15 лада фото: Купить LADA (ВАЗ) 2115 с пробегом: продажа автомобилей Лада 2115 б/у в Санкт-Петербурге

Содержание

Тюнинг ВАЗ 2115 — фото, тюнинг своими руками, тюнинг салона, двигателя 2115

Рассмотрим тюнинг ВАЗ 2115, или, как ее называют в простонародье «пятнашки». Данный автомобиль является рестайлинговой версией модели ВАЗ 21099. Серийный выпуск 2115 начался в 1997 году, причем вначале автомобили собирали в опытно-промышленном цехе.

На основной конвейер Волжского автозавода «пятнашка» встала в 2000 году, а с 2004 года ВАЗ 2115 полностью заменил «девяновсто девятую», которую к тому времени сняли с производства.

От последней ВАЗ 2115 отличается иной головной оптикой и задними фонарями, новой крышкой багажника со спойером, а также другими передними крыльями и капотом. Также автомобиль обзавелся измененными бамперами и широкими молдингами на дверях.

Такое преобразование, словно заводской тюнинг, который сделал Lada 2115 приятнее внешне. Кроме того, был улучшен и салон, автомобиль получил новую приборную панель, которая затем перекочевала на ВАЗ 2114 и 2113 и получила название «евро».

Вообще, «пятнашка» стала первенцем в семействе моделей Самара-2, созданного на базе первой Самары, известной также как Спутник. Четырнадцатая и тринадцатая модели ВАЗа появились позже.

Поработав над экстерьером и интерьером ВАЗ 21099, чтобы превратить ее в Ладу 2115, на АвтоВАЗе практически ничего не сделали с ходовой автомобиля, так что приобретая сегодня «пятнашку», стоит задуматься об ее тюнинге.

Если говорить о тюнинге двигателя, салона, подвески ВАЗ 2115, то подробное описание этого можно найти в статье про тюнинг ВАЗ 2114, поскольку технически данные автомобили почти одинаковы.

Здесь же можно посмотреть фото тюнинговых 2115, созданных, в основном, своими силами их владельцев. Как видно, вложившись в доработку, на выходе можно получить очень даже приличный автомобиль.

Внешний тюнинг ВАЗ 2115 не обходится без установки красивых колесных дисков, благо, их выбор для моделей семейства Лада Самара очень велик. Для «пятнашки» выпускаются различные комплекты обвесов, а также альтернативные бампера, оптика и фонари.

Спойлер на крышке багажника 2115 нравится далеко не всем, поэтому некоторые владельцы его демонтируют. Без него машина смотрится действительно несколько лучше, но это скорее уже дело вкуса.

Также тюнинг ВАЗ 2215 может включать в себя установку иных зеркал заднего вида, окраску боковых молдингов под цвет кузова, в том числе и с заменой их на альтернативные, занижение подвески и другие, более индивидуальные приемы.

Тюнинг салона 2115 может включать установку спортивного рулевого колеса, смену передних кресел на спортивные, а также установку различного оборудования и приборов, в том числе мультимедийного.

Смотрите также фото тюнинг ВАЗ 2113 — рестайлинговой версии Вазовской «восьмерки».

Тюнинг ВАЗ 2115 фото

LADA Granta седан 2021 года: фото, цены, комплектации, характеристики

• Подушка безопасности водителя
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Аудиоподготовка

• 14» стальные диски
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.


• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• 14» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиоподготовка

• 14» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок

• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 14» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС

• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета

• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)

• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова

• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления

• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 14» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX

• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Кондиционер
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота черного цвета
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски оригинальные
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)
• Система электронного контроля устойчивости (ESC)
• Противобуксовочная система (TCS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Датчики парковки задние
• Датчики дождя и света
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Центральный замок
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 14» стальные диски
• Колпаки колес декоративные
• Запасное полноразмерное стальное колесо 14»

• Подушка безопасности водителя
• Подушка безопасности переднего пассажира
• Подголовники задних сидений 3 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Блокировка задних дверей от открывания детьми
• Иммобилайзер
• Охранная сигнализация
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Подсказчик переключения передач в комбинации приборов (только для МТ)
• Заднее сиденье с раскладкой в пропорции 60/40
• Противосолнечный козырек пассажира с зеркалом
• Розетка 12V

• Электроусилитель рулевого управления
• Регулируемая по высоте рулевая колонка
• Регулировка ремней безопасности передних сидений по высоте
• Сиденье водителя с регулировкой по высоте
• Воздушный фильтр салона
• Легкая тонировка стекол
• Складной ключ
• Центральный замок с дистанционным управлением
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Электростеклоподъемники задних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Обогрев ветрового стекла
• Климатическая система
• Круиз-контроль и ограничитель скорости
• Аудиосистема (FM, USB, SD-карта, Bluetooth, Hands free), 4 динамика

• Наружные зеркала с боковыми указателями поворота в цвет кузова
• Наружные ручки дверей в цвет кузова
• Молдинги боковых дверей
• 15» легкосплавные диски
• Запасное стальное колесо временного использования 14»

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2115 (Samara2) (Лада 2115 (Самара2)) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки

Отзывы владельцев Lada (ВАЗ) 2115 (Samara2) (Лада 2115 (Самара2)) с фото, плюсы и минусы, достоинства и недостатки — Авто Mail. ru —

Коробка передач

Объем двигателя, л

—Я просто люблю эту машину не важно, хороша она или нет, постоянный ремонт и что то надо сделать, не дают расслабиться, эта машина зарядка для ума и рук, есть другой авто, но эта как память и для…

1

Очень доволен, и сейчас бы ее купил новую, но уже закончили выпуск. оборотистая, хваткая, быстрый разгон, есть компьютер позволяющий отслеживать состояние машины. легка и дешева в ремонте. За весь…

34 комментария

Брал новый с салона в 2008 г. Комплектация норма. В целом авто доволен после ваз 2106 вообще первый месяц казалось иномаркой. По гарантии меняли четыре раза бочек Ож, лопался после купил другую крышку…

13 комментария

Меня устраивает. По спартански . без излишеств.

2 комментария

Покупал за 170 т.р. в трёхлетнем возрасте с пробегом 38 т.км. Сразу вложил 20 т.р. (резина, радиатор, опоры стоек и по мелочи).

1

В целом машиной доволен, масло не ест (меняю каждый год, заливаю синтетику от замены до замены ), небольшой расход бензина (на 95) по городу зимой с прогревом до 10л на 100 км, летом на трассе 5,5 л. ..

3

Бюджетный авто, умеренный расход топлива, неприхотливая в обслуживание, до 150 тыс. практически не досаждала, так по мелочам. После сделали капремонт ГБЦ наездил ещё 50 тыс. в принципе нормально, с…Никогда бы не купил, но отдали в обмен на мои услуги (мебель на заказ). Нормальная рабочая лошадь, неприхотливая, материалы вожу чаще чем людей, довольно вместительная.

