиндров	R4	R4	R4
Объем двигателя	1.6 л	1,6 л	1,8 л
Мощность	106 л.с.	110 л.с.	122 л.с.
Обороты	5800	5500	6000
Крутящий момент	148 нм	150 Нм	173 Нм
Обороты	4200	4000	3500
Коробка	механика	механика	робот
Кол-во передач	5	5	5
Скорость	170 км / ч	171 км / ч	183 км / ч
0-100 км / ч	11.9 секунд	10,3 секунды	10,9 секунды
Расход на 100 км	9,9 / 6,1 / 7,5	9,4 / 5,6 / 6,9	9,3 / 5,8 / 7,1

Экстерьер

Новая версия автомобиля стала еще привлекательнее. Дизайнеры немного изменили внешний вид, сделав его более современным:

• Для передней части использованы массивные хромированные панели.
• Установлена ​​современная головная оптика.
• Сделали передние воздухозаборники более массивными, установили небольшие противотуманные фары.

Передняя часть автомобиля стала более массивной и привлекательной внешне. Отдельно отметим современную юбку, которая выполнена в довольно привлекательном стиле.

Экстерьер Lada X Rey Cross 2018

Небольшие изменения коснулись и интерьера рассматриваемого автомобиля … В дорогой комплектации использованы материалы отделки более высокого качества. Однако многого от бюджетной машины не жди:

Несмотря на то, что отечественный производитель постарался сделать новую машину более интересной и привлекательной в салоне, она уступает многим своим конкурентам в бюджетном классе.

Комплектация и цены Lada X Ray cross 2018 в новом кузове

Lada X Ray Cross 2018 в новом кузове (дата выпуска и другая информация уже известна) будут доступны в 6 комплектациях, цена которых варьируется в достаточно широкий ассортимент. Как правило, наибольшее внимание уделяется базовому оснащению, поскольку автомобили отечественного производства в большинстве случаев приобретаются в связи с их высокой доступностью.

Рассматривая новый вездеход для городских дорог, отметим следующие варианты оснащения и их особенности:

1.Оптима

Поставляется по цене 594000 руб. При этом следует учитывать, что в базовую комплектацию входит только все необходимое: подушки безопасности и стандартное крепление для детских кресел. Инженеры предусмотрели возможность блокировки дверей от случайного открытия детьми. Также центральный замок автоматически блокирует все двери при движении. В момент резкого торможения автомобиль автоматически включает сигнализацию, при столкновении открывается центральный замок в автоматическом режиме.

В базе уже установлена ​​хорошая сигнализация, а также дневные ходовые огни с диодными источниками света. Больше всего при оснащении базовой версии уделялось безопасности движения. Это проявляется установкой довольно большого количества различных систем: ESC, ABS, BAS, TCS. По словам автопроизводителя, они также значительно повысили степень защиты моторного отсека и двигателя. Для контроля работы установленной электроники в автомобиле был установлен бортовой компьютер, есть розетка на 12 В.

Рулевое колесо многофункциональное, для передачи мощности на колеса установлена ​​гидросистема … В рулевой колонке есть система регулировки высоты вылета, проведена светлая тонировка задних стекол, установлен салонный фильтр .. Блоком управления стеклопакетом оснащены только передние двери, дверной замок интегрирован в единую систему и управляется ключом. Аудиосистема позволяет подключать внешние устройства по беспроводной сети или через USB.

2.Optima Air Condition

Специальная версия машины, которая отличается двумя дополнительными опциями: кондиционером и перчаточным ящиком с функцией охлаждения. За счет двух вариантов стоимость предложения увеличилась до 619 000 рублей. Отметим, что для управления климатом в салоне был установлен небольшой блок управления, представленный двумя круглыми ручками и несколькими клавишами быстрого доступа к различным функциям. Нашли место для розетки.

3. Комфорт

Уже поставлен по цене 655000 руб.За относительно небольшую доплату производится установка стеклоподъемника задних дверей, а также многодиапазонного обогрева передних сидений. Многофункциональное рулевое колесо сделали более приятным в использовании, установили привод зеркал заднего вида. Кроме того, на седан повышенной проходимости установлены современные легкосплавные диски R15.

4. Люкс

Презентабельное предложение по цене 705 000 руб. Эта версия с доплатой 50 000 рублей имеет множество дополнительных различных систем, большая часть которых связана с повышением комфорта в салоне и повышением безопасности движения.Примером может служить установка противотуманных фар, благодаря которым значительно повышается безопасность движения в условиях плохой видимости. Многие системы не требуют настройки, так как могут работать в автономном режиме от встроенных датчиков света и дождя.

Современным дополнением стала установка подсветки порога передних дверей. За счет установки климат-контроля значительно повышается комфорт в салоне, так как система способна контролировать заданные параметры в автоматическом режиме.Вместо штатной аудиосистемы мы установили мультимедийный комплекс с 7-дюймовым цветным дисплеем, а также богатый набор способов подключения внешних устройств. Размер колес был увеличен до R16, за счет чего автомобиль выглядел более агрессивно и спортивно.

5. Люкс Престиж

Обойдется в 734 000 рублей. Изменения по сравнению с предыдущим предложением незначительны: устанавливают мультимедийную систему с навигацией, а также проводят усиленную тонировку задних окон.

6. Эксклюзив

Отличается применением в отделке материалов более высокого качества. Примером может служить комбинация синтетической кожи и алькантары, используемой для обивки. Обшивка руля и селектора передач показана натуральной кожей, на педали применены стальные накладки. Интерьер стал еще привлекательнее за счет использования светодиодной подсветки.

Lada X Ray Cross 2018 в новом кузове (комплектации и цены, фото) поставляется в очень привлекательной комплектации, но дорогая модификация обходится стоимостью иномарки.Поэтому при выборе бюджетника больше внимания уделяется основным конкурентам этого автомобиля, которые выпускаются зарубежными производителями.

Основные конкуренты

У рассматриваемой модели довольно много конкурентов, большинство из которых являются представителями азиатского автопрома. Представители бюджетного сегмента:

1. Great Wall Hover.

Некоторые из перечисленных выше автомобилей дешевле, другие намного дороже.За доплату всего в несколько десятков тысяч к стоимости максимальной комплектации рассматриваемой модели можно приобрести довольно популярный автомобиль Hyundai creta или Opel antara … Однако эти дорогие автомобили будут стоить на порядок дороже. .

Отечественный производитель АвтоВАЗ неоднократно подводил автомобилистов лживыми обещаниями. Анонсированный в 2016 году полноприводный Lada X Rey — это пока только проект будущего, хотя его запуск неоднократно планировался на протяжении 2017 года.

Сейчас массовое производство снова откладывается на неопределенный срок, но по заверениям производителя старт продаж стоит ожидать в начале или середине 2018 года. Хотите верьте, хотите нет, такие обещания — личное дело каждого автомобилиста.

Полноприводный X Ray фото:

Однако, на фоне предположений, основные характеристики автомобиля постепенно просачиваются из достоверных источников. Сегодня общая картина более чем ясна.

Попробуем объединить информацию, поступающую с АвтоВАЗа, и представить будущую Lada X Ray Cross с полноценным серийным автомобилем.Несомненно, будут небольшие доработки, но с дизайном экстерьера, двигателем и комфортом пассажиров все ясно.

Габариты будущего внедорожника

Габариты позаимствованы у Renault Duster будут очень хорошо просматриваться. Несмотря на старт продаж в 2018 году, кардинально менять дизайн экстерьера никто не будет. Хотя, учитывая тенденции в машиностроении, такой шаг мог бы стать преимуществом перед устаревшими конкурентами. Платформа «B0» будет переработана под текущие требования системы полного привода.

Длина и другие параметры идентичны стандартной Lada X Rey:

• длина — 4165 мм;
• ширина — 1765 мм;
• база — 2592.

Единственное нововведение — клиренс. Увеличен в соответствии с требованиями 4х4. Учитывая концепцию, представленную пару лет назад, следует рассчитывать на высоту 200 мм и более. Точные данные по наиболее важному параметру остаются засекреченными.

Немного коснемся внешнего вида.Предполагается, что модель Cross будет анонсирована в горчичном оттенке, который является основным цветом линейки 2018 года. В сочетании с темным обвесом из твердого, устойчивого к царапинам пластика внешний вид выглядит гармонично. Нет резких изменений цвета, отвлекающих внимание от общей концепции.

Обвес хоть и выполняет защитную функцию, но устанавливается на Lada X Ray с целью популяризации новинки среди молодежи. Подобные отблески появляются после изучения решетки радиатора, окрашенной в соответствующий оттенок.

Всепоглощающий черный цвет подчеркивает премиальность, объединяя решетку радиатора и обвес в одно целое. Характерным элементом является хромированная металлическая вставка из двух половинок, которые размещены по бокам номерного знака и образуют символ X.

Декоративные изгибы передней двери автомобиля придают автомобилю немного спортивный вид. Они направлены под наклоном вперед для придания стремительности. На задних дверях рисунок визуально приподнимает кузов, делая его настоящим внедорожником.

Завершают экстерьер 17-дюймовые колеса.Их ждут абсолютно все любители линейки Lada X Ray. Колеса меньшего размера выглядят просто нелепо среди больших арок кузова, что полностью разрушает гармонию линий. За их отсутствие на первых моделях АвтоВАЗ поплатился критикой со стороны всех автомобилистов.

Комфортное пассажирское пространство

С учетом внедорожных характеристик новинки интерьер должен иметь все современные решения, создающие максимальный комфорт. Это то, что пытались сделать дизайнеры. Они переработали многие элементы, унаследованные от своего предшественника.Нет ярких марких оттенков. На смену им приходят черный, горчичный и хромовый цвета.

Сиденья оснащены новейшей системой предварительного натяжения. Функциональный подлокотник нужно будет удобно адаптировать к водителю и его привычкам. На порогах есть логотип, а сами они выполнены из хромированного металла.

Из минусов стоит отметить пространство для ног задних пассажиров. На ухабистой дороге высоким людям стоит забыть о комфорте. По багажнику очевидными останутся следующие показатели:

• 1207 л.- со сложенными сиденьями;
• 361 л. — стандартное положение для сидения.

Мощность кроссовера

АвтоВАЗ еще может удивить мощностью двигателя. Есть теория о причастности компании «Рикардо» к созданию энергоблока. Пока есть твердое мнение о двигателе 1,8 л. Именно он соответствует известным сегодня кросс-характеристикам. Его мощность ограничена 122 л.с. из. (170 Нм). Французский конкурент, являющийся прототипом, все же более мощный — 143 л.с.из.

Полноприводная Lada X Rey с таким двигателем останется городским транспортом семейного типа. Дадут легкие условия бездорожья, но о полноценном выезде с бездорожья и речи быть не может.

Обобщая имеющуюся информацию о Lada X Ray 4×4

Постоянные откладывания старта продаж увеличивают вероятность выхода на рынок устаревшего автомобиля. Никто не будет перерабатывать основные элементы для текущих инноваций из мира автомобилестроения, а уже заложенные технологии остаются на уровне 2016 года.Ожидать революционных изменений от Cross для российского рынка нет смысла.

Полноприводная цена

По предварительным оценкам экспертов, ориентировочная цена составит около миллиона рублей. Такое выравнивание снижает привлекательность для среднестатистического россиянина, что задерживает окупаемость всего проекта.

Последующий рестайлинг снова откладывается из-за отсутствия финансирования. Ситуация с текущими делами вокруг Lada Kh Rey с полным приводом повторится.

Новая Lada X Ray Cross 2018 модельного года может расширить покупательскую аудиторию модели. Впервые «живые» версии Lada XRay Cross были публично представлены в конце августа 2016 года. Но до серийных вариантов внедорожного хэтчбека с высоким клиренсом дело дошло только сейчас. Скорее всего, рыночный успех Lada Vesta Cross предопределит судьбу XRay Cross.

АвтоВАЗ знает рецепт создания внедорожных версий обычных автомобилей. Тем более что у нас уже есть опыт.Калина Кросс, Ларгус Кросс и последняя новинка Веста Кросс, которая может оказаться самой удачной в этой серии. Крест не требует серьезных переделок. Освойте производство пластиковых накладок, поставьте колеса большего размера и отрегулируйте подвеску для увеличения дорожного просвета … С XPy это будет еще проще, вам даже не нужно трогать подвеску, там клиренс уже достаточно низкий -дорожный уровень.

Экстерьер XRAY Cross получит оригинальные бамперы, защитный пластик на колесных арках, защитные молдинги на дверях и порогах.Возможно, модель будет оснащена легкосплавными дисками оригинальной конструкции. Пластиковый обвес из неокрашенного пластика предназначен для защиты эмали кузова на легком бездорожье. Если учесть, что легкие условия бездорожья есть в центре многих городов, то в успешности внешнего вида модели сомневаться не приходится.

Фото новой Lada X Ray Cross 2018

Создание интерьера версий «Кросс» по современным проверенным технологиям не является серьезной задачей.Более того, в X Ray уже есть возможность установить разноцветные панели на обшивку дверей, лицевую панель … И даже найти оригинальную ткань на креслах и красиво прошить ее ярко-оранжевыми нитками. Появится ли ярко-оранжевая подсветка панели приборов — вопрос открытый, так как на Vesta SW Cross это решение оказалось недоработанным. Так как при ярком свете, например днем, приборная панель читается плохо. Возможно, для Hray Cross предложат еще один вариант подсветки.