22 комментария

Брал 11-ти летнюю, пробег 110тыс. км, после покупки пришлось много чего поменять: шрусы, рейку, сзади барабаны, колодки, цилиндры тормозные, потом печка потекла, с февраля по июнь приходилось так…

45 коментариев

Недорогой в обслуживании, неприхотливый к топливу, достаточно мощный и надежен в дальних поездках, не боится российских дорог, теплый салон, не боится морозов, приятный на вид внутри и снаружи. Купил…

43 комментария

Машина своих денег безусловно стоит. Если не ждать от неё чудес невообразимых, разочарованы не будете! Когда сравниваешь корректно; т.е. с одноклассниками, практически ни в чём не уступает, а в чём-то. ..

3

Хорошая машина от нашего производителя, конечно она не достаточно укомплектована, она не современна, не самая красивая на вид и тем более она не спорт кар, но она по своему достаточна хороша как…

5

Едет нормально, если с подвеской порядок не гремит и не пердит.Ваз 2115 купил в 2003г. Как я понял из СМИ А/м в это время был ещё не на конвейере, возможно поэтому до сих пор двигатель не ремонтировался и давление во всех цилиндрах по12кг/кв см, заводится с…

1 комментарий

Уже 7 лет езжу на пятнашке. Брал 2 летнюю и пробегом около 24 тыс. км. За всё это время ни разу не пожалел о выборе. Не могу себя назвать водителем педантично следящим за машиной, меняю вовремя только…

3

Не прихотливый , расход топлива трасса 5 литров , город 7-8 литров . За 10 лет ни разу не подвёл . Правда , ТО и мелкие ремонты всегда провожу вовремя. Правда . мало места для размещения груза , но…

6

Я купила свой автомобиль в России в Челябинской области .Им довольна -приехав домой съездила на сто на диагностику -абсолютно все в порядке . Легкая в управлении хорошая машина

7

КОРОТКО, ЧТОБЫ ВСЕ ПРОЧИТАЛИ!!! Скажу честно: если бы у меня была возможность купить сейчас новый автомобиль из модельного ряда ЛАДА, то это была бы…

112 комментария

привет всем.поделюсь эксплуатацией ваз 21150,2004г.в.сейчас на ней ездит дочь.много писать нет смысла,тот,кто ездит на вазах-поймёт.за весь срок заменено-3 датчика.4 глушителя(прогорают,тонкое железо…

161 комментарий

Пока что моя первая машина. Брал новую. Не жалею. За пять лет только мелкий ремонт: замена масла, охлаждающей жидкости, ламп ближнего света, да раз первое положение на печке не работало (заехал к…

8

Помогите людям с выбором — расскажите о своем опыте использования автомобиля.

Написать отзыв

<div data-module=»SlotModel» data-view=»SlotView.345798″ data-id=»345798″ data-qa=»LazyBody.block.cpfModules»></div>

Автомобиль ВАЗ 2115: Фото #12 из 17, размер изображения

Daewoo Nubira

Дебют автомобиля относится к 1997 году. Сама модель является переднеприводной с расположением двигателя в поперечном сечении.

Ford Grand C-Max

Ford Grand C-Max (Форд Гранд C-Max) — модель второго поколения компактного минивена Ford C-Max. Оба автомобиля построены на платформе популярного Focus.

Lifan Breez Hatchback

Впервые мир смог увидеть данную модель в 2007 году. Lifan Breez Hatchback пришла на рынок автомобилей как дополнение к Lifan Breez.

Mazda Efini MS-8

Полноразмерный Мазда Эфини MS-8 представляет собой классический седан бизнес-класса. Впервые модель появилась в 1992 году.

SEAT 1200 Sport

Модель является спортивным купе, который производит компания Seat. Она выпускалась с 1975 года по 1980.

FRET-повышенная фотостабильность позволяет улучшить отслеживание отдельных молекул белков и белковых комплексов в живых клетках млекопитающих.

Анализ структуры белка

Данные опубликованных кристаллических структур были проанализированы с использованием пакета UCSF Chimera 55 . Программное обеспечение Chimera также использовалось для создания рисунков для этой статьи. Список проанализированных белковых структур выглядит следующим образом: mEos3.2 (PDB ID: 3P8U) 56 , HaloTag (PDB ID: 4KAA) 57 , тег SNAP (PDB ID: 3KZZ) 58 и CENP -Нуклеосома (PDB ID: 3AN2) 44 .

Экспрессия белков mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP-tag

Конструкция mEos3.2-HaloTag была клонирована из плазмид, содержащих mEos3.2 59 и HaloTag (Promega), слитых через короткий линкер (Leu- Glu-Gly-Ser), и вставляли в расщепленный EcoRI / HindIII экспрессионный вектор pET30a с использованием набора для клонирования In-Fusion HD (Clontech). Таким же образом клонировали конструкцию HaloTag-SNAP. Затем проводили сайт-направленный мутагенез вектора mEos3.2-HaloTag для создания конструкции слияния с другой длиной линкера (ΔARRELEGSE).

His-tagged конструкции mEos3.2-HaloTag и HaloTag-SNAP были экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) pLysS путем выращивания литра клеток из 50-мл стартовой культуры до OD 600 нм 0,7–1,0 в среде LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и 34 мкг / мл хлорамфеникола, перед индукцией экспрессии с использованием 1 мМ IPTG (Melford Laboratories Ltd) в течение 4 ч при 25 ° C. Клетки осаждали и хранили при -20 ° C. Для очистки белка клетки быстро размораживали при 37 ° C и ресуспендировали в трех объемах буфера для лизиса (50 мМ Hepes pH 7.5, 300 мМ NaCl, 5% глицерина и коктейль ингибиторов протеазы (Roche)) на объем гранулы. Затем ресуспензию клеток обрабатывали ультразвуком в течение 13 минут с амплитудой 33% (5 секунд включительно и 10 секунд выключили) с использованием Sonic Dismembrator (модель 505, Fisher Scientific), клеточный дебрис осаждали, и белковый лизат собирали и фильтровали через 0,45- мкм фильтр.