Фото салона Lada X Ray Cross 2018

Багажник обычного XP и его внедорожной версии по аналогии с универсалом Vesta и Vesta Cross останется прежним, но получит дополнительные сетки и прочие фишки. И не забывайте о двойном дне XRay.

Фото багажника Лада X Ray Cross

Технические характеристики Lada XRay Cross

Ходит довольно много слухов о возможности выпуска полноприводной версии XRay Cross 4×4.Даже используя готовое решение, от того же Renault Duster с его электромагнитной муфтой, затраты могут стать для АвтоВАЗа непосильной ношей. Да и итоговая цена полноприводного Xray Cross вряд ли будет дешевле его основных конкурентов, да и конкуренция в этой нише серьезная.

Поэтому технически не стоит ожидать чудес и невероятных прорывов. Та же платформа Renault Sandero Stepway со всеми проблемами и преимуществами. Передняя подвеска независимая «Макферсон», задняя полузависимая деформируемая балка.Тормоза спереди дисковые, сзади чугунные барабанные. Хотя в Vesta Cross сзади отказались от барабанных в пользу дисковых тормозов. Возможно, такое нововведение будет внедрено в XRay Cross.

Передний привод и поперечное расположение силового агрегата имеет ряд преимуществ, но при создании полноприводных версий имеет ряд ограничений. Под капотом X Ray изначально анонсировали не только отечественные двигатели, но и современный агрегат Renault-Nissan объемом 1,6 литра с алюминиевым блоком цилиндров и цепным приводом ГРМ.Его даже установили на некоторые из первых серийных машин.

Базовый 1,6 литровый бензиновый атмосферник мощностью 106 л.с. ставил практически на все модели жигулей. Агрегат давно родился как с 5-ступенчатой ​​механикой, так и с роботизированной коробкой AMT. Более мощный и перспективный 1,8-литровый 122-сильный мотор уже в 2018 году может получить вариатор от альянса Renault-Nissan или классический гидротрансформаторный автомат в паре. Скорее всего, на внедорожных версиях X Ray эти варианты трансмиссии появятся первыми.

Размеры, масса, объемы, клиренс XRay Cross

• Длина корпуса — 4165 мм
• Ширина — 1764 мм
• Высота — 1570 мм
• Снаряженная масса — от 1190 кг
• Полная масса — 1650 кг
• Колесная база — 2592 мм
• Колея передняя и колеса задние — 1484/1524 мм
• Объем багажника — 361 литр
• Объем багажника при сложенных сиденьях — 1207 литров
• Объем топливного бака — 50 литров
• Размер шин — 205/55 R16
• Дорожный просвет — 205 мм

Видео Lada XRay Cross 2018

Видеообзор концепта X Ray Cross с Московского автосалона.

Цена и комплектация Lada X Ray Cross 2018 модельного года

Как показывает практика, внедорожные версии «Кросса» намного дороже базовых версий автомобилей-доноров. На это есть несколько причин. Во-первых, для модификаций Cross берут довольно дорогую комплектацию … Во-вторых, не забываем про другие бамперы, пластиковый обвес и салон с оригинальными вставками. Это увеличивает стоимость.

Например, возьмем Vesta Cross в комплектации Lux с цифрой 1.Двигатель объемом 8 литров и роботизированная коробка передач AMT стоимостью 805 900 рублей, аналог Весты SW в такой же комплектации, с таким же двигателем, имеет ценник 762 900 рублей. То есть переплата за Крест составляет 43 тысячи рублей. Зная цену обычного XPay, достаточно добавить 40-45 тысяч рублей и получить цену XRay Cross в такой же комплектации и с таким же блоком питания.

Интрига с выпуском новой линейки Lada началась с демонстрации прототипа Lada X Ray.В принципе, эта модель должна была появиться первой. Но по ряду причин Веста стала первопроходцем. В чем причина этого решения? Не исключено, что на решение повлияло то, что спрос на седан этого класса был выше. Вариативность и разнообразие предлагаемого ассортимента комплектаций позволит наиболее основательно протестировать отечественный рынок.

Отрадно, что руководство компании так серьезно подошло к своей работе.В общем, после прихода к власти Бу Андерссона слово «впервые» абсолютно уместно для многих мероприятий. И оригинальный дизайн, и шпионские фото, и президент страны, тестирующий Lada Vesta, и, как венец истории, презентация и выпуск самого автомобиля. И снова российскому покупателю впервые предложили автомобиль мирового уровня.

Поступят ли в продажу полноприводные Lada Vesta и X Ray?

После блестящего старта переднеприводного седана вошедшие во вкус автомобилисты с нетерпением ждут анонсированного кроссовера и Lada Vesta 4×4.Оснований для недоверия нет. При этом новая политика компании не разочаровала потребителя и нет сомнений в том, что обещания будут выполнены. Чего ожидать от этих «заряженных» версий? Почему эти машины такие желанные? Причины на поверхности. Мощность машины и конечно же цена, которая обещает быть разумной. То, что предприятие вышло на совершенно новый технический уровень, уже можно считать свершившимся фактом.

Проведена огромная работа по внедрению самых передовых методов производства.А главное — собрана уникальная с точки зрения профессиональной подготовки команда. Это сразу сказалось на качестве сборки. С конвейера сходят изделия высокой культуры производства. Порадует автолюбителей и разнообразие моделей. Готовящаяся к выпуску полноприводная Lada X Ray Cross 4×4 становится хитом еще до своего выпуска.

Аналогичная эволюция ждет Весту. 2016 год обещает быть очень интересным, так как запланированы презентации и продажи ряда новых автомобилей.

Характеристики полноприводных версий Лады

Точная дата будет объявлена, скорее всего, в начале 2016 года. Тогда же, вероятно, будет объявлена ​​комплектация первого выпуска. Многие решения будут приниматься на основе анализа продаж, пожеланий и запросов покупателей. Отечественные автомобилисты пока не привыкли к такому отношению. Маркетинговые исследования и опросы уже ведутся. Становится ясно, что спрос на мощные отечественные автомобили велик.Отказавшись от двигателя 11189 именно из-за его слабых параметров, переднеприводный автомобиль первого выпуска оснащается ВАЗ 21129. Но для схемы 4х4 этого будет недостаточно. Полноприводная Lada Vesta с двигателем HR 16DE-h5M — более доступный вариант.

Кросс

X Ray наверняка будет иметь под капотом ВАЗ 21179 в самом первом выпуске. Объем этого силового агрегата составляет 1,8 литра, не так много для кроссовера, но это только начало. Не будем сейчас раскрывать все секреты.Наверняка очень скоро будет более полная информация, и будет очередная инсайдерская вброс в виде видео и фотографий. Еще интереснее будет наблюдать за развитием отечественного автопрома. Скорее всего салон кардинальных изменений не претерпит … Доработки конечно будут, но в целом с интерьером определились.

Основные сюрпризы будут в технической части. Интересно, что Lada Vesta оказалась в одном ряду с Kio Rio Hyundai Solaris.Несмотря на то, что корейские автомобили несколько мощнее, общее впечатление во многом не в их пользу. С какими конкурентами X Ray будет бороться за покупателя? Помимо гордости за отличный дизайн снаружи и в салоне, радует и информация о габаритах автомобиля. Длина 4315 мм. Ширина кузова 1820 мм, при высоте 1625 мм. Короткие свесы и дорожный просвет 210 мм обеспечивают высокую проходимость.

Возможные модификации полноприводных автомобилей Лада

Популярные модели часто называют конкурентами Renault Sandero Stepway и Duster.Но X Ray более компактный. Так что он выиграет в проходимости, что очень важно для российского автомобилиста. Президент АВТОВАЗа Бу Андерссон уже объявил, что производство X Ray начнется в начале 2016 года. Модификация Cross будет запущена через несколько месяцев. Этот человек не бросает слов на ветер и в том, что обещания будут выполнены вовремя, никто не сомневается.

Россияне еще не успели протестировать новый хэтчбек из Тольятти — XRay, старт продаж которого начался в середине февраля, как и появилась информация о новой модификации этой модели.

Немного истории. Настоящий фурор произвел 2012 год на Московском автосалоне, когда состоялась премьера концепта XRay. Он задал новый стиль дизайна и в последующем развитии компании послужил основой для этого автомобиля … Следующие невероятные эмоции зрители получили во время премьеры XRay Concept2 в Москве в 2014 году, которая стала еще более похожей на серийная версия модели.

После этого, наконец, в августе прошлого года дилеры представили кроссовер-хэтчбек Lada XRay.Производитель сообщил, что до конца 2015 года будет создано около 1000 моделей, а в 2016 году — 50 000 единиц. И уже в декабре прошлого года, как и обещала компания, на конвейер поставили новенькую машину. «Высокая модель в кузове хэтчбек, относящаяся к B-классу, создана в стиле SUV» — так позиционирует эту новинку АвтоВАЗ.

Напомню, что в конструктивном плане автомобиль Lada XRay имеет много общего с хорошо знакомым российским потребителям Renault Sandero stepway… Но если это французский производитель выпускает только модели с системой переднего привода, то отечественная разработка должна со временем обзавестись полным приводом, об этом уже не раз говорили представители АвтоВАЗа.

Совсем недавно в пресс-службе компании также упоминалась дата появления модификации с полным приводом Lada XRay Cross. С их слов стало известно, что новинка появится во второй половине следующего года. Судя по всему, это детище ВАЗа станет первым полноценным серийным кроссовером отечественного производства, который будет предлагаться в двух вариациях: переднеприводной и полноприводной.

Внешний вид Lada XRay Cross 2017

В сети появились патентные иллюстрации внедорожной версии недавно представленного автомобиля. Изображения находятся в базе данных Федеральной службы «Роспатент».

Известно, что вездеходная версия модели, как и стандартная версия Lada XRay, будет стилистически оформлена по внешнему виду концептуальной версии XRay Concept2, но по предварительной информации, как техническая база для В кросс-версии от машины будет взята платформа, включая всю ходовую часть, что с большей вероятностью сделает машину длиннее концепта.

Надо сказать, что стандартный XRay основан на Renault Sandero.

Внедорожник XRay будет отличаться от начальной версии увеличенным клиренсом (правда, в базе он не совсем маленький — 195 мм), машина получит новый защитный обвес на лобовой части. Также новинка получит новый бампер, оригинальные накладки на массивные черные колесные арки и пороги. Автомобиль будет отличаться наличием доработанных перил на крыше.

Пластиковая защита порога выполнена в необычном стиле — она ​​увеличивается в ширину к задней части кузова. Задняя оптика будет совсем другой. У нее более изысканный вид, чем у обычной задней оптики XRay.

Есть информация, что помимо увеличенного клиренса увеличатся еще и колеса. Они останутся шестнадцатью дюймами, но профиль шины будет немного больше.

Технические характеристики новинки

Но, скорее всего, в техническом плане новинка проиграет топовой версии Renault Duster.

Предположительно полноприводная Lada XRay Cross получит тольяттинский силовой агрегат объемом 18 литров, который будет выдавать 123 л.с. мощности, в то время как «заряженный француз» в своем моторном отсеке имеет двухлитровый мотор с увеличенной мощностью 143 л.с. после недавнего обновления.

«Что касается системы полного привода, то мы будем использовать именно ту, которая обеспечит водителю полную уверенность и комфорт в сложных дорожных условиях — неровном дорожном покрытии, льду и снегу, дождю.Этот вариант привода обеспечит более уверенное управление, а также отличный старт на скользких участках », — сказал Олег Гренянков (руководитель проекта).

Примечательно, что до этого момента только одна машина имела полный привод -.

Стоимость Lada XRay Cross 2017

Скорее всего, цена вездеходной модификации будет на уровне ее французского донора. Стоимость базовой версии XRay, старт продаж которой состоялся в феврале этого года, составляет около 600000 рублей, что в принципе соизмеримо с аналогичными автомобилями.Для сравнения можно привести наиболее близкий ему по духу Renault Sandero.

Этот автомобиль на данный момент предлагается в базовой версии за 589 000 рублей, а также Renault Duster с системой переднего привода за 599 000 рублей. В итоге цена Lada XRay Cross с системой полного привода, как и в том же Дастере, вполне может равняться 1000000 рублей.

Цели и планы компании

Отечественный производитель, несмотря на сложную экономическую ситуацию в стране, ставит перед собой серьезную цель — стать лучшим производителем автомобилей в России.Именно это прослеживается в стратегии развития компании. Также отечественная чушь гарантирует в ближайшее время поднять планку для Lada на 20 процентов и увеличить экспорт до 50 процентов.

Для реализации задуманного АвтоВАЗ решил изменить себя и пересмотреть весь модельный ряд, обновив все удачные модели и дополнив его свежими современными опциями.

По внешнему виду можно сказать, что все новинки будут основаны на концепции XRay.

Так в планах компании обновить модель Лада Гранта 2016 (седан). Сразу после этого с хэтчбеком данной модели произойдет рестайлинг. Также апгрейд коснется модели Lada Kalina нового поколения, который состоится в конце этого или начале следующего года. В этот же период будут внесены улучшения в модель Ларгус.

Также совсем недавно президент АвтоВАЗа объявил дату презентации серийной модели Lada Vesta Cross.Прототип этой машины пришелся по душе посетителям выставки внедорожников в Москве. Псевдокроссовер в моноприводном исполнении появится в конце сентября этого года.