Слитые белки сначала очищали с помощью аффинной хроматографии на никеле. Лизат белка ресуспендировали в 5 мл суспензии шариков 50% Ni-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA) (Qiagen), предварительно уравновешенной в буфере (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, pH 8.0) и вращали в течение ночи при 4 ° C. Слитый белок очищали с использованием гравитационной колонки объемом 20 мл (Bio-Rad), промывали тремя объемами колонки промывочного буфера (50 мМ NaH 2 PO 4 , 300 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, pH 8,0) и окончательно элюировали 10 мл буфера для элюции (50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, 250 мМ имидазол, pH 8,0). Затем белок диализовали (в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0) для удаления имидазола с использованием Vivaspin 500 с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 5 кДа (Sartorius Stedim Biotech).Затем слитый белок дополнительно очищали гель-фильтрацией в буфере, состоящем из 50 мМ NaH 2 PO 4 и 1 М NaCl (колонка 75 мл Sephadex200, GE Healthcare). Для проверки массы белка (65096,8 Да) проводили масс-спектрометрию, а для определения его концентрации использовали аминокислотный анализ. Белок хранили в аликвотах по 500 мкл по 1 мг / мл при -80 ° C и повторно очищали с использованием эксклюзионной хроматографии перед маркировкой красителя. Слитые белки (5–10 мкМ) метили лигандами HaloTag-dye или SNAP-tag-краситель путем их реакции в эквимолярном соотношении при комнатной температуре в течение 1 ч перед очисткой с использованием гравитационной колонки Illustra Nap-5 (GE Healthcare ).Масс-спектрометрия подтвердила, что метка близка к 100%.

Красители HaloTag или SNAP-tag PA-JF 549 и JF 646 были любезным подарком от Люка Д. Лависа (HHMI) 60 .

Характеристика спектров объемной флуоресценции

Спектры объемной флуоресценции были получены с использованием mEos3.2 или PA-JF 549 с красителем JF 646 или без него (15–25 мкМ) с использованием флуоресцентного спектрофотометра (Cary Eclipse). Образец помещали в кварцевую кювету (Hellma Analytics, 3 × 3 мм).Чтобы определить фактическую эффективность FRET белков mEos3.2-HaloTag с различными красителями, спектры испускания были собраны после возбуждения при 532 нм и регистрации флуоресценции в диапазоне длин волн (550-800 нм). Эффективность FRET ( E ) была рассчитана по стандартному уравнению (уравнение 1):

$$ E = 1 — \ frac {{I _ {\ rm D} \ prime}} {{I _ {\ rm D}} }, $$

, где \ (I _ {\ rm D} \) — интенсивность флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2), а \ (I _ {\ rm D} \ prime \) — интенсивность флуоресценции донор в присутствии акцептора (mEos3.2 \) — фактор ориентации диполя (\ (\ frac {2} {3} \) для свободно вращающихся донорных и акцепторных флуорофоров), \ (Q _ {\ rm D} \) — квантовый выход донора mEos3. 2 или PA-JF 549 флуорофоров (0,55 и 0,88 соответственно), n — показатель преломления среды (1,33), а J — интеграл спектрального перекрытия между донорами mEos3.2 или PA-JF 549 и акцепторный JF 646 спектры, рассчитанные на разных длинах волн λ с использованием коэффициента экстинкции \ ({\ it {\ epsilon}} _ {\ rm A} \) акцепторного красителя JF 646 (максимальное значение 152000 M −1 см −1 ) (Ур.4 \ mathrm {d} \ lambda. $$

Визуализация времени жизни флуоресценции

Измерения временного коррелированного подсчета одиночных фотонов (TCSPC) были выполнены на системе Leica SP8 STED 3 ×, дополнительно оснащенной программным обеспечением Single Molecule Detection (SMD) (SymPhoTime версия 5.3.2.2) и аппаратное обеспечение (PicoHarp 300; PHR 800) от PicoQuant. Возбуждение флуоресценции в этой системе осуществлялось импульсным (80 МГц) настраиваемым лазером белого света (WLL; Super-K; NKT Photonics), в то время как обнаружение флуоресценции осуществлялось с помощью внутреннего гибридного детектора одиночных молекул (Leica HyD SMD). Возбуждение донора выполняли на длине волны 561 нм с полосой обнаружения 570-620 нм и с использованием водно-иммерсионного объектива 20 × 0,75 NA (HC PL APO CS2) с коэффициентом масштабирования 1 × и скоростью сканирования 400 Гц. , и с накоплением кадров 25 изображений. Фотоактивация / преобразование была достигнута с использованием лазера 405 нм в течение 1 мин при мощности активации 1,75 кВт / см 2 в фокальной плоскости объектива до измерения срока службы. Увеличение эмиссии доноров произошло после активации / конверсии, как и ожидалось.Измерения FLIM проводили в трех экземплярах до и после активации / конверсии очищенного белка в 50 мМ NaH 2 PO 4 , 1 М NaCl, pH 8,0 на 8-луночных μ-слайдах со стеклянным дном (iBidi). Белок прикрепляли к покровному стеклу путем инкубации с поли-L-лизином (Sigma Aldrich) в течение 30 минут, а затем с 5–10 мкМ белка в течение 10 минут. Буфер был заменен для удаления плавающего белка, а затем визуализация прикрепленного белка была проведена путем фокусирования на покровном стекле. {- t / \ tau _i} $$

где I Bkgd — смещение интенсивности для подсчета фона, а \ (\ alpha _i \) и \ (\ tau _i \) — значения амплитуды и времени жизни для i -й экспоненты, где мы сравнивали соответствия для 1 ≤ i ≤ 3 (т.е.е., моно-, би- и трехэкспоненциальные аппроксимации). Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных с помощью байесовского информационного критерия (BIC) 62,63 . Короче говоря, используя этот подход, мы рассчитали BIC для каждой модели из (Ур. 6)

$$ \ mathrm {BIC} = \ ln [n] (p + 1) + n \ left ({\ ln \ left [{\ frac {{2 \ pi {\ rm RSS}}} {n}} \ right] + 1} \ right), $$

, где n — количество точек данных, p — это количество свободных параметров для подгонки, а RSS — остаточная сумма квадратов подбора.Впоследствии мы определили относительную вероятность для каждой модели для каждого набора данных из (Уравнение 7):

$$ {\ mathrm {Relative}} \; {\ mathrm {Likelihood}} = {\ mathrm {Exp}} \ left [{ \ frac {{{\ mathrm {BIC}} _ ​​{{\ mathrm {Min}}} {\ mathrm {(модель) -}} {\ mathrm {BIC (модель)}}}} {2}} \ right] . $$

Данные для mEos3.2 с JF 646 и без него и PA-JF 549 с JF 646 и без него можно описать двумя сроками службы. Мы определили эффективность FRET ( E ), используя среднее время жизни флуоресценции (уравнение.8):

$$ E = 1 — \ frac {{\ tau _ {{\ rm DA}}}} {{\ tau _ {\ rm D}}}, $$

где \ (\ tau _ {\ rm D} \) — средневзвешенное по амплитуде время жизни флуоресценции одного донорного флуорофора (mEos3.2 или PA-JF 549 ), а \ (\ tau _ {{\ rm DA}} \) — амплитуда средневзвешенное время жизни флуоресценции донора в присутствии акцептора (mEos3.2 – JF 646 или PA-JF 549 –JF 646 ).

Установка микроскопа

В этой работе использовались две сделанные на заказ установки микроскопа, обе из которых описаны ниже.Таблицу с подробным описанием конкретных параметров, используемых для каждого эксперимента, можно найти в дополнительной информации.