«Цель, которую поставил перед нами президент, — в этом году разработать два новейших продукта. Первый — это XRay Cross с передним и полным приводом и Lada Vesta Cross в версии 4×2. Именно этим двум проектам в этом году будет уделено максимальное внимание », — сказал топ-менеджер предприятия.

Бо Андерсон объяснил, что эти два проекта являются «революционными» для всего модельного ряда компании. Чуть раньше все знали свежую машину под кодовым названием BM Hatch, а полноприводная модификация получила название B-Cross.

Lada XRay 2017: фото

Гитарная передача | Carlisle, PA

(ПРОДАНО) 549,99 $ Отличный усилитель, супер чистый и в отличном состоянии.

Обзор

— Выходная мощность: 15 Вт

— Динамик: 1-12 дюймов Celestion G12M Greenback

— Трубки: EL84 (2), 12AX7 (3) Скорость, реверберация, низкие и высокие частоты, максимальная громкость, нормальная громкость

-Размеры: 24 дюйма x 16.5 «x 10,5»

-Вес: 49 фунтов

Появившиеся в 1960-х годах двухцветные усилители VOX доминировали в мире благодаря их использованию в то время новаторскими английскими рок-н-ролльными группами. В Vox AC15C1-TV-BC каждая деталь была тщательно воспроизведена, начиная с синего и кремового цветов с его мгновенно узнаваемой эстетикой, толстой золотой окантовкой, проложенной в стыках двухцветного покрытия, и, конечно же, в стиле ретро. ТВ-фасадный дизайн шкафа. Благодаря уникальному и элегантному внешнему виду и классическому звуку VOX, эти усилители демонстрируют VOX на вершине своего мастерства.

Усилители VOX AC15C1-TV-BC Limited Edition Custom Series предлагают два канала; Нормальный и Top-Boost. Каждый канал оснащен собственным регулятором громкости, а канал Top Boost предлагает интерактивные регуляторы тембра высоких и низких частот. Это мощное сочетание каналов обеспечивает множество возможностей управления созданием тона, позволяя набирать классический тон, который будет вашим собственным. Оба канала зависят от регуляторов Tone Cut и Volume в секции Master. Регулятор Tone Cut работает на силовом каскаде, а не на стадии предусилителя, обеспечивая дополнительную степень формирования тона.Регулятор Master Volume работает вместе с индивидуальной громкостью каждого канала для создания нужной степени усиления. Уравновешивая индивидуальную громкость и общую громкость, усилитель может выдавать желанный чистый «звенящий» звук VOX или мощный перегруженный тон — и все, что между ними.

Вы можете смягчить звук усилителя VOX AC15C1-TV-BC с помощью эффекта VOX Classic Tremolo. И скорость, и глубина регулируются, что делает схему тремоло чрезвычайно полезной, позволяя генерировать именно тот звук, который вы хотите.Также присутствует теплая весенняя реверберация, добавляющая звуку простора. Совместное использование реверберации и тремоло может создать еще более интересные эффекты. Эти встроенные эффекты придают усилителю индивидуальность и добавят новые измерения звука в вашу игру.

Невозможно ошибиться в истинном ламповом тоне. В AC15C1-TV-BC используются 3 лампы предусилителя 12AX7, а пара ламп EL84 в AC15C1-TV-BC дает мощность 15 Вт. Он также предлагает переключаемый разъем 8/16 Ом для питания внешнего динамика, когда вам нужно говорить с чуть большей властью; использование этого разъема отключит звук внутренних динамиков.Гнездо для динамика расширения позволяет использовать дополнительный кабинет на 16 Ом вместе с внутренними динамиками для более полного звука.

Без сомнения. Гитарный усилитель VOX AC15C1-TV-BC может многое предложить — двухканальный, тремоло, реверберация и многое другое. К счастью, усилитель может использовать педальный переключатель VOX VFS2A, позволяющий включать и выключать эффекты реверберации и тремоло, когда вы продолжаете играть.

В цену входит откидная крышка с мягкой подкладкой Vox

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

---

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с вашим системным администратором.

---

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

---

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Murray Hill, Манхэттен, Нью-Йорк | Неотложная медицинская помощь MedRite

Мюррей Хилл

919 2nd Ave
New York, NY 10017
(телефон) 212-935-3333

Часы работы офиса
Воскресенье: 8:00 — 20:00
Пн — Чт: 8:00 — 22:00
Пятница: 8:00 — 19:00

Неотложная медицинская помощь MedRite

Вы заболели гриппом? Вы недавно попали в аварию? В Центре неотложной помощи Murray Hill MedRite мы предлагаем удобные услуги без предварительной записи и расширенные часы, чтобы пациенты могли получить необходимую помощь, как только они в ней нуждаются.Наша круглосуточная клиника — это долгожданный побег от хлопот с бронированием врача и расходов, связанных с обращением в отделение неотложной помощи. Благодаря разумным ценам и высококвалифицированным врачам вы получите первоклассный опыт без лишнего багажа.

Если вам или вашему ребенку требуется медицинская помощь, мы здесь, чтобы лечить неопасные для жизни состояния пациентов любого возраста. Некоторые из травм и болезней, которые мы лечим, включают: розовый глаз, инфекции мочевыводящих путей, аллергические реакции, фурункулы, лихорадку, грипп, заложенность носа, растяжения, царапины, рваные раны, переломы костей, инфекции уха, мигрень и многое другое.

Когда вы посещаете Центр неотложной помощи MedRite, вам не нужно беспокоиться о проблемах со страховкой. Мы принимаем всех основных поставщиков, в том числе: Aetna, Blue Cross / Blue Shield, United Health Care, Horizon, Empire, Guardian, Oxford и т. Д. Если вы в настоящее время не застрахованы, мы предложим вам специальную скидку, чтобы вы выиграли » не быть финансовым бременем.

В Центре неотложной медицинской помощи Murray Hill MedRite мы принимаем все основные страховые компании, чтобы наилучшим образом обслуживать наших пациентов. Если вы не застрахованы, мы также предлагаем скидку на услуги, чтобы ваше лечение не стоило ни руки, ни ноги.Вот лишь несколько страховых компаний, с которыми мы работаем: Aetna, Horizon Blue Cross / Blue Shield, Cigna, Tricare, Oxford, Medicare, Magnacare, Guardian, Emblem, Empire Plan и другие.

Если в настоящее время вы чувствуете себя хуже, чем обычно, и вам требуется немедленная медицинская помощь, вам поможет Центр неотложной помощи Murray Hill MedRite. В нашем современном центре есть собственная лаборатория и высокотехнологичные рентгеновские аппараты, что делает процесс диагностики более эффективным и беспроблемным. Когда вы отправите образец мочи, анализ крови или сканирование костей, мы получим результаты быстрее, чем когда-либо, поэтому мы сможем лечить ваше состояние без каких-либо задержек.

Для получения дополнительной информации и ответов на все ваши вопросы просто заполните эту онлайн-форму регистрации и найдите там нашу контактную информацию. Мы с нетерпением ждем вашего ответа!

Экономьте время… Почувствуйте себя лучше…

Флуоресцентная микроскопия с резонансным переносом энергии (FRET) — Общие понятия

Вводные понятия

Точное расположение и природа взаимодействий между конкретными молекулярными видами в живых клетках представляет большой интерес во многих областях биологических исследований, но исследованиям часто мешает ограниченное разрешение инструментов, используемых для изучения этих явлений.Обычная широкопольная флуоресцентная микроскопия позволяет локализовать флуоресцентно меченые молекулы в пределах оптического пространственного разрешения, определяемого критерием Рэлея, примерно 200 нанометров (0,2 микрометра). Однако для понимания физических взаимодействий между белками-партнерами, участвующими в типичном биомолекулярном процессе, относительная близость молекул должна быть определена более точно, чем позволяют традиционные методы оптической визуализации с дифракционным ограничением. Метод резонансной передачи энергии флуоресценции (чаще обозначаемый аббревиатурой FRET ) в применении к оптической микроскопии позволяет определять сближение двух молекул в пределах нескольких нанометров (см. Рисунок 1), расстояние, достаточно близкое для происходить молекулярные взаимодействия.

Типичные методы флуоресцентной микроскопии основаны на поглощении флуорофором света на одной длине волны (возбуждение) с последующим испусканием вторичной флуоресценции на более длинной длине волны. Длины волн возбуждения и излучения часто отделены друг от друга на десятки и сотни нанометров. Маркировка клеточных компонентов, таких как ядра, митохондрии, цитоскелет, аппарат Гольджи и мембраны, специфическими флуорофорами позволяет их локализовать в фиксированных и живых препаратах.Путем одновременного мечения нескольких субклеточных структур отдельными флуорофорами, имеющими отдельные спектры возбуждения и испускания, можно использовать специальные комбинации флуоресцентных фильтров для изучения близости меченых молекул в пределах одной клетки или участка ткани. С помощью этого метода молекулы, которые расположены ближе друг к другу, чем предел оптического разрешения, кажутся совпадающими, и эта очевидная пространственная близость подразумевает, что молекулярная ассоциация возможна. В большинстве случаев, однако, нормального разрешения флуоресцентного микроскопа с ограничением дифракции недостаточно, чтобы определить, действительно ли имеет место взаимодействие между биомолекулами.Флуоресцентный резонансный перенос энергии — это процесс, при котором происходит безызлучательная передача энергии от флуорофора в возбужденном состоянии ко второму хромофору в непосредственной близости. Поскольку диапазон, в котором может происходить передача энергии, ограничен приблизительно 10 нанометрами (100 ангстрем), а эффективность передачи чрезвычайно чувствительна к расстоянию между флуорофорами, измерения резонансной передачи энергии могут быть ценным инструментом для исследования молекулярных взаимодействий. .

Механизм резонансной передачи энергии флуоресценции включает в себя флуорофор донора в возбужденном электронном состоянии, который может передавать свою энергию возбуждения соседнему хромофору акцептора без излучения посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния. Теория, поддерживающая передачу энергии, основана на концепции рассмотрения возбужденного флуорофора как колеблющегося диполя, который может подвергаться энергетическому обмену со вторым диполем, имеющим аналогичную резонансную частоту.В этом отношении резонансная передача энергии аналогична поведению связанных осцилляторов, таких как пара камертонов, колеблющихся на одной и той же частоте. Напротив, радиационная передача энергии требует испускания и повторного поглощения фотона и зависит от физических размеров и оптических свойств образца, а также от геометрии контейнера и путей волнового фронта. В отличие от радиационных механизмов, резонансный перенос энергии может дать значительный объем структурной информации о донорно-акцепторной паре.

Резонансная передача энергии нечувствительна к окружающей оболочке растворителя флуорофора и, таким образом, дает молекулярную информацию, уникальную по сравнению с той, которая выявляется с помощью зависящих от растворителя событий, таких как гашение флуоресценции, реакции возбужденного состояния, релаксация растворителя или измерения анизотропии. Основное влияние растворителя на флуорофоры, участвующие в резонансном переносе энергии, — это влияние на спектральные свойства донора и акцептора. Безызлучательный перенос энергии происходит на гораздо больших расстояниях, чем краткосрочные эффекты растворителя, и диэлектрическая природа компонентов (растворителя и макромолекулы хозяина), расположенных между задействованными флуорофорами, очень мало влияет на эффективность резонансной передачи энергии, которая зависит в первую очередь от расстояние между донорным и акцепторным флуорофором.

Явление резонансной передачи энергии флуоресценции не опосредовано излучением фотонов и, кроме того, даже не требует, чтобы акцепторный хромофор был флуоресцентным. Однако в большинстве приложений и донор, и акцептор являются флуоресцентными, и возникновение передачи энергии проявляется в тушении донорной флуоресценции и уменьшении времени жизни флуоресценции, сопровождаемом также увеличением эмиссии флуоресценции акцептора. Эффективность процесса передачи энергии изменяется пропорционально обратной шестой степени расстояния, разделяющего молекулы донора и акцептора.Следовательно, измерения FRET могут использоваться в качестве эффективной молекулярной линейки для определения расстояний между биомолекулами, помеченными соответствующим донорным и акцепторным флуорохромом, когда они находятся в пределах 10 нанометров друг от друга.

Гипотетический пример резонансной передачи энергии флуоресценции между двумя флуорохромами, прикрепленными к противоположным концам одного и того же макромолекулярного белка, представлен на рисунке 1. В нативной конформации (рисунок 1 (а)) два флуорофоров разделены расстоянием приблизительно 12 нанометров — это слишком далеко для передачи энергии внутримолекулярного резонанса между флуорохромами.Однако, когда белок подвергается конформационному изменению (рис. 1 (b)), два флуорохрома сближаются гораздо ближе и теперь могут участвовать в молекулярных взаимодействиях FRET. На рисунке возбуждение донорного флуорохрома показано синим свечением вокруг желтой трехъядерной ароматической молекулы, в то время как соответствующая акцепторная эмиссия (рисунок 1 (b)) представлена ​​зеленым свечением, окружающим второй гетероциклический флуорохром справа. -ручная сторона белка.Измерения передачи энергии часто используются для оценки расстояний между участками макромолекулы и влияния конформационных изменений на эти расстояния. В этом типе экспериментов степень передачи энергии используется для расчета расстояния между донором и акцептором и получения структурной информации о макромолекуле.

Хотя флуоресцентный резонансный перенос энергии часто использовался для исследования межмолекулярных и внутримолекулярных структурных и функциональных модификаций белков и липидов, основным препятствием для реализации методов FRET-микроскопии в живых клетках было отсутствие подходящих методов мечения конкретных внутриклеточных белки с соответствующими флуорофорами.Клонирование зеленого флуоресцентного белка медузы ( GFP ) и его экспрессия в самых разных типах клеток стало критическим ключом к разработке маркеров как для экспрессии генов, так и для структурной локализации белка в живых клетках. Было разработано несколько вариантов мутации этого белка, различающихся по спектру, включая флуоресцентный белок, излучающий синий свет ( синий флуоресцентный белок , BFP ). Спектры возбуждения и излучения для нативных мутантов GFP и BFP достаточно разделены по длинам волн, чтобы быть совместимыми с подходом FRET.Рисунок 2 иллюстрирует стратегию обнаружения белок-белковых взаимодействий с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и мутантных флуоресцентных белков. Если два белка, один из которых помечен BFP (донор), а другой — GFP (акцептор), физически взаимодействуют, то при возбуждении комплекса при максимальной длине волны поглощения будет наблюдаться повышенная интенсивность в максимуме эмиссии акцептора (510 нанометров). (380 нм) донора. Неспособность белков образовать комплекс не приводит к эмиссии акцептора (GFP) флуоресценции.

В сочетании с достижениями в области импульсных лазеров, микроскопической оптики и компьютерных технологий визуализации разработка методов маркировки, в которых донорные и акцепторные флуорофоры фактически являются частью самих биомолекул, позволила визуализировать динамические взаимодействия белков в живых клетках. В дополнение к исследованию взаимодействий белковых партнеров, недавние применения флуоресцентного резонансного переноса энергии включают исследования активности протеаз, изменений потенциалов мембранного напряжения, метаболизма кальция и проведение высокопроизводительных скрининговых анализов, таких как количественная оценка экспрессии генов в одиночные живые клетки.

Принципы передачи энергии резонанса флуоресценции

Процесс резонансной передачи энергии ( RET ) может иметь место, когда донорный флуорофор в электронно возбужденном состоянии передает свою энергию возбуждения соседнему хромофору, акцептору. В принципе, если спектр излучения флуоресценции молекулы-донора перекрывает спектр поглощения молекулы-акцептора и они находятся в пределах минимального пространственного радиуса, донор может напрямую передавать свою энергию возбуждения акцептору через диполь-дипольные межмолекулярные соединения на большие расстояния. связь.Теория, предложенная Теодором Фёрстером в конце 1940-х годов, первоначально описывала молекулярные взаимодействия, участвующие в резонансной передаче энергии, и Фёрстер также разработал формальное уравнение, определяющее взаимосвязь между скоростью передачи, межхромофорным расстоянием и спектральными свойствами задействованных хромофоров.

Резонансный перенос энергии — это безызлучательный квантово-механический процесс, который не требует столкновения и не требует выделения тепла. Когда происходит передача энергии, молекула-акцептор гасит флуоресценцию молекулы-донора, и если акцептор сам является флуорохромом, наблюдается повышенное или сенсибилизированное излучение флуоресценции (см. Рисунок 3).Это явление можно наблюдать, возбуждая образец, содержащий как донорные, так и акцепторные молекулы, светом с длинами волн, соответствующими максимуму поглощения донорного флуорофора, и детектируя свет, излучаемый с длинами волн с центром вблизи максимума излучения акцептора. Альтернативный метод обнаружения, быстро набирающий популярность, заключается в измерении времени жизни флуоресценции донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.

На рисунке 3 представлена ​​диаграмма Яблонского, иллюстрирующая связанные переходы между испусканием донора и поглощением акцептора при резонансном переносе энергии флуоресценции.Абсорбционные и эмиссионные переходы представлены прямыми вертикальными стрелками (зелеными и красными соответственно), а колебательная релаксация — волнистыми желтыми стрелками. Связанные переходы показаны пунктирными линиями, что указывает на их правильное расположение на диаграмме Яблонского, если они возникли в результате опосредованных фотонами электронных переходов. В присутствии подходящего акцептора донорный флуорофор может передавать энергию возбужденного состояния непосредственно акцептору, не испуская фотон (показано синей стрелкой на рисунке 3).Получающееся в результате сенсибилизированное флуоресцентное излучение имеет характеристики, аналогичные спектру излучения акцептора.

Чтобы произошла резонансная передача энергии, должны быть выполнены несколько критериев. В дополнение к перекрывающимся спектрам излучения и поглощения донорных и акцепторных молекул, два задействованных флуорофора должны располагаться на расстоянии от 1 до 10 нанометров друг от друга. Как описано в уравнениях, выведенных Фёрстером (и обсуждаемых ниже), эффективность передачи энергии между донорными и акцепторными молекулами уменьшается в шестой степени расстояния, разделяющего их.Следовательно, способность донорного флуорофора передавать свою энергию возбуждения акцептору за счет безызлучательного взаимодействия резко снижается с увеличением расстояния между молекулами, ограничивая явление FRET максимальным радиусом разделения донор-акцептор, составляющим приблизительно 10 нанометров. На расстояниях менее 1 нанометра возможны несколько других режимов передачи энергии и / или электронов. Зависимость процесса резонансной передачи энергии от расстояния является основной основой его полезности при исследовании молекулярных взаимодействий.В исследованиях живых клеток с участием молекул, меченных донорными и акцепторными флуорофорами, резонансная передача энергии будет происходить только между молекулами, которые находятся достаточно близко, чтобы биологически взаимодействовать друг с другом.

Дополнительным требованием для резонансной передачи энергии является то, что время жизни флуоресценции донорной молекулы должно быть достаточным для того, чтобы событие могло произойти. Как скорость ( K (T) ), так и эффективность ( E (T) ) передачи энергии напрямую связаны со временем жизни донорного флуорофора в присутствии и в отсутствие акцептора.Согласно теории Фёрстера и подтвержденной экспериментально, скорость передачи энергии определяется уравнением:

KT = (1 / τD) • [R0 / r] 6

, где R (0) — критическое значение Фёрстера. расстояние , τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора, а r — расстояние, разделяющее донорные и акцепторные хромофоры. Критическое расстояние Фёрстера ( R (0) ) определяется как радиус разделения акцептор-донор, для которого скорость передачи равна скорости распада донора (снятия возбуждения) в отсутствие акцептора.Другими словами, когда радиус донора и акцептора ( r ) равен расстоянию Ферстера, то эффективность переноса составляет 50 процентов. На этом радиусе разделения половина энергии возбуждения донора передается акцептору посредством резонансной передачи энергии, а другая половина рассеивается посредством комбинации всех других доступных процессов, включая излучение флуоресценции.

Концептуально критическое расстояние Фёрстера — это максимальная длина разделения между донорными и акцепторными молекулами, при которой все еще будет происходить резонансная передача энергии.Значение критического расстояния обычно находится в диапазоне от 2 до 6 нанометров, что, к счастью, порядка многих размеров молекул белка. Кроме того, диапазон критических расстояний также соответствует нескольким другим биологически значимым параметрам, таким как толщина клеточной мембраны и расстояние, разделяющее сайты на белках, имеющих несколько субъединиц. Значение R (0) (в нанометрах) можно рассчитать из следующего выражения:

R0 = 2,11 × 10-2 • [

κ

2 • J (λ) • η-4 • QD] 1/6

, в которой κ -квадрат — коэффициент, описывающий относительную ориентацию в пространстве между переходными диполями донора и акцептора, Дж (λ) — интеграл перекрытия в области излучения донора. и спектры поглощения акцептора (с длиной волны, выраженной в нанометрах), η представляет показатель преломления среды, а Q (D) представляет собой квантовый выход донора.

Эффективность передачи энергии, E (T) , является мерой доли фотонов, поглощенных донором, которые передаются акцептору, и связана с расстоянием разделения донора и акцептора, r , соотношением уравнение:

r = R0 • [(1 / ET) — 1] 1/6

и E (T) оценивается как:

ET = 1 — (τDA / τD)

, где τ (DA) — время жизни донора в присутствии акцептора, а τ (D) — время жизни донора в отсутствие акцептора.Следовательно, измеряя время жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора (что указывает на степень тушения донора из-за акцептора), можно определить расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Во многих обычно применяемых методах эффективность передачи энергии определяется путем измерения в установившемся режиме относительной средней интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствие акцептора (а не путем измерения времени жизни).

Таким образом, скорость передачи энергии зависит от степени перекрытия спектров между спектрами излучения донора и поглощения акцептора (см. Рисунок 4), квантового выхода донора, относительной ориентации дипольных моментов перехода донора и акцептора, и расстояние, разделяющее молекулы донора и акцептора. Любое событие или процесс, которые влияют на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость передачи резонансной энергии, что позволяет количественно оценить явление при условии, что артефакты можно контролировать или устранять.

На рисунке 4 представлены спектры поглощения и излучения голубого флуоресцентного белка ( CFP , донор) и красного флуоресцентного белка ( RFP или DsRed , акцептор) в сравнении с их потенциальным применением в качестве пара резонансного переноса энергии флуоресценции. Спектры поглощения обоих биологических пептидов показаны красными кривыми, а спектры испускания представлены синими кривыми. Область перекрытия спектров излучения донора и поглощения акцептора представлена ​​серой областью у основания кривых.Всякий раз, когда спектральное перекрытие молекул слишком сильно увеличивается, возникает явление, известное как спектральное просачивание или кроссовер , в котором сигнал от возбужденного акцептора (возникающий из возбуждающего освещения донора) и излучение донора обнаруживаются в акцепторный канал излучения. Результатом является высокий фоновый сигнал, который необходимо выделить из излучения слабой флуоресценции акцептора.

Основная теория безызлучательного переноса энергии напрямую применима к паре донор-акцептор, разделенной фиксированным расстоянием, и в этом случае скорость передачи энергии является функцией расстояния Ферстера, R (0) , которое в свою очередь зависит от κ -квадрат, Дж (λ) , η и Q (D) .Если эти факторы известны, можно рассчитать расстояние между донором и акцептором. Для описания таких ситуаций, как множественные акцепторные хромофоры и распределения расстояний, требуются более сложные формулировки. В таблице 1 представлена ​​серия экспериментально измеренных критических расстояний Фёрстера, которые были установлены из спектрального перекрытия нескольких популярных пар донорно-акцепторных флуорофоров. Поскольку переменная включает выход донорного кванта и степень спектрального перекрытия, оба из которых зависят от локализованных условий окружающей среды, значения расстояния Ферстера должны определяться в тех же экспериментальных условиях, что и те, которые используются для исследования резонансного переноса энергии.

Показатель преломления среды передачи энергии обычно известен из состава растворителя или может быть оценен для конкретной макромолекулы и обычно принимается равным 1,4 в водном растворе. Квантовый выход донора определяется путем сравнения со стандартными флуорофорами с известным квантовым выходом. Поскольку Q (D) появляется как шестой корень при вычислении R (0) , небольшие ошибки или неопределенности в значении Q (D) не имеют большого влияния на расчет расстояния Ферстера.Также из-за зависимости от корня шестой степени, R (0) не сильно зависит от вариаций J (λ) , но интеграл перекрытия все равно должен оцениваться для каждой пары донор-акцептор. В общем, более высокая степень перекрытия между спектром излучения донора и спектром поглощения акцептора дает более высокие значения критического расстояния Ферстера.

Критическое расстояние Фёрстера для обычных пар донор-акцептор RET

Донор	Акцептор	Расстояние Ферстера (нанометры)
Триптофан	Дансил	2.1
ИАЭДАНЫ (1)	ДДПМ (2)	2,5 — 2,9
BFP	DsRFP	3,1 — 3,3
Дансил	FITC	3,3 — 4,1
Дансил	Октадецилродамин	4.3
CFP	GFP	4.7 — 4,9
CF (3)	Техасский красный	5.1
Флуоресцеин	Тетраметилродамин	4,9 — 5,5
Cy3	Cy5	> 5,0
GFP	YFP	5,5 — 5,7
BODIPY FL (4)	BODIPY FL (4)	5.7
Родамин 6G	Малахитовый зеленый	6.1
FITC	Эозин тиосемикарбазид	6,1 — 6,4
B-фикоэритрин	Cy5	7.2
Cy5	Cy5.5	> 8,0

(1) 5- (2-иодацетиламиноэтил) аминонафталин-1-сульфоновая кислота
(2) N- (4-диметиламино-3,5-динитрофенил) малеимид
(3) сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеина
4,4-дифтор-4-бора-3a, 4a-диаза-s-индацен

Таблица 1

Неопределенность в оценке фактора ориентации ( κ -квадрат) широко обсуждалась в литературе, и, несмотря на экспериментальные доказательства того, что теория Фёрстера действительна и применима к измерению расстояний, эта переменная продолжала оставаться в силе. несколько спорным.Важно понимать, что расстояния Ферстера обычно даются для предполагаемого значения κ -квадрат, обычно это динамически усредненное значение 2/3 (0,67). Это предполагаемое значение является результатом рандомизации ориентации донора и акцептора посредством вращательной диффузии до передачи энергии. Фактор ориентации зависит от относительной ориентации в пространстве диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора и может находиться в диапазоне от нуля до 4. Значение 1 соответствует параллельным диполям перехода, а значение 4 соответствует диполям, которые оба являются параллельные и коллинеарные.