Микроскоп 1: использовался инвертированный микроскоп IX71 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре масляного объектива Olympus 1,49 NA 60 × (Plan Apochromat 60 × NA 1,49, Olympus APON 60XOTIRF). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Oxxius, LaserBoxx 405, 100 мВт).Полное внутреннее отражение достигалось смещением лазерного луча от оси таким образом, чтобы выходящий луч на границе образца был почти коллимированным и падал под углом, превышающим критический угол θ c ~ 67 ° для границы раздела стекло / вода для Визуализация TIRF и чуть меньше θ c для визуализации с косоугольным освещением. Это создавало след возбуждения диаметром ~ 50 мкм. Для TIRF плотность мощности на покровном стекле для лазера с длиной волны 561 нм была рассчитана приблизительно равной 0.4 кВт / см 2 измерено с помощью лазерного луча при эпи-освещении. Для косоугольного освещения мощность коллимированных лучей на задней апертуре микроскопа составляла 10 кВт / см 2 и 10–100 Вт / см 2 для лазерных лучей 561 нм и 405 нм соответственно. Лазеры отражались дихроичными зеркалами, которые также отделяли собранное флуоресцентное излучение от пучка TIR (Semrock, Di01-R405 / 488/561/635). Эмиссия флуоресценции собиралась через тот же объектив, а затем дополнительно фильтровалась с использованием комбинации длиннопроходных и полосовых фильтров (BLP01-561R и FF01-587 / 35 для возбуждения 561 нм).Эмиссионный сигнал расширялся с помощью расширителя ахроматического луча 2,5 × (Olympus, PE 2,5 × 125) и, наконец, проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512) с коэффициентом усиления электронного умножения 250 ADU / фотон, работающим в режиме передачи кадров. Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

Микроскоп 2: использовался инвертированный микроскоп IX73 Olympus с лазерными лучами с круговой поляризацией, выровненными и сфокусированными на задней апертуре Olympus 1.40 NA Масляный объектив 100 × (Universal Plan Super Apochromat, 100 ×, NA 1.40, UPLSAPO100XO / 1.4). Используемые источники света диодных лазеров с непрерывной длиной волны включают 641 нм (когерентный, CUBE 640–100 C, 100 мВт), 561 нм (Cobolt, Jive 200, 200 мВт) и 405-нм лазер (Stradus, Toptica, 405–100, 100 мВт). Визуализация TIRF и косоугольного освещения выполнялась с использованием идентичных дихроичных зеркал и фильтров излучения. Сигнал излучения проецировался на EMCCD (Photometrics, Evolve 512 Delta) с коэффициентом усиления электронного умножения 250 ADU / фотон, работающий в режиме передачи кадров.Инструмент был автоматизирован с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом micro-manager (https://www.micro-manager.org), а данные отображались с помощью программного обеспечения ImageJ 64,65 .

TIRF-характеристика mEos3.2-HaloTag-красителей

Покровные стекла из боросиликатного стекла (VWR Int, 22 × 22 мм) очищали для удаления любых флуоресцентных остатков в очистителе аргоновой плазмы (плазма Харрика) в течение 1 часа. Камеры для инкубации с герметичной рамкой (Bio-rad) прикрепляли к покровному стеклу и 50 мкл 0,1% поли-L-лизина (Sigma Aldrich) добавляли в центр камеры на 30 мин; Затем к покровному стеклу, покрытому поли-L-лизином, добавляли 50 мкл 10 нМ белка на 10-15 мин. Образец трижды промывали 50 мкл отфильтрованной (шприц-фильтр 0,2 мкм, Whatman, 6780–1302) воды MilliQ, и изображения флуоресценции, собранные в виде видеозаписей из 500 изображений, при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование производилось одиночным импульсом в первом кадре каждого фильма.

Анализ фотофизических параметров

Эксперимент был воспроизведен в лаборатории дважды на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2. Хотя все эксперименты показали схожие результаты, мы решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить возникающие систематические ошибки. от слегка различающихся настроек микроскопа.Мы проанализировали фильмы, собранные в тот же день с микроскопа 1, в которых мы отслеживали 455 и 454 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 молекул без Trolox, 990 и 1568 одиночных mEos3.2 и mEos3.2 – JF 646 молекул с 2 мМ Trolox. Учитывая, что 20% одиночных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии значительно дольше, чем одиночные молекулы mEos3. 2, это подходящий размер выборки, чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Все гистограммы были созданы с использованием пакета Origin (OriginLab, Northampton, MA).

Здесь приводится краткое описание программного обеспечения, используемого для анализа данных. Проекция с максимальной интенсивностью первых двух изображений после фотопреобразования использовалась в качестве основы для обнаружения одиночных молекул. К проекции был применен фильтр Лапласа гаусса, и были найдены локальные максимумы. Скрипты для этого доступны по адресу https://github.com/TheLaueLab/blob-detection, а для всех остальных шагов — по адресу https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis. Область с центром на каждом пике с пороговым значением> 600 ADU была извлечена из каждого изображения.Эта область состояла из сигнальной области размером 7 на 7 пикселей и окружающей фоновой области шириной 2 пикселя. Отдельные кадры были упрощены до одномерных графиков путем вычитания среднего покадрового фона из соответствующего кадра, а затем взятия среднего значения всех пикселей в этом кадре. Скрытая марковская модель (с использованием пакета python hmmlearn из https://github.com/hmmlearn/hmmlearn) была настроена с четырьмя состояниями: двумя включенными состояниями, одним выключенным и одним обесцвеченным. Переходы были одинаково вероятны между всеми включенными и выключенными состояниями и 1/10 вероятности из любого включенного состояния в обесцвеченное состояние (переход от обесцвеченного состояния был невозможен).Состояния были инициализированы со средним значением 300 ADU для включенных состояний и 0 для выключенного и обесцвеченного состояний, с предварительным весом 1e3, присвоенным среднему состоянию. Модель была обучена на всех следах от определенного флуорофора, и та же обученная модель использовалась для категоризации всех следов.

Общее время в открытом состоянии каждой молекулы было рассчитано путем подсчета количества изображений в открытом состоянии. Мигание определялось как серия последовательных изображений; средняя длина цикла, умноженная на время воздействия, является временем включения, а количество циклов, обнаруженных для конкретной молекулы, представляет собой количество событий переключения. Частота выключения — это количество миганий, разделенное на общее время включения, а частота включения — это количество миганий, разделенное на общее время выключения (исключая последний запуск вне кадра, если он продолжался до конец видео).