Из-за связи корня шестой степени с расстоянием Ферстера, изменение коэффициента ориентации от 1 до 4 приводит только к 26-процентному изменению рассчитанного расстояния, а максимальная погрешность в 35 процентов возможна, когда обычно принимаемое значение 0,67 применяется. Наиболее серьезная потенциальная ошибка возникает, если диполи ориентированы точно перпендикулярно друг другу и соответствующее значение в квадрате κ становится равным нулю. Было использовано несколько методов работы с неопределенностью, включая предположение, что существует ряд статических ориентаций, которые не изменяются в течение времени жизни флуорофора в возбужденном состоянии.Измерения анизотропии флуоресценции для донора и акцептора могут позволить определить пределы для κ -квадратичной вариации. Кроме того, использование флуорофоров с низкой поляризацией флуоресценции (из-за излучения нескольких перекрывающихся переходов) снижает неопределенность фактора ориентации. Ограничение возможных значений κ -квадрат таким образом снижает потенциальную ошибку вычисления расстояния до 10 процентов.

Во многих случаях фактор ориентации трудно, а то и невозможно определить, а точное значение переменной часто рассматривается как непреодолимая проблема.Однако некоторые свидетельства указывают на ограничение важности фактора в расчетах резонансного переноса энергии. Сравнение донорных и акцепторных расстояний с использованием методов резонансной спектроскопии переноса энергии и дифракции рентгеновских лучей в значительной степени подтверждает обоснованность принятия значения 0,67 для фактора (как предложено теорией Фёрстера), по крайней мере, для небольших пептидов и белков. Большая неопределенность существует для более крупных белков. Использование этого значения для фактора ориентации допустимо при предположении, что зонды донора и акцептора могут свободно совершать неограниченное изотропное движение.Дальнейшее обоснование получено из экспериментальных доказательств того, что для флуорофоров, прикрепленных одинарной или двойной связью к макромолекулам, сегментарные движения донора и акцептора имеют тенденцию приводить к динамически рандомизированным ориентациям.

Для слабосвязанных флуорохромов свободное вращательное движение вокруг одинарных связей должно позволить использовать среднее значение ориентации, но неограниченное движение молекул, связанных через несколько сайтов связывания, вероятно, не происходит. С другой стороны, крайние значения нуля и 4 для κ -квадрат требуют полной поляризации флуоресценции донора и акцептора, а это условие маловероятно.Статистические расчеты были представлены некоторыми исследователями, которые утверждают, что расстояния распределения донор-акцептор и их ориентация определяют наблюдаемое среднее расстояние. При условии, что наблюдается некоторое распределение наблюдаемого расстояния (и это не ограничивается слишком близким расположением донора и акцептора относительно R (0) ), можно надежно получить среднее расстояние между флуорофорами и оценить погрешность из-за фактора ориентации. .

Зависимость фактора ориентации ( κ -квадрат) от относительной ориентации диполя излучения донора и диполя поглощения акцептора (показано на рисунке 5) дается уравнением:

κ

2 = (cos θT — 3cos θDcos θA) 2 = (sin θD sin θAcos Φ — 2cos θDcos θA) 2

, где θ (T) — угол между диполем перехода излучения донора и диполем перехода поглощения акцептор, θ (D) и θ (A) — это углы между этими диполями и вектором, соединяющим донор и акцептор, а Φ — угол между плоскостями, содержащими два переходных диполя.

Эффективность передачи энергии наиболее чувствительна к изменениям расстояния, когда расстояние между донорами и акцепторами приближается к расстоянию Ферстера ( R (0) ) для двух молекул. Рисунок 6 иллюстрирует экспоненциальную зависимость между эффективностью переноса и расстоянием, разделяющим донор и акцептор. Эффективность быстро увеличивается до 100 процентов, когда расстояние разделения уменьшается ниже R (0) , и, наоборот, уменьшается до нуля, когда r больше, чем R (0) .Из-за сильной (шестой степени) зависимости эффективности переноса от расстояния измерения расстояния разделения донор-акцептор надежны только в том случае, если радиус донора и акцептора находится в пределах расстояния Ферстера в два раза. Когда r составляет приблизительно 50 процентов от R (0) , эффективность резонансной передачи энергии близка к максимальной, и более короткие расстояния не могут быть надежно определены. Когда расстояние донор-акцептор превышает значение R (0) на 50 процентов, наклон кривой настолько пологий, что более длинные разделительные расстояния не разрешаются.

Практическое значение критического расстояния Ферстера состоит в том, что это значение дает представление о диапазоне расстояний разделения, которые могут быть определены FRET для данной пары датчиков (см. Таблицу 1). Поскольку измерение передачи энергии очень чувствительно к изменению расстояния, когда расстояния донор-акцептор близки к расстоянию Ферстера, приблизительные размеры целевого молекулярного взаимодействия являются наиболее важным фактором при выборе пары флуоресцентных красителей.Другие факторы, которые следует учитывать, в зависимости от того, проводятся ли измерения в установившемся режиме или с временным разрешением, включают химическую стабильность, квантовый выход и время жизни флуорофора. Поскольку для обычных методов флуоресцентного резонансного переноса энергии не существует внутреннего эталона расстояния, расстояния, рассчитанные путем измерения эффективности переноса, относятся к расстоянию Ферстера, которое выводится из спектроскопических данных, измеренных на парах донор-акцептор.

Явление резонансной передачи энергии с помощью механизма Ферстера сложно в некоторых аспектах, но простое и надежное по своему результату.Расстояния Ферстера точно предсказываются из спектральных свойств донора и акцептора, и, поскольку никаких исключений из теории еще не выявлено, можно предположить, что резонансный перенос энергии происходит при любых условиях, при которых пара молекулы донор-акцептор находится в непосредственной близости. Сложность теории, описывающей перенос диполя, возникает не из-за самого механизма передачи, а из-за наличия распределений расстояний (включая неслучайные распределения) и диффузии молекул донора и акцептора.Когда предпринимаются шаги для усреднения зависимости передачи энергии от расстояния по диапазону геометрий и временных рамок, FRET представляет собой надежный метод исследования пространственного распределения между взаимодействующими молекулами.

Применение методов FRET в оптической микроскопии

Параметры конфигурации микроскопа для исследований флуоресцентного резонансного переноса энергии меняются в зависимости от требований флуорофоров, образца и режима (-ов) визуализации, но практически любой вертикальный или инвертированный микроскоп можно модернизировать для FRET-микроскопия (см. Рисунок 7).В общем, микроскоп должен быть оборудован охлаждаемой и усиленной системой CCD-камеры с высоким разрешением (12 бит), соединенной с качественными интерференционными фильтрами, имеющими низкие уровни перекрестных помех (минимальный уровень блокировки) и полосы пропускания, соответствующие спектрам флуорофора. Чувствительность детектора определяет, насколько узкой может быть полоса пропускания фильтра, при этом сбор данных может продолжаться с приемлемой скоростью с минимальным спектральным сквозным шумом. В большинстве случаев для получения изображений следует использовать одно дихроматическое зеркало, соединенное с колесами или ползунками фильтров возбуждения и излучения, чтобы минимизировать или исключить сдвиги изображения.

Широкопольная флуоресцентная микроскопия страдает от излучения флуорофора, возникающего выше и ниже фокальной плоскости, что дает изображения со значительным расфокусированным сигналом, который снижает контраст и приводит к ухудшению качества изображения. Эта проблема усугубляется в микроскопии FRET из-за изначально низких уровней сигнала, возникающих в результате резонансной передачи энергии. Методы цифровой деконволюции могут быть связаны с оптическим секционированием, чтобы уменьшить или исключить сигналы вдали от фокальной плоскости, но этот процесс требует больших вычислительных ресурсов и может быть недостаточно быстрым для многих экспериментов по динамической визуализации FRET.Конфокальные методы лазерного сканирования могут применяться к FRET-микроскопии для значительного улучшения латерального разрешения, позволяя собирать последовательные оптические срезы с интервалами, приближающимися к реальному времени. Основным недостатком конфокальной микроскопии является ограничение длин волн возбуждения стандартными лазерными линиями, доступными для конкретной системы, что ограничивает выбор пар доноров и акцепторов флуорофора в экспериментах по резонансному переносу энергии. Многофотонное возбуждение также может использоваться в сочетании с методами FRET и меньше повреждает клетки из-за задействованных более длинных волн возбуждения.Кроме того, артефакты автофлуоресценции и фотообесцвечивание образца с меньшей вероятностью возникают в ограниченном объеме возбуждения, характерном для многофотонного возбуждения.

Типичная конфигурация микроскопа, способная наблюдать живые клетки в культуре с несколькими мотивами изображения флуоресцентного резонансного переноса энергии, представлена ​​на рисунке 7. Инвертированный микроскоп для культуры тканей оснащен стандартной вольфрам-галогенной лампой на столбе для исследования и записи. ячейки, использующие стандартное освещение светлого поля, фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста ( DIC ).Обратите внимание, что последние два метода усиления контраста можно использовать в сочетании с флуоресценцией, чтобы выявить пространственное расположение флуорофоров в клеточной архитектуре. К тринокулярной головке микроскопа крепится стандартная система CCD-камеры с охлаждением Пельтье, обеспечивающая широкополосную флуоресценцию и получение изображений в светлом поле.

Эксперименты по резонансной передаче энергии проводятся с использованием мультиспектрального излучения с использованием либо широкопольного освещения (дуговая разрядная лампа), либо конфокальной сканирующей приставки в реальном времени, оснащенной высокоскоростной дисковой системой Нипкова.Луч аргонно-криптонового лазера сначала фильтруется через акустооптическое устройство с перестраиваемой длиной волны для выбора конкретных длин волн возбуждения перед прохождением к конфокальной сканирующей головке. Изображения собираются с помощью двух охлаждаемых ПЗС-камер высокого разрешения Gen III с усиленным охлаждением, считывающих отдельные каналы и загружаемых в главный компьютер. Сканирование образца в боковой ( x и y ) и осевой ( z ) плоскостях позволяет собирать оптические срезы для восстановления трехмерного изображения.Различные программы обработки изображений совместимы с проиллюстрированной конфигурацией микроскопа.

Основываясь на фундаментальных принципах этого явления, при проведении измерений резонансного переноса энергии флуоресценции с помощью оптического микроскопа следует учитывать ряд важных практических моментов:

• Необходимо тщательно контролировать концентрации донорных и акцепторных флуорофоров. Статистически самая высокая вероятность достижения резонансного переноса энергии флуоресценции происходит, когда несколько акцепторных молекул окружают одну донорную молекулу.
• Фотообесцвечивание необходимо устранить, поскольку артефакт может изменить молекулярное соотношение донора и акцептора и, следовательно, измеренное значение процесса резонансной передачи энергии.
• Спектр излучения донорной флуоресценции и спектр поглощения акцептора должны иметь значительную область перекрытия.
• Прямое возбуждение акцептора в диапазоне длин волн, используемом для возбуждения донора, должно быть минимальным. Распространенным источником ошибок в измерениях с помощью FRET-микроскопии в установившемся режиме является обнаружение донорной эмиссии с помощью наборов акцепторных фильтров.
• Длины волн излучения как донора, так и акцептора должны совпадать с максимальным диапазоном чувствительности детектора.
• Спектры поглощения и излучения донора должны иметь минимальное перекрытие, чтобы уменьшить возможность самопереноса от донора к донору.
• Донорная молекула должна быть флуоресцентной и иметь достаточно длительное время жизни, чтобы произошла резонансная передача энергии.
• Донор должен обладать низкой поляризационной анизотропией, чтобы минимизировать неопределенности в значении фактора ориентации (-квадрат).Этому требованию удовлетворяют доноры, испускание которых происходит в результате нескольких перекрывающихся переходов возбуждения.
• При использовании методов маркировки антител не следует изменять биологическую активность реагентов, конъюгированных с донорными и акцепторными флуорохромами. Любое снижение активности серьезно повлияет на достоверность результирующих измерений резонансного переноса энергии.
• Поскольку флуоресцентный резонансный перенос энергии требует, чтобы молекулы донора и акцептора имели соответствующее дипольное выравнивание и располагались в пределах 10 нанометров друг от друга, необходимо учитывать третичную структуру реагентов, к которым присоединены молекулы.Например, когда донорно-акцепторные молекулы могут быть прикреплены к различным структурным местоположениям (таким как карбокси или аминоконце) на белке, возможно, что FRET не будет наблюдаться, даже если белки действительно взаимодействуют, потому что молекулы донора и акцептора расположены на противоположных концах взаимодействующих молекул.
• Живые клетки, помеченные зелеными флуоресцентными мутантами белка для исследований FRET, должны быть проанализированы с использованием традиционных иммуногистохимических методов, чтобы убедиться, что меченый белок принимает ту же внутриклеточную среду обитания и свойства, что и нативный аналог.

Для того, чтобы явление флуоресцентного резонансного переноса энергии предоставляло значимые данные в качестве инструмента в оптической микроскопии, необходимо оптимизировать как подготовку образца, так и параметры визуализации. Выбор подходящих донорных и акцепторных зондов и способа их использования в качестве молекулярных меток является серьезной проблемой. Кроме того, как только стратегия маркировки, которая разрешает передачу энергии, была разъяснена, для выполнения самого измерения можно использовать широкий спектр методов.Большинство количественных исследований флуоресцентной микроскопии проводится путем измерения интенсивности флуоресцентного излучения. Детектирование FRET на основе интенсивности флуоресценции обычно достигается путем отслеживания изменений относительных величин интенсивности излучения на двух длинах волн, соответствующих донорному и акцепторному хромофорам. Когда условия подходят для возникновения резонансного переноса энергии флуоресценции, увеличение эмиссии акцептора ( I (A) ) сопровождается одновременным уменьшением интенсивности эмиссии донора ( I (D) ).