Наконец, было вычислено полное излучение фотонов для каждого изображения, вычитая среднее значение области фона из области сигнала. Чтобы вычислить количество испускаемых фотонов на молекулу, общее усиление камеры в аналого-цифровых единицах (ADU) / фотон было определено по формуле (Ур.9)

$$ G _ {{\ rm total}} = \ frac {1} {{G _ {{\ rm camera}}}} \ times G _ {{\ rm EM}} \ times {\ rm QE}, $$

где G камера — это усиление сигнала, присущее EMCCD в единицах ADU / электрон, G EM — это соотношение заряда на камере с усилением и без усиления, а QE — это коэффициент усиления. квантовая эффективность — способность камеры производить заряд в результате падающего фотона в единицах электрон / фотон. G итого это 33.1 ADU / фотон и 35,7 ADU / фотон для микроскопов 1 и 2 соответственно.

Измеренный сигнал ( I ) в единицах электронов был преобразован в испускаемые фотоны ( n ) следующим образом (уравнение 10):

$$ n = \ frac {I} {{G _ {{\ rm total}} \ times {\ rm TE}}}. $$

TE определяется как эффективность передачи всех оптических компонентов на пути излучения прибора и может быть описана формулой (11)

$$ { \ rm TE} = \ eta _ {{\ rm coll}} \ times T \ times \ eta _ {{\ rm EMCCD}}, $$

, где η coll — эффективность сбора объективом, T — это пропускание внутренних оптических компонентов микроскопа, а η EMCCD — квантовая эффективность EMCCD 66 .

Культура клеток млекопитающих и поколение клеток

ES-клетки культивировали в стандартных условиях сывороточного и мышиного фактора ингибирования лейкемии (mLIF): минимальная необходимая среда Глазго (Sigma-Aldrich G5154), содержащая 100 мМ 2-меркаптоэтанол (Life tech, кат. 21985023), 1 × Minimum Essential Media, незаменимые аминокислоты (Sigma-Aldrich, M7145), 2 мМ L-глутамин (Life tech, кат. 25030024), 1 мМ пируват натрия (Sigma-Aldrich, S8636-100ML), 10% фетальная бычья сыворотка (HyClone FBS, номер партии SZB20006, GE Healthcare Austria SV30180.03) и 10 нг / мл mLIF (предоставлено кафедрой биохимии Кембриджского университета). Их пассировали каждые 2 дня, промывая PBS (Sigma-Aldrich, D8537), добавляя 0,25% трипсин-ЭДТА (Life tech, кат. 25200072) для отделения клеток, а затем промывая среду перед повторным посевом в свежую среду. Чтобы помочь клеткам прикрепиться к поверхности, планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в PBS, содержащем 0,1% желатина (Sigma Aldrich, G1890). Фоновые линии ES-клеток E14tg2a (доступные от Sigma Aldrich, 08021401) были охарактеризованы с помощью количественной ПЦР, RNA-seq, ChIP-seq и анализов активности, и их обычно проверяли на контаминацию микоплазмой и дали отрицательный результат.

ES-клетки, экспрессирующие мышиный CHD4, помеченный на С-конце mEos3. 2-HaloTag, генерировались путем нокаута на основе CRISPR / Cas9 кассеты, содержащей mEos3.2-HaloTag и ген селекции пуромицина в один аллель CHD4 ячейки ES 37 . Затем кассету пуромицина удаляли с использованием рекомбиназы Dre для генерации аллеля CHD4 с помощью слияния с С-концевым mEos3.2-HaloTag. Поскольку нокаут CHD4 является летальным, мы использовали анализы жизнеспособности клеток, чтобы убедиться, что функция меченого CHD4 не нарушена.Линия ES-клеток E14tg2a 67 , экспрессирующая mEos3.2-tagged CENP-A, была описана ранее 59 , но вкратце была получена путем трансфекции плазмиды, экспрессирующей меченый белок, с последующей селекцией в 500 мкг / мл генетицина (Life tech , кат.10131019). После 2 недель отбора генетицина клетки сортировали с использованием проточного сортировщика MoFlo (Beckman Coulter), чтобы гарантировать, что они были помечены флуорофором mEos3.2 (возбуждение при 488 нм, испускание при 515 нм). Чтобы проверить наличие одномолекулярного FRET между mEos3. 2 или PA-JF 549 и JF 646 на разных белках, векторы, экспрессирующие CENP-A с тегами HaloTag и SNAP, были получены путем вставки последовательности тегов HaloTag или SNAP в сайт NcoI / XhoI mEos3.2. вектор CENP-A, помеченный выше, 59 . Один только белок HaloTag также экспрессировался в том же векторе, что и контроль. Вектор, экспрессирующий гистон h3B с меткой SNAP, был ранее описан 45 .

Визуализация живых клеток и фиксированных клеток млекопитающих с одной молекулой

ES-клетки, экспрессирующие mEos3.CHD4, меченный 2-HaloTag, пассировали за 2 дня перед визуализацией на 35-миллиметровых чашках со стеклянным дном № 1.0 (MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Case) в сыворотке без фенолового красного и в условиях mLIF. Непосредственно перед визуализацией, если необходимо, клетки метили 5 мкМ лиганда HaloTag-JF 646 в течение не менее 15 минут с последующими двумя промывками в PBS и 30-минутной инкубацией при 37 ° C в среде перед визуализацией клеток в свежая сыворотка без фенолового красного и условия LIF, содержащие 5 мМ Trolox. Флуоресцентные изображения in vivo собирали в виде видеороликов из 10 000 кадров при экспозиции 500 мс.Непрерывное фотопреобразование достигалось с помощью лазера с длиной волны 405 нм при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 .

Для отслеживания белкового комплекса ES-клетки, экспрессирующие гистон h3B, меченный SNAP, или mEos3.2-, HaloTag- и CENP-A, меченный SNAP, получали путем трансфекции соответствующих экспрессионных векторов. Четыре микролитра Lipofectamine® 2000 (Life tech, кат. 11668027), инкубированных в 100 мкл OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Thermo Fisher Scientific, кат. 31985070) в течение 5 минут, добавляли примерно к 2–3 мкг раствора. векторы экспрессии, также инкубированные в 100 мкл OPTI-MEM® в течение 5 мин.Затем смесь инкубировали еще в течение 15 мин перед добавлением к ES-клеткам, которые одновременно пассировали на чашки со стеклянным дном 35 мм. Через 2 дня клетки метили с использованием соответствующих лигандов HaloTag, как описано выше для CHD4. Лиганды меток SNAP также были помечены аналогичным образом, но с начальной инкубацией за 30 минут до промывки.

FRET был оптимизирован за счет обеспечения избытка акцепторного красителя вокруг донора mEos3.2 или PA-JF 549 . Для FRET между mEos3.2-tagged CENP-A и JF 646 -tagged CENP-A, это было выполнено путем трансфекции 0,4 мкг CENP-A с меткой mEos3.2 или CENP-A с меткой SNAP вместе с 2 мкг CENP-A с меткой HaloTag. А. Для FRET между PA-JF 549 с меткой и JF 646 с меткой CENP-A или PA-JF 549 с меткой и h3B с меткой JF 646 , это было достигнуто путем мечения клеток после трансфекции с 0,2 µM SNAP-tag PA-JF 549 лиганд и 2 µM SNAP-tag JF 646 лиганд. Наконец, для CENP-A / h3B FRET — 1 мкг mEos3.2-меченый CENP-A трансфицировали вместе с 1 мкг SNAP-меченного CENP-A и метили 5 мкМ SNAP-tag JF 646 лигандом. Клетки, экспрессирующие конструкцию mEos3.2-CENPA, PA-JF 549 -CENP-A или PA-JF 549 -h3B, были идентифицированы по их способности фотоактивировать отдельные молекулы с использованием лазера 405 нм и клеток, меченных лиганды HaloTag-JF 646 или SNAP tag JF 646 по их локализации в центромерных фокусах или в ядре (для HaloTag-CENP-A или h3B с меткой SNAP, соответственно), как определено с помощью визуализации с использованием лазера с длиной волны 641 нм. (1 кВт / см 2 ).Флуоресцентные изображения фиксированных и живых клеток собирали в виде видеофильмов размером от 3000 до 5000 кадров при экспозиции 500 мс. Фотопреобразование достигалось с использованием 100 мс экспозиции лазера 405 нм каждые 6 с при низкой мощности активации ~ 10 Вт / см 2 . Для фиксации клеток клетки промывали PBS, фиксировали при комнатной температуре в PBS, содержащем 4% формальдегид, в течение 15 мин, снова промывали в PBS и затем ресуспендировали в PBS, содержащем 5 мМ Trolox.

Обработка и анализ изображений клеток млекопитающих

Фильмы с живыми клетками и фиксированными клетками с одиночными молекулами были проанализированы с использованием программного обеспечения Rapidstorm, которое определяет локализации одиночных молекул из фильмов PALM 68 , после использования коррекции фона катящегося шара изображения с радиусом 5 пикселей.Анализировались только флуоресцентные точки шириной менее 5 или 3 пикселей (для микроскопов 1 и 2 соответственно) и с фиксированным глобальным порогом выше 25000. Чтобы отслеживать отдельные молекулы CHD4, CENP-A или h3B, мы использовали специальный код для соединения локализаций отдельных молекул и извлечения длины их траекторий (сценарий можно найти по адресу https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis) . Флуоресцентные точки считались одной и той же молекулой, если они находились в пределах 100 нм между кадрами, потому что мы не ожидаем увидеть более высокие коэффициенты диффузии для связанного h3B / CENP-A / CHD4.Молекулы все еще были связаны, если они не были обнаружены в течение 1 кадра, чтобы уменьшить вероятность того, что молекулы ненадолго упадут ниже порога отношения сигнал-шум. Траектории менее трех локализаций отбрасываются, чтобы снизить вероятность обнаружения шума. Средняя интенсивность этих траекторий была также извлечена для расчетов эффективности FRET — мы игнорируем первый и последний кадры, потому что молекула, возможно, не флуоресцирует на всех этих кадрах. Изображения одиночных молекул, представленные на рис.4 были сгенерированы с использованием Peak Fit, так что локализации представляют точность, с которой они были локализованы 69 . Точность локализации была рассчитана после анализа Rapidstorm путем подбора гистограммы парных расстояний до ближайших соседей 70 .

Для отслеживания живых клеток односвязанных молекул CHD4 эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 1 и один раз на Микроскопе 2. Мы снова решили проанализировать наборы данных с Микроскопа 1, записанные в тот же день, чтобы уменьшить систематические ошибки, возникающие из-за слегка отличающихся друг от друга микроскопов. выравнивания.Мы собрали 772 и 539 траекторий одиночных молекул из фильмов одиночных молекул, содержащих mEos3.2- и mEos3.2-JF 646 -меченые молекулы CHD4, соответственно (обычно в каждом фильме изучались две клетки). Учитывая, что 10–30% отдельных молекул mEos3.2 – JF 646 находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки для демонстрации наблюдаемых нами изменений.

Для анализа близости FRET белка CENP-A было собрано больше траекторий, потому что mEos3 относительно мало. Предполагалось, что молекулы с двумя метками будут находиться рядом с молекулами с меткой JF 646 . Эксперимент был воспроизведен один раз на Микроскопе 1 и дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных с Микроскопа 2, в котором мы собрали 17 953, 17 288 и 21 018 траекторий из фильмов с одной молекулой mEos3.2-CENP-A, mEos3 .2-CENP-A / JF 646 -CENPA и mEos3.2-CENP-A / JF 646 -h3B, соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре клетки). Учитывая, что ~ 0,1–1% mEos3.2 молекулы в присутствии помеченных JF 646 молекул находились во включенном состоянии дольше, чем отдельные молекулы mEos3.2, это подходящий размер выборки для демонстрации наблюдаемых нами изменений.

Для анализа близости h3B FRET эксперимент был воспроизведен дважды на Микроскопе 2, и мы проанализировали один из наборов данных, в которых мы собрали 2114 и 3970 траекторий из фильмов с одной молекулой PA-JF 549 -h3B и PA-JF. 549 -h3b / JF 646 -h3B соответственно (обычно в каждом фильме изучались четыре ячейки). Учитывая, что 10% молекул PA-JF 549 в присутствии молекул, помеченных JF 646 , находились во включенном состоянии более 1% от одиночных молекул PA-JF 549 , это подходящий размер образца. чтобы продемонстрировать наблюдаемые нами изменения. Траектории длиннее 1% одиночных молекул PA-JF 549 были идентифицированы и окрашены в синий цвет. Эффективность FRET рассчитывалась с использованием средней интенсивности молекул, меченных одним PA-JF 549 . Карты плотности шириной 2 пикселя (312 нм) были созданы, чтобы показать количество молекул, обнаруженных в пределах области, и была ли средняя длина трека ниже (желтый) или выше 12 с (синий), доверительный интервал 1% установлен таким образом, что существует 1% -ная вероятность того, что молекулы, помеченные PA-JF 549 , будут иметь длину трека более 12 с.

Доступность данных

Наборы данных, созданные и проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у авторов по запросу.

Доступность кода

Программное обеспечение, используемое для фотофизического анализа in vitro и отслеживания живых клеток, можно найти на https://github.com/TheLaueLab/blink-analysis и https://github.com/TheLaueLab/trajectory-analysis , соответственно. Другое используемое программное обеспечение включает микро-менеджер программного обеспечения с открытым исходным кодом (https://www.micro-manager.org), ImageJ64,65, Rapidstorm68 и PeakFit69.

Это хорошо? (Обновление 2021 года)

Сопрано-укулеле Kala KA-15S — одна из самых популярных бюджетных укулеле на рынке. С более чем 2000 5-звездочными отзывами на Amazon это явный фаворит публики, но подходит ли это вам?