Хотя изменение относительной интенсивности излучения донора или акцептора может рассматриваться как показатель резонансного переноса энергии, обычный подход заключается в использовании отношения двух значений, I (A) / I (D) , как мера FRET. Величина отношения зависит от среднего расстояния между парами донор-акцептор и нечувствительна к различиям в длине пути и объеме, доступном для возбуждающего светового луча. Любое состояние образца, которое вызывает изменение относительного расстояния между парами молекул, приводит к изменению соотношения испускания донора и акцептора.Следовательно, FRET можно наблюдать в микроскопе путем преимущественного возбуждения донорного флуорофора и обнаружения повышенного излучения взаимодействующего акцепторного флуорофора, сопровождаемого уменьшением флуоресценции донора, вызванным гашением из-за передачи энергии. Измерение FRET с использованием подхода мониторинга интенсивности называется стационарным, флуоресцентным резонансным переносом энергии.

Подходящие донорные и акцепторные зонды выбираются на основе их спектральных характеристик поглощения и излучения.Для максимальной резонансной передачи энергии спектр излучения донора должен существенно перекрывать спектр поглощения акцептора. Кроме того, должно быть минимальное прямое возбуждение акцепторного флуорофора в максимуме возбуждения донора, и не должно быть значительного перекрытия эмиссии между донором и акцептором в области длин волн, в которой происходит эмиссия акцептора. На практике может быть сложно идентифицировать пары донор-акцептор, удовлетворяющие этим требованиям.Ситуация часто осложняется тем фактом, что имеющиеся в продаже наборы флуоресцентных фильтров не полностью эффективны при пропускании только желаемых длин волн, и может передаваться небольшой процент света за пределами проектной полосы пропускания. Если не используются очень хорошо охарактеризованные и контролируемые системы экспрессии, может быть трудно определить точную концентрацию донорных и акцепторных флуорофоров. Дополнительные корректировки могут также потребоваться для автофлуоресценции, фотообесцвечивания и фоновой флуоресценции.

Типичное исследование внутриклеточной белковой ассоциации в живой культуре клеток проиллюстрировано на рисунке 8 для событий, связанных с апоптозом, физическим процессом гибели клеток, возникающим в результате сложного каскада последовательных взаимодействий. Генные продукты, непосредственно участвующие в цепочке событий, могут быть помечены слиянием с соответствующими членами семейства флуоресцентных белков (в данном случае BFP и GFP) для совместной экспрессии в одной и той же клетке, чтобы исследовать специфические ассоциации с помощью FRET.Белки, участвующие в апоптозе, взаимодействуют внутри митохондрий и демонстрируют постепенное уменьшение связывания по мере того, как происходит запрограммированная гибель клеток. Таким образом, изображение эмиссии донора (рисунок 8 (a)) содержит только флуоресценцию от белков, меченных BFP, в то время как соответствующий профиль эмиссии акцептора (рисунок 9 (b)) иллюстрирует сигналы, обусловленные белками, меченными GFP (и некоторый вклад от белков, меченных GFP). донорская эмиссия). Фильтр FRET (рис. 8 (c)), как описано ниже, выявляет флуоресценцию, полученную в результате резонансного переноса энергии между двумя белками

Среди факторов, которые потенциально могут повлиять на точность измерений резонансного переноса энергии флуоресценции в целом, некоторые из них очень специфичны. к оптическому микроскопу.Основной целью микроскопических исследований является получение изображений с высоким разрешением, и это требует особого внимания к качеству и характеристикам оптических фильтров, используемых для спектрального различения длин волн поглощения и излучения донора и акцептора. Чтобы максимизировать отношение сигнал / шум (без вредного воздействия на образец или исследуемый процесс), необходимо тщательно сбалансировать интенсивность и время воздействия возбуждающего света с концентрацией донорных и акцепторных флуорофоров и детектора. эффективность.Если концентрация донорно-акцепторных флуорофоров чрезмерна, может произойти самотушение, влияющее на точность измерений FRET. Фотообесцвечивание является проблемой всех флуорофоров и может влиять на соотношение донор-акцептор, изменяя измерения флуоресценции. Избыточная интенсивность освещения также может повредить образцы, особенно содержащие живые клетки или ткани.

Метод, известный как донорский фотообесцвечивающий резонансный перенос энергии флуоресценции ( pbFRET ), который использует процесс фотообесцвечивания для измерения FRET, часто применяется при исследовании фиксированных образцов.Основанный на попиксельном анализе, этот метод был применен для измерения отношений близости между белками клеточной поверхности, меченными моноклональными антителами, конъюгированными с флуорофором. Фотообесцвечивание FRET основано на теории, согласно которой флуорофор чувствителен к фотоповреждению только тогда, когда он находится в возбужденном состоянии. Статистически только небольшая часть молекул находится в возбужденном состоянии в любой момент времени, и поэтому флуорофоры с более длительным временем жизни флуоресценции имеют более высокую вероятность фотоповреждения и демонстрируют более высокую скорость фотообесцвечивания.

Экспериментальные доказательства, подтверждающие эту концепцию, продемонстрировали, что время фотообесцвечивания флуорофора обратно пропорционально времени его жизни в возбужденном состоянии. Возникновение резонансной передачи энергии снижает время жизни флуоресценции молекулы донора, эффективно защищая ее от фотообесцвечивания. Расчеты pbFRET основаны на уменьшении скорости фотообесцвечивания донора по сравнению с измеренной для донора в отсутствие резонансной передачи энергии. Измерение фотообесцвечивания в исследованиях FRET требует относительно длительного периода времени и, следовательно, наиболее применимо к образцам фиксированных клеток, в которых временные данные не важны, а влияние фотообесцвечивания на функцию клеток не является проблемой.В некоторых отношениях методика фотообесцвечивания доноров менее сложна, чем измерение сенсибилизированного излучения, хотя подгонка постоянных времени к кривым фотообесцвечивания, включающим несколько компонентов, представляет некоторые дополнительные трудности.

Эффективность передачи энергии также может быть определена с помощью методов фотообесцвечивания акцептора , в которых изменение в тушении испускания донора измеряется путем сравнения значения до и после селективного фотообесцвечивания молекулы акцептора.Анализ изменения интенсивности флуоресценции донора в одних и тех же областях образца до и после удаления акцептора имеет то преимущество, что требует подготовки только одного образца, и напрямую связывает эффективность передачи энергии с флуоресценцией как донора, так и акцептора.

Точное измерение резонансного переноса энергии флуоресценции в микроскопе требует компенсации всех потенциальных источников ошибок. Был разработан простой метод корректировки обнаружения донорной флуоресценции с помощью фильтра эмиссии акцептора и флуоресценции акцептора с фильтром эмиссии донора (из-за кроссовера или спектрального просвечивания).Метод также корректирует зависимость FRET от концентраций донорных и акцепторных флуорофоров. Стратегия измерения, которая требует минимум спектральной информации, использует комбинацию из трех наборов фильтров и может быть легко реализована. Наборы фильтров донора, FRET и акцептора предназначены для выделения и максимизации трех конкретных сигналов: флуоресценции донора, флуоресценции акцептора, относящейся к FRET, и флуоресценции непосредственно возбужденного акцептора, соответственно. На практике три разных образца, содержащие только донор, только акцептор, и донор, и акцептор, исследуются с каждым из трех наборов фильтров, и полученные данные обрабатываются арифметически для корректировки кроссовера и неконтролируемых изменений концентраций донор-акцептор.

На Рисунке 9 представлены схематические иллюстрации кроссовера (спектральное просачивание) и перекрестных помех фильтра, двух важных проблем, которые необходимо преодолеть, чтобы получить количественные результаты в экспериментах по флуоресцентному резонансному переносу энергии. Кроссовер или просачивание проявляется в перекрытии спектра излучения донорной флуоресценции с полосой пропускания интерференционного фильтра эмиссии акцептора на рисунке 9, в результате чего сигнал эмиссии донора (нежелательные длины волн) проходит через эмиссионный фильтр.Напротив, перекрестные помехи фильтра описывают минимальный уровень затухания (блокировки) в определенном диапазоне двух фильтров, установленных вместе последовательно, и вызывают беспокойство при согласовании фильтров возбуждения и излучения для наборов флуоресценции. Дихроматические зеркала часто включают в оценку перекрестных помех комбинаций флуоресцентных фильтров. Хотя два эмиссионных фильтра редко устанавливаются на световом пути одновременно, спектры объединены на рисунке 9, чтобы одновременно проиллюстрировать обе концепции.Обратите внимание, что два спектра фильтра (синяя и красная кривые) представляют коэффициент пропускания света интерференционными фильтрами, тогда как кривая испускания донора (зеленая) представляет собой график зависимости интенсивности от длины волны.

Дополнительные факторы, которые потенциально могут привести к значительным ошибкам, также требуют исправления при использовании методов измерения FRET в установившемся режиме. Кроме того, желателен тщательный контроль концентрации донорного и акцепторного флуорофора. Определения концентрации флуорофора можно частично избежать за счет применения измерений флуоресценции с временным разрешением, которые обеспечивают метод получения среднего времени жизни без точного знания концентраций доноров.Метод позволяет количественно определять расстояние разделения донор-акцептор и основан на измерениях времени жизни донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Измерение спада интенсивности флуоресценции как функции времени проясняет динамику излучения молекулы в возбужденном состоянии, и, следовательно, может быть получена более подробная информация о природе донорно-акцепторного взаимодействия. Графические графики спада интенсивности иллюстрируют усредненные по времени детали процесса затухания флуоресценции (см. Рисунок 10 (а)), которые не разрешаются при использовании методов устойчивого состояния.Измерения, показывающие одно и то же значение для среднего времени жизни, когда регистрируется как интенсивность в установившемся режиме, нормированная на поглощение, могут соответствовать существенно разным формам кривых затухания на графиках данных с временным разрешением, указывая на различия в участвующих межмолекулярных процессах.

Время жизни флуоресценции ( τ ) флуорофора — это характерное время, в течение которого молекула находится в возбужденном состоянии перед возвращением в основное состояние. Представляя затухание флуоресценции в упрощенной единственной экспоненциальной форме после короткого импульса возбуждающего света, интенсивность флуоресценции как функция времени ( t ) задается уравнением:

I (t) = I0 exp (-t / τ )

, где I (0) — начальная интенсивность излучения флуоресценции сразу после импульса возбуждающего света, а I (t) — интенсивность флуоресценции, измеренная в момент времени t .Время жизни флуоресценции ( τ ) определяется как время, необходимое для уменьшения интенсивности до 1 / e от ее начального значения (приблизительно 37 процентов от I (0) ; Рисунок 10 (a)), и составляет величина, обратная константе скорости затухания флуоресценции из возбужденного состояния в основное.

Основным общим преимуществом измерений FRET с временным разрешением по сравнению с установившимся режимом является то, что расстояние разделения донор-акцептор может быть нанесено на карту с большей количественной точностью.Частично это происходит из-за того, что время жизни флуоресценции не зависит от локальной интенсивности или концентрации и в значительной степени не зависит от фотообесцвечивания флуорофоров. Однако времена жизни флуоресценции очень чувствительны к среде флуорофора, и даже молекулы со сходными спектрами могут проявлять разные времена жизни в разных условиях окружающей среды. Поскольку рассеяние не влияет на время жизни флуорофора, измерения изменения времени жизни могут предоставить информацию, которая конкретно связана с локальными молекулярными процессами.

Срок службы флуорофора может изменяться множеством переменных в локальном микроокружении, включая такие факторы, как гидрофобность, концентрация кислорода, ионная сила других компонентов среды, связывание с макромолекулами и близость к молекулам акцептора, которые могут истощать возбужденное состояние. состояние за счет резонансной передачи энергии. Значительным практическим преимуществом является то, что измерения времени жизни могут служить абсолютными индикаторами молекулярных взаимодействий и не зависят от концентрации флуорофора.

Два общих метода, обычно используемых для измерения времени жизни флуоресцентных ламп, классифицируются как во временной области ( импульсный , см. Рисунок 10 (a)) и в частотной области (также называемый с фазовым разрешением ; рисунок 10 (б)) методы. При измерении срока службы во временной области используются источники света с импульсным возбуждением, а время жизни флуоресценции определяется путем прямого измерения сигнала излучения или регистрации с помощью счета фотонов. Подход в частотной области использует синусоидальную модуляцию источника возбуждающего света (полученную из импульсных или модулированных лазерных систем), а время жизни определяется по фазовому сдвигу и глубине демодуляции сигнала флуоресцентного излучения.Каждый из этих подходов к визуализации времени жизни флуоресценции имеет определенные преимущества и недостатки, и оба широко применяются в традиционной широкопольной, конфокальной и многофотонной микроскопии.