Если вы торопитесь, ознакомьтесь с обзором ниже. В противном случае продолжайте чтение, чтобы получить полный обзор укулеле Kala KA-15S.

Для этого обзора я купил новый KA-15S онлайн. Мои впечатления основаны на уке «из коробки» без каких-либо доработок и корректировок.Все фотографии реального КА-15С, которые я использовал для этого обзора.

Я не знал, чего ожидать от KA-15S, но, проведя с ним некоторое время, я думаю, что этот уке представляет большую ценность и естественный выбор для любого ограниченного бюджета игрока.

KA-15S — это хорошо сделанная уке начального уровня, которая хорошо выглядит, великолепно звучит и на ней легко играть. Это хороший выбор для начинающих, ищущих респектабельного стартового уке, но это также отличный вариант для опытных музыкантов, которые ищут доступный второй инструмент.

KA-15S доступен в нескольких различных стилях, включая KA-15S-S с верхушкой из ели и KA-15S-h2 в гавайском стиле.

Обновление: KA-15C и KA-15T Concert and Tenor Ukes

В связи с популярностью KA-15S, Kala выпустила концертную и тенорную версию этой модели — KA-15C и KA-15T.

Эти большие размеры корпуса будут громче, полнее и, как правило, просто «больше» по звучанию, чем KA-15 размером с сопрано. Некоторым людям может быть удобнее играть на более длинных грифах на этих больших размерах.

Хотя я не играл в эти модели, я не понимаю, почему качество сборки будет отличаться для этих двух больших размеров.

Качество сборки

Kala заработала репутацию производителя отличных укулеле по доступной цене, и KA-15S не исключение.

KA-15S имеет чистый вид и плотный, прочный на ощупь. Качество сборки намного лучше, чем у дешевых уке, которые вы найдете в диапазоне от 20 до 40 долларов. На самом деле, я думаю, что качество изготовления лучше, чем у некоторых более дорогих предложений других брендов.

KA-15S — очень хорошо сконструированный уке за свои деньги, но очень важно иметь реалистичные ожидания от инструмента в этом ценовом диапазоне. Если вы купите один, рассчитывая на безупречное мастерство, вы можете быть разочарованы.

Для менее дорогих укулеле нередки неровности кромок, выдавливание клея, дефекты отделки и т. Д. Это просто компромиссы, на которые производители должны пойти, чтобы предложить инструмент по такой низкой цене.

Хотя качество изготовления на KA-15S на удивление хорошее для этой цены, оно не на 100% идеально.Важно то, что он хорошо играет и хорошо звучит, и это так!

Настройка и играбельность

Распространенной проблемой укешек начального уровня является то, что струны находятся слишком высоко над грифом. Это известно как «высокое действие» и, как правило, плохо по двум причинам:

  • На инструментах с высокой активностью играть сложнее
  • Высокое действие может привести к смещению нот, особенно при игре рядом с гайкой

Основываясь на моем опыте работы с другими недорогими укулеле, я, честно говоря, не ожидал многого от KA-15S, но должен признать, что был приятно удивлен тем, насколько хорошо укулеле играет прямо из коробки.

Действия были низкими и ровными, играть хотелось мечты. Когда я впервые получаю их, я обычно делаю небольшие корректировки во многих уке, но KA-15S не нуждалась в каких-либо настройках.

Играбельность была хорошей как вверх, так и вниз по грифу, я не испытал ни гудения, ни высоких ладов.

Тон

У KA-15S мягкий, теплый тон, который действительно застал меня врасплох. По сравнению с другими бюджетными укулеле сопрано, которые я пробовал, у KA-15S намного больше басов, громкости и резонанса.На самом деле, я играл на гораздо более дорогих уке, которые не так хорошо звучали.

Всегда будет предел тому, сколько звука может издавать крошечное сопрано уке, такое как KA-15S, но это маленькое уке очень впечатляет (особенно с учетом цены).

У многих бюджетных укеев тон тонкий, слабый и, как правило, «мертвый». Часто это связано с их тяжелой конструкцией, толстой отделкой и дешевыми струнами. Я думаю, что KA-15S избегает этих ловушек благодаря своей легкой конструкции, минимальной отделке и высококачественным струнам Aquila.

Покрытие

KA-15S имеет легкую матовую поверхность, которая придает укулеле красивый естественный вид. Вы можете видеть и чувствовать текстуру дерева, но на ощупь она остается гладкой. Хотя некоторые могут сказать, что отделка выглядит несколько «сырой», я думаю, что она выглядит великолепно. На мой взгляд, он намного лучше, чем толстая пластиковая отделка, которую можно найти на многих других бюджетных уке.

Светлая отделка также позволяет укулеле более свободно резонировать, что улучшает тон. Густое покрытие у других начинающих укэ может ослабить тон и сделать их мертвыми и жесткими.

Легкие солнечные лучи на корпусе, шее и грифе придают KA-15S настоящий характер. Мне нравится, как тонкие тени не перекрывают естественный вид древесины.

Розетка с лазерной гравировкой — еще один приятный штрих. Обычно я не без ума от работы с инструментом с помощью лазера, но минимальная розетка выглядит великолепно и украшает укулеле, не выходя за рамки.

Kala KA-15S Mahogany Soprano Ukulele
  • Kala KA-15S появилась в мире в 2005 году как ответ на высококачественную, доступную по цене укулеле начального уровня и до сих пор остается непревзойденной укулеле в своем классе.
  • KA-15S хорошо подходит для использования в классе, тренировок и акустических выступлений. Это инструмент, который выбирают в школах — больше людей учатся играть на каале, чем на любой другой укулеле.
  • Очень традиционная укулеле сопрано из красного дерева с атласной отделкой и ярким, теплым, насыщенным звуком.

Размер корпуса сопрано

Существует три основных размера укулеле: сопрано, концерт и тенор. KA-15S — укулеле размером с сопрано, которое является самым маленьким из трех размеров и имеет длину всего 21 дюйм.

Укулеле Soprano компактны и более доступны, чем укулеле большего размера, но их тон, как правило, немного более «звенящий» и сфокусированный на высоких частотах по сравнению с более крупными укулеле.

Это не значит, что сопрано укулеле звучит плохо. Как я уже упоминал ранее, KA-15S имеет отличный звук для недорогого сопрано уке. Однако у уке-сопрано, как правило, меньше басов, сустейна и громкости, чем у более крупных размеров, поэтому, если вам нужен более устойчивый тон, вы можете рассмотреть концерт или тенор.

Укулеле сопрано может быть немного сложнее играть людям с большими руками или толстыми пальцами. Это потому, что лады (металлические планки на грифе) расположены ближе друг к другу, поэтому на грифе остается меньше места для маневра. При этом многие игроки с большими руками адаптируются к меньшему грифу и могут играть на нем так же легко, как и на больших.

Если вы думаете, что вам может потребоваться больший размер, обратите внимание на более крупные модели KA-15C (концертный) или KA-15T (тенор).