На рисунке 10 показаны схематические диаграммы, представляющие методы временной и частотной области для определения времени жизни флуоресценции. В подходе во временной области (рис. 10 (а)) образец возбуждается коротким импульсом лазерного света, длительность которого намного короче, чем время жизни возбужденных частиц, и измеряется экспоненциальный профиль затухания как функция времени.Затухание флуоресценции обычно является моноэкспоненциальной функцией для одного флуорофора, но может иметь гораздо более сложный характер, если возбужденное состояние имеет многочисленные пути релаксации, доступные в окружающей среде. Синусоидально модулированный свет от лазера непрерывного действия, соединенного с акустооптическим модулятором, используется для возбуждения флуорофора в экспериментах в частотной области (рис. 10 (b)). Результирующее флуоресцентное излучение модулируется синусоидально на той же частоте, что и возбуждение, но сопровождается фазовым сдвигом и уменьшением глубины модуляции.В случае однократного экспоненциального затухания время жизни флуоресценции можно рассчитать, определив либо степень фазового сдвига ( φ ), либо коэффициент модуляции ( M ), используя уравнения, представленные на рисунке 10 (b). Если два значения идентичны, затухание флуоресценции действительно состоит из одной экспоненциальной функции. Когда присутствует более одного флуоресцентного вещества (или один флуорофор находится в сложной среде), фазовый сдвиг и время жизни модуляции следует оценивать в широком диапазоне частот.

Метод измерения времени жизни флуоресценции во временной области в основном основан на подсчете одиночных фотонов и требует системы детектирования с достаточным временным разрешением для сбора почти 100 процентов фотонов, генерируемых каждым импульсом возбуждения. Хотя методы с фазовым разрешением относительно менее требовательны в исполнении, они, как правило, не так чувствительны, как метод подсчета фотонов. Когда фазовая модуляция используется для разрешения сложных времен жизни мультифлуорофоров, длительное время воздействия повреждающего возбуждающего освещения может оказаться чрезмерным для некоторых образцов, а также может не обеспечить достаточного временного разрешения для процессов с живыми клетками.Предпочтительный метод зависит как от информации, необходимой для исследования, так и от типа исследуемого образца.

Измерения времени жизни флуоресценции оказались чувствительным индикатором FRET и имеют особые преимущества при исследованиях живых клеток из-за независимости измерений времени жизни от таких факторов, как концентрация и длина светового пути, которые трудно контролировать в живых образцах. Основное преимущество выполнения FRET-исследований путем измерения времени жизни флуоресценции заключается в том, что можно различать перенос энергии даже между донорно-акцепторными парами с аналогичными спектрами излучения.Когда время жизни флуоресценции измеряется напрямую (в отличие от использования значений в установившемся состоянии), определение FRET возможно без фотодеструкции донорных или акцепторных флуорофоров. Поскольку FRET уменьшает время жизни флуоресценции донорной молекулы за счет передачи энергии акцептору, прямое сравнение времени жизни донора в присутствии акцептора ( τ (DA) ) с временем жизни в отсутствие акцептора ( τ ( D) ), позволяет вычислять значение эффективности FRET ( E (T) ) для каждого пикселя изображения.

В зависимости от метода измерения времени жизни флуоресценции требуют, чтобы образец подвергался воздействию либо высокочастотных повторяющихся импульсов возбуждающего света, либо непрерывного синусоидально модулированного света. В исследованиях с живыми клетками всегда необходимо оценивать эффект интенсивного освещения. Независимо от метода, эталонное время жизни донора без акцептора должно быть определено в экспериментальных условиях, идентичных условиям измерения донор-акцептор.Одним из способов достижения этого с одним образцом является измерение времени жизни только донора после фотообесцвечивания акцептора после эксперимента по передаче энергии.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными применениями флуоресцентного резонансного переноса энергии являются измерение расстояний между двумя участками макромолекулы (обычно белка или нуклеиновой кислоты) или исследование взаимодействия in vivo между биомолекулярными объектами.Белки могут быть помечены синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, которые служат донором и акцептором, но достижения в генетике флуоресцентных белков теперь позволяют исследователям маркировать определенные целевые белки с помощью множества биологических флуорофоров, имеющих разные спектральные характеристики. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донорного флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних зондов, выступающих в качестве акцептора.

Если макромолекулы помечены одним донором и акцептором, и расстояние между двумя флуорохромами не изменяется в течение времени жизни возбужденного состояния донора, то расстояние между зондами может быть определено по эффективности передачи энергии в установившемся состоянии. измерения, как описано выше.В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения, например, белковые сборки, мембраны, одноцепочечные нуклеиновые кислоты или развернутые белки (см. Сценарии, представленные на рисунке 11), FRET все еще можно использовать для изучения явлений, но предпочтительны измерения срока службы с временным разрешением. Некоторые биологические применения, которые попадают в оба случая, показаны на рисунке 11, включая конформационные изменения, диссоциацию или гидролиз, слияние мембраноподобных липидных везикул и взаимодействия лиганд-рецептор.

Хотя для измерения резонансного переноса энергии флуоресценции в оптическом микроскопе доступны различные методы, ни один из них не лишен недостатков. Некоторые методы требуют более сложных и дорогостоящих инструментов, в то время как другие основаны на предположениях, которые необходимо тщательно проверять. Некоторые подходы подходят для фиксированных образцов, но не могут применяться к системам живых клеток, в то время как другие методы должны включать значительные корректирующие вычисления или алгоритмы анализа данных.Однако несомненно, что анализ FRET показывает большие перспективы для дальнейшего развития полезности и объема биологических приложений. В последние годы произошли драматические улучшения в инструментарии, особенно в том, что касается методов с временным разрешением.

Измерения времени жизни флуоресценции, которые раньше выполнялись крайне сложно, теперь поддерживаются зрелыми пикосекундными и наносекундными технологиями. Успехи в разработке флуоресцентных зондов позволили получить более мелкие и более стабильные молекулы с новыми механизмами прикрепления к биологическим мишеням.Были также разработаны флуорофоры с широким диапазоном времени жизни в собственном возбужденном состоянии, и значительные усилия прилагаются к развитию большего разнообразия генетических вариаций флуоресцентных белков. Совершенно новые классы флуоресцентных материалов, многие из которых меньше, чем предыдущие флуорофоры, и позволяют оценивать молекулярные взаимодействия на меньших расстояниях разделения, обещают повысить универсальность мечения и привести к новым применениям метода FRET.

Соавторы

Брайан Херман и Виктория Э.Centonze Frohlich — Департамент клеточной и структурной биологии, Центр медицинских наук Техасского университета, 7703 Floyd Curl Drive, Сан-Антонио, Техас 78229.

Joseph R. Lakowicz — Центр флуоресцентной спектроскопии, Департамент биохимии и молекулярной биологии, Университет Мэриленда и Институт биотехнологии Университета Мэриленда (UMBI), 725 West Lombard Street, Baltimore, Maryland 21201.

Thomas J. Fellers и Michael W.Дэвидсон — Национальная лаборатория сильных магнитных полей, 1800 Ист. Пол Дирак, доктор, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида, 32310.

Добро пожаловать в центр аналитической визуализации в AECOM

Услуги:

Transmission Electron Микроскопия

JEOL 1200EX Этот инструмент предлагает наивысшие базовые характеристики, такие как 120 kv просвечивающий электронный микроскоп, использующий уникальную 3-ступенчатую 6-линзовую визуализацию система.Он предлагает простоту в эксплуатации, отличное качество изображения и высокое разрешение при от малого до большого увеличения. Он оборудован гониометрическим столиком с боковым входом, минимальная доза облучения. система, нижняя видеокамера высокого разрешения Gatan и широкоугольная боковая установка Видеокамера Gatan.

JEOL 100CXII Этот высокий Производительность Просвечивающий электронный микроскоп 100 кВ оснащен электронной пушкой с холодным лучом, высокая контрастность изображения, высокоскоростная каскадная дифференциальная эвакуация, оптимальная система недостаточной фокусировки с использованием воблера изображения и гониометра с боковым входом.

Крио трансмиссионная электронная микроскопия одиночных молекул изображения.
Колледж, HHMI и NIH (посредством присужденного гранта на совместное оборудование) имеют поддержал создание полной программы Cryo EM. Технология охватывает все разрешение диапазон от электронной микроскопии до рентгеновской кристаллографии и позволяет получать изображения отдельных молекулы в их гидратированном состоянии. Пожалуйста, прочтите больше о технологии.

Сканирующая электронная микроскопия

JEOL 6400 Этот высокий Производительность Сканирующий электронный микроскоп работает с ускоряющим напряжением от 0 до 100 Гц.2 кв в 35 кВ с использованием нити накала LaB6 высокой яркости. Это предлагает полноценную работу с клавиатурой, хранилище кадров с цифровой обработкой изображений и цифровое изображение захват на ПК с программным обеспечением analySIS.

Подготовка образца к электронной микроскопии

Персонал АиФ предлагает полный образец услуг подготовка ко многим стандартным и современным методам ЭМ. К ним относятся:

• Заливка с использованием эпоксидной смолы или акрила. смолы при температуре окружающей среды или низких температурах.
• Тонкое сечение с помощью Reichert Ultracut E или Ультрамикротом Leica UCT.
• Отрицательное окрашивание.
• Freeze Fracture с использованием Cressington CFE-50 Блок замораживания травления.
• Маркировка Immunogold после до или после встраивание протоколов.
• Сушка до критической точки с Tousimis Samdri 790 Critical Point Dryer и Sputter Coating с использованием Denton Sputter Coater для подготовка клеток и тканей для визуализации SEM.
• Криоультрамикротомия использование криоультрамикротома Leica UCT для оптимизации доступности эпитопов и морфологической сохранности иммунного золота маркировка.
• Slam Freeze Криофиксация с использованием морозильника Life Cell CF100 Slam Freezer, за которым может следовать High Разрешение Rotary Shadowing в Cressington CFE-50, оснащенном электронно-лучевыми пушками для испарение платины или вольфрама-тантала.Slam Freezing с последующим ротационным затенением — это мощный метод для получения изображений клеток или макромолекул с высоким разрешением в 3-D, замороженные в гидратированном состоянии.
• Slam Freeze Cryofixation с использованием Life Cell CF100 Slam Freezer, за которым следует Freeze Substitution и Низкотемпературная заливка в установке замены замораживания Bal Tec FSU-010. Замораживание замены — альтернатива метод оптимизации сохранения эпитопа для мечения иммунозолота.

фотографический Документация для электронной микроскопии
AIF предлагает фотографические услуги для получения высококачественных электронных микрофотографий на обычной фотобумаге или высокой сканирование с разрешением и прямая цифровая печать для плакатов, лекций, веб-сайтов и журналов публикация.

Порядок световая микроскопия
Zeiss AxioSkop II с оптикой для светлого поля, темного поля (через конденсатор или через истинное наклонное освещение), фазовый контраст, Номарски, поляризованный свет и эпифлуоресценция с 2.Объективы от 25X до 100X служат в качестве «обычного» микроскопа. Изображения записываются с помощью цветной камеры Zeiss AxioCam.
Чтобы удовлетворить растущий спрос на визуализацию живого материала, особенно eGFP или других флуоресцентно меченные клетки или клетки в чашках для культивирования, AIF имеет инвертированный Olympus микроскопы с широким спектром оптических и фотографических опций. На другом перевернутом системы в AIF исследователи продолжают использовать технологию оцифровки видео для визуализации подвижные клетки в фазовом контрасте.

Стереодиссекция Микроскоп
Изображение с меньшим увеличением достигнуто с помощью Zeiss SV11 («ИМпST) с цифровой камерой Retiga 1300, оптической настраиваемый фильтр для получения цветных изображений и IP Lab для захвата изображений. Отраженный свет проходящий свет обеспечивается либо кольцевым осветителем, либо двухточечным освещением. снабжен плавно регулируемым ползунком 100% пропускания до темного поля и Эпи-освещение для флуоресценции обеспечивает ртутная дуговая лампа с фильтрами для dapi, CFP, GFP, YFP или родамин / RFP.[Более информация и инструкции.]

BioRad Сияние 2000 Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп
Тонкие оптические секции с гораздо более высоким разрешением, чем нормальная эпифлуоресценция может быть получена из живых или фиксированных культивируемых клеток, срезов вибратома или интактной ткани с совместная локализация до трех разных флуоресцентные зонды и один отражающий зонд. Собранные изображения можно реконструировать в 3D, улучшить или проанализировать с помощью разнообразие техник.Данные могут быть легко перенесены на другие платформы для анализа или для финальная презентация. [Инструкция по эксплуатации.]

Leica SP2 AOBS Лазерное сканирование Конфокальный микроскоп
Истинное спектральное изображение с тонкими оптическими срезами гораздо более высокое разрешение, чем обычная эпифлуоресценция, может быть получена из культивируемых клеток, срезы вибратома или неповрежденной ткани с одновременной совместной локализацией нескольких флуоресцентные датчики, коэффициент отражения и проходящий свет.Собранные изображения можно реконструированы в 3D, улучшены или проанализированы с использованием различных методов. Данные могут быть легко переносится на другие платформы для анализа или окончательной презентации. Этот инструмент также имеет мощные возможности для FRAP, FRET и времени недействительные заявки. [Дополнительная информация и инструкции.]

Leica SP5 AOBS Лазерное сканирование Конфокальный микроскоп
Более новая модель SP2. Прибытие в конце декабря 2007 г.Для установки в новом вспомогательном помещении на втором этаже Центра генетической и трансляционной медицины Майкла Ф. Прайса в исследовательском павильоне Гарольда и Мюриэль в январе / феврале 2008 года.

Конфокальный микроскоп Zeiss Live / DUO
Высокоскоростной конфокальный микроскоп, разработанный специально для фотоактивации или отбеливания через отдельный сканер, чем путь формирования изображения. Этот конфокальный с лазером мощностью 100 мВт на Лазеры 489 нм и 50 мВт на 405 и 561 нм будут использоваться в первую очередь для живых клеток. Приложения.[Дополнительная информация и инструкции.]

PerkinElmer UltraVIEW RS-3 лазерный вращающийся диск Конфокальный микроскоп
Предпочтителен для визуализации культур живых клеток из-за пониженной фототоксичности, тонкой оптики разрезы могут быть отображены в виде покадровых объемов. Полное поле со скоростью 9 кадров в секунду, 12-битное изображение Система имеет лазерные линии на 488, 568 и 647 нм для возбуждения трех популярных диапазонов флуоресцентные датчики, пьезоэлектрический датчик для высокоскоростного воспроизводимого управления по оси Z, условия окружающей среды управление и оптика Nikon.Ожидается переезд в новый вспомогательный объект на втором этаже Центра генетических и генетических исследований Майкла Ф. Трансляционная медицина в исследовательском павильоне Гарольда и Мюриэль в г. Январь / Февраль 2008 г.

Многофотонный Конфокальная микроскопия
Многофотонная микроскопия основана на возбуждении флуорофоров или гармоник. генерация фемптосекундными импульсами высококонцентрированного длинноволнового света. Практически это позволяет визуализировать несколько длин флуоресцентных волн глубоко вживую. ткань.Система уменьшает обесцвечивание и другие проблемы, характерные для эпифлуоресцентных ламп. микроскопия, может быть более чувствительной из-за отсутствия конфокального отверстия и решает другие проблемы рассеяния света. Инструмент находится в центре прижизненного программа визуализации в AECOM. [Инструкция по эксплуатации.]

FRET
Передача энергии резонанса флуоресценции, передача энергии от донорного флуорофора в пределах 7 нм от акцепторного флуорофора, может использоваться для измерения связывающих взаимодействий между молекулами и внутри них.AIF обеспечивает отбеливание акцепторов для визуализации FRET. и измерения на трех конфокальных микроскопах и соотношения FRET с широкопольной микроскопией. Widefield FLIM во временной области с использованием закрытой охлаждаемой ПЗС-камеры с программным обеспечением LaVision.

TIRF
Полное внутреннее отражение Флуоресцентная микроскопия обеспечивает возбуждение флуорофоры только в пределах 100 нм от субстрата. Следовательно, только молекулы сразу же приложенные к покровному стеклу возбуждаются и визуализируются.Объектив с подсветкой TIRF предоставляется на Olympus IX71 либо с 60X, либо с 100X N.A. 1.45 или 100X N.A. 1.65 с возможностью выполнять TIRF / FRET с использованием зондов в видимом спектре от CFP через красный. Сбор изображений и автоматическая опалубка обеспечиваются Andor EM. камера и жалюзи Uniblitz, работающие под управлением IPLab.

D.I.C. (Номарский), Темное поле, фазовый контраст, IRM и эпифлуоресценция с цифровой визуализацией
Четыре инвертированных микроскопа станции с высоким пространственным разрешением, широким динамическим диапазоном (от слабого до яркого) с возможностью замедленной съемки и деконволюции.12 бит ПЗС-камеры с охлаждением Cooke Sensicam QE, установленные на высокоэффективных камерах Olympus IX70 или Инвертированные микроскопы IX81 с современной оптикой с коррекцией на бесконечность. Может быть использован для собирать несколько флуоресцентных датчиков и проходящий свет (светлое поле, фазовый контраст или Номарски) с помощью программы IPLab, запущенной на ПК. Экологические камеры для Микроскопы Olympus доступны для in vivo работ. Многие приложения, включая точечная фотометрия.Также моторы фокуса для сбора серийных секций для деконволюции. Деконволюция создает изображения, похожие на конфокальные по разрешению, но могут иметь Преимущество изображения слабого сигнала или широкого динамического диапазона. Стандартные люминесцентные фильтры включают FITC, родамин, Cy3, Cy5, Dapi, GFP, CFP, YFP среди других, более эзотерических и зеркало 50/50 для IRM. [Инструкция по эксплуатации.]

Исчерпывающий фотон Переназначение (EPR)
Деконволюция EPR дополняет другие методы деконволюции, предлагаемые в AIF, обеспечивающие сохранение общей энергия измеряемого объема для количественного анализа очень тусклых образцов. Автоматизированная визуализация многократно зондированных последовательных оптических срезов выполняется с помощью пьезоэлектрической контроллер и 15-битная CCD-камера Photometrics на высокоэффективной стойке Микроскоп Olympus. Это особая техника для изображения одного или нескольких молекулы с точным расположением в пределах 70 нм.

Микроинъекция
Микроинъекция — это метод доставки растворов (белки, ДНК или РНК, другие химические вещества) непосредственно в отдельные клетки в культура.У AIF есть две автоматизированные системы Eppendorf для использования на любых перевернутых микроскопы на Производственном объекте, в том числе конфокальные, многофотонные и другие цифровые системы визуализации. [Фильм о клетках вводится.] [Инструкции для использования.]

Анализ движения
Высокая скорость (200 кадров в секунду при ярком освещении). подсветка), в реальном времени (видео 30 кадров в секунду) или в замедленной съемке (прибл. от 100 мс до часов). с флуоресценцией и проходящим светом может выполняться на инвертированных микроскопах с климатические камеры с регулируемой температурой.Изображения могут быть превращены в фильмы для видео или веб-презентации. Сложные морфометрические измерения могут быть выполнены время. Количественная оценка изображений включает изменения интенсивности флуоресценции, изменения в скорости ячейки или частицы, направлении, форме и размере с течением времени и схематично визуализация таких изменений. В некоторых случаях изменение объема можно измерить.

Объемная визуализация и 3D Quantitation
Для 3D-рендеринга или реконструкции персонал работает и обучает Imaris Bitplane, Voxx, ряд плагинов для ImageJ и Volocity.Персонал обучает следователей в более простых трехмерных изображениях и количественном анализе путем анализа серийных срезов с помощью ImageJ и И. Лабораторная работа, включая создание скриптов для автоматизации и отчетов о результатах.

Распаковка одиночных фотонов
Распаковка — это активация путем удаления фотолабильной блокирующей группы из ДНК, РНК, белок или небольшие молекулы. Станция распаковки состоит из Olympus IX70, две ртутные дуговые лампы для УФ-распаковки и эпифлуоресценции, УФ-коррекции и фазового контраста оптика для распаковки и наблюдения за поведением ячеек, жалюзи для быстрой и своевременной распаковки и сбор изображений, и Cooke Sensicam для регистрации незафиксированной флуоресценции.Этот система разделяет микроскоп с аппаратом микроинъекции для удобства загрузки ячеек для живых экспериментов. Лазер 337 нм с приобретена для системы и находится в стадии разработки на отдельной подставке для микроскопа в Лаборатория инноваций в биофотонике.

Бумажная копия и презентация
На всех платформах обработки изображений, в оцифрованном виде файлы изображений имеют стандартные форматы и могут быть легко преобразованы в другие форматы; данные могут быть экспортированы в другие компьютерные системы или воспроизведены на различных устройствах с бумажными копиями.Adobe Photoshop CS наиболее широко используется для подготовки фигур, и мы рады помощь. Цветной принтер Fujix Pictrography 3000 обеспечивает непрерывный вывод тонов с частотой 400 PPI неотличим от реальных фотографий. Стандартная лазерная печать может быть используется для черновых оттенков серого, а также для четких графиков и текста. Как неподвижные изображения, так и движущиеся последовательности могут быть подготовлены для Интернета. презентация. AIF имеет в своем инвентаре инструменты для видео; однако использование специальное назначение, так как видео постепенно прекращается.

Компьютерная поддержка
Большинство стандартных анализов изображений выполняется на ПК с Windows XP. Mac G4 может быть доступен по специальному запросу. Крио ЭМ технологии разрабатываются на ПК с ОС Linux. Персонал AIF будет рад помочь с любым программным обеспечением, кроме ImageJ, I.P. Лаборатория, Lasersharp 2000, LCS (Leica confocal), Microsoft Excel, Adobe Photoshop, VOXX и 3D / 4D часть Volocity. Windows XP удовлетворяет все административные потребности.Исследователи могут передавать данные на свои собственные компьютеры через ALNET, записывая DVD / CD или поставляя свои собственные Firewire или USB жесткие диски или ключи памяти.

Сеть
Большинство компьютеров подключены к сети ALNET для отправки данных через Интернет.

Доступность оборудования
Все оборудование доступно в порядке очереди и по почасовой ставке, выставляемой за четверть часа; обычные световые микроскопы доступны за годовую плату.Следователи могут использовать оборудование без посторонней помощи, или они могут выполнять свою работу за них.

Команда руководителей | О нас | eLife

Вафик Эль-Дейри, доктор медицины, доктор философии, FACP, заместитель декана по онкологическим наукам в Медицинской школе Уоррена Альперта, директор онкологического центра Университета Брауна и директор совместной программы по биологии рака в компании Brown and Lifespan. Он является профессором патологии и лабораторной медицины, профессором медицинских наук и профессором Университета семьи Менкофф в Брауне.Он принимает пациентов в своей еженедельной клинике в больнице Род-Айленда, специализирующейся на лечении пациентов с колоректальным раком, и участвует в клинических испытаниях, основанных на исследованиях его лаборатории новых терапевтических средств. Ранее он занимал должности заместителя директора по трансляционным исследованиям, соруководителя программы молекулярной терапии, профессора онкологии и кафедры онкологических исследований Уильяма Викоффа Смита в онкологическом центре Фокса Чейза. С 2010 по 2014 год д-р Эль-Дейри был профессором медицины Роуз Данлэп и руководителем отделения гематологии-онкологии в Университете штата Пенсильвания.В 2009 году Эль-Дейри стал профессором-исследователем Американского онкологического общества. Ранее он был штатным профессором медицины (гематология-онкология), генетики и фармакологии в Пенсильванском университете, со-руководителем программы радиобиологии и визуализации в Онкологическом центре Абрамсона и заместителем директора по обучению врачей-ученых в области гематологии-онкологии, когда он уехал из Пенсильвании в 2010 году. Он получил степень доктора медицины / доктора философии в Медицинской школе Университета Майами, а также закончил резидентуру по внутренним болезням и стажировку по онкологии в больнице Джона Хопкинса и Онкологическом центре Джонса Хопкинса.Как практикующий академический онколог, его научный интерес и опыт связаны с гибелью клеток, лекарственной устойчивостью при раке, а также открытием и разработкой лекарств. Эль-Дейри основал две компании: Oncoceutics, Inc. и p53-Therapeutics, Inc.

.

Эль-Дейри открыл p21 (WAF1) как ген-мишень p53, универсальный ингибитор клеточного цикла и ген-супрессор опухоли, который впервые объяснил стрессовую реакцию клеток млекопитающих. Он открыл рецептор TRAIL DR5 и его регуляцию с помощью p53. TRAIL является частью иммунной системы хозяина, которая подавляет рак и его метастазы.Его лаборатория создала мышь с нокаутом TRAIL-рецептора DR5, и эта мышь склонна к опухолям, и после сублетального облучения у нее развивается воспалительный синдром в легких и кишечнике. Он определил c-Myc как основную детерминанту чувствительности TRAIL и продемонстрировал синергизм между терапией TRAIL и ингибитором мультикиназ сорафенибом. Основываясь на своих предыдущих достижениях, Эль-Дейри открыл ONC201 / TIC10 как первый в своем классе индуктор пути TRAIL, который является биодоступным при пероральном введении и преодолевает гематоэнцефалический барьер для лечения опухолей головного мозга.TRAIL и Foxo3a необходимы для противоопухолевого эффекта ONC201 посредством двойной блокады киназ ERK и Akt, которая способствует ядерной транслокации фактора транскрипции Foxo3a, который непосредственно регулирует ген TRAIL. Данные лаборатории Эль-Дейри показали, что ONC201 индуцирует TRAIL-рецептор DR5 посредством интегрированного стрессового ответа с участием факторов транскрипции ATF4 и CHOP. Пациенты с одними из самых агрессивных глиом (мутант h4K27M DIPG) имели исключительные ответы на ONC201.

Как врач-ученый, доктор Эль-Дейри работал над тем, чтобы внести в клинику новые открытия.На следующем этапе своей карьеры он намерен раскрыть механизмы, участвующие в восстановлении пути p53, с помощью терапевтических кандидатов, открытых его лабораторией. Это захватывающе, поскольку он определяет новый класс противораковых препаратов с восстановлением пути p53 и нацеливанием на контрольные точки S-фазы и распознаванием ATF4 в качестве основного механизма фактора транскрипции для восстановления пути p53 в опухолевых клетках с нулевым p53 или мутантным p53. Он создает наборы транскриптомных и протеомных данных с помощью химиотерапии, которая действует через p53, и с новыми небольшими молекулами, которые восстанавливают путь p53 в p53-дефицитных или мутантных экспрессирующих p53 клетках.Он использует медицинскую химию и технологии органоидов для выполнения своих научных исследований, которые ведут к клиническим испытаниям, некоторые из которых он возглавляет.