Струны Aquila Nylgut

Как и все укулеле Kala, KA-15S поставляется с завода со струнами Aquila Nylgut.

Многие игроки на укулеле согласны с тем, что струны Aquila Nylgut являются одними из лучших по звучанию для укулеле, которые вы можете получить. У них теплый, сладкий, похожий на арфу тон, они улучшат звучание практически любого инструмента.

Тюнеры

KA-15S поставляется с базовыми тюнерами открытого типа. Они плотные и точные, это все, что вам действительно нужно от тюнинг-машины.

Многие уке в этом ценовом диапазоне имеют тюнеры с дешевыми пластиковыми шайбами ​​вокруг стоек тюнера, которые некрасивы и имеют тенденцию дребезжать.Металлические шайбы (более известные как люверсы) на KA-15S — еще один приятный штрих, который вы обычно не увидите в бюджетном уке.

Читая отзывы покупателей о KA-15S, вы можете столкнуться с жалобами на то, что уке не всегда в тонусе. Эти комментарии сводят меня с ума, потому что они не имеют ничего общего с настройщиками — это на самом деле струны!

Струны для укулеле по своей конструкции очень мягкие и эластичные. У них есть длительный период «успокоения», когда струны нужно будет настраивать снова и снова, пока они не стабилизируются.Вы можете узнать больше об этом в моей статье о том, почему новая укулеле не всегда в гармонии.

NuBone Гайка и седло

KA-15S имеет гайку и седло, изготовленные из материала под названием NuBone. Это твердый и плотный синтетический материал, который идеально подходит для струнных инструментов.

У многих недорогих укулеле есть пластиковые гайки и седла. Пластик дешев, но он относительно мягкий и плохо передает вибрацию струны на верхнюю часть инструмента.

Это одна из областей, где Кала, вероятно, могла бы «удешевить», чтобы многие люди этого не заметили. На мой взгляд, тот факт, что они предпочли качество дополнительной паре долларов, говорит о многом.

GraphTech, компания, производящая NuBone, также поставляет гайки и седла ведущим компаниям, таким как Martin, Taylor, Gibson, Godin и другим.

Лады

Учитывая цену, лады у КА-15 очень хорошие. Лады были красиво отделаны и не выступали за гриф, что может быть проблемой для менее дорогих уке.Я также не заметил ни высоких, ни низких ладов — еще одной распространенной проблемы с инструментами начального уровня.

Лады КА-15С латунные. Хотя латунь — плохой материал для гитарных ладов, струны укулеле настолько мягкие, что, вероятно, потребуются годы, прежде чем вы заметите какой-либо износ лада.

Kala KA-15S против KA-S против Makala MK-S

Kala производит два других уке-сопрано, очень похожих на KA-15S: KA-S и Makala MK-S.

У меня есть все три модели, и все они отличные уке для начинающих.Тем не менее, я считаю, что KA-15S — это лучшая общая цена. И вот почему:

  • KA-S стоит примерно на 20 долларов больше, чем KA-15S, и не добавляет ничего, кроме белой окантовки по краям корпуса.
  • MK-S примерно на 5 долларов меньше, чем KA-15S, но я не думаю, что стоит экономить эти деньги из-за тюнеров более ранней версии и дешевых пластиковых гайки и седла.

Вот ссылки Amazon, если вы хотите узнать больше:

Заключительные мысли

Тем, кто покупает качественный уке для начинающих по разумной цене, будет сложно найти лучший выбор, чем KA-15S.Качество сборки, играбельность и звук лучше, чем у многих других уке, которые я пробовал в этой ценовой категории.

Хотя я могу порекомендовать KA-15S без колебаний, музыканты, которые ищут более мощный звук или немного более удобную игру, могут захотеть рассмотреть более крупные модели KA-15C (концертный) или KA-15T (тенор).

Дополнительные ресурсы

Удачи в Бруклине: у Dont Fret есть лотерейные билеты!

«О боже, я буду жаждать шумов» — Карл Сэндберг

«Мир искусства всегда казался мне лотереей», — говорит Дон Фрет, рисует одного из своих явно странных и сказочно посредственных персонажей блестящая золотая скретч-карта из углового винного погреба.

Не волнуйтесь. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником)

Начало 2020 года начинается с одноименной новой книги «Жизнь так далеко» и месячное пребывание в Bed Stuy Artist Residency, вы можете подумать, что улица Чикаго юморист выиграл Powerball.

Не волнуйтесь. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником)

«В рамках своей резиденции в Нью-Йорке я участвую в ежегодной лотерее DF», — говорит он. о новой коллекции индивидуальных лотерейных карт, которые он покажет на прием для вас, который он принимает в этом коричневом камне. Dont Fret говорит, что он надеюсь, тебе тоже повезет.

Не волнуйтесь. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником)

«Художники ждут своего большого перерыва, коллекционеры ищут «Возможность для инвестиций» — как в гостиной, так и в записи банан к стене просто привлекает к вам много внимания и является достойным источником калий », — говорит он.

Запомните дату этого особого события, 30 , где художник будет рад встретиться с вами и показать вам эти стикеры и другие проекты.Он также подпишет копии своей новой книги вместе со Стивеном из BSA. П. Харрингтон, написавший к ней введение.

Не волнуйтесь. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником)

«Каждый билет подписан и пронумерован», — говорит Дон Фрет. «30 января Будет проведена лотерея розданных билетов, и будут выбраны 2 победителя. Бегун вверх выиграет подписанный экземпляр моей книги «Жизнь так далеко» и получит ГРАНД-призера выиграет оригинальную картину с моей выставки в Нью-Йорке «О Боже, есть Шумы. Я буду голодать до новой работы ».

Не волнуйтесь. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником) Dont Fret. BedStuy Art Residency. (фото любезно предоставлено художником)

Другие статьи, которые могут вам понравиться от BSA:

Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматического анализа изображений

Abstract

Генетически закодированные биосенсоры, основанные на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET), широко применялись для изучения пространственно-временной регуляции молекулярной активности в живых клетках с высоким разрешением.Эффективная и точная количественная оценка большого количества данных изображений из этих одноклеточных измерений FRET требует надежного и автоматизированного анализа данных. Однако нелинейное движение живых клеток представляет собой огромную проблему для решения этой задачи. Основываясь на регистрации изображения движения отдельной клетки, мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания и количественной оценки сигналов FRET в определенных пользователем субклеточных областях. Кроме того, субклеточные пиксели были классифицированы в соответствии с их связанными сигналами FRET и динамикой анализируемых кластеров.Результаты показали, что индуцированное EGF снижение активности RhoA в мигрирующих клетках HeLa значительно меньше, чем в неподвижных клетках. Более того, активность RhoA поляризована в мигрирующих клетках с градиентом полярности, ориентированным в противоположном направлении миграции клеток. Напротив, отсутствует постоянное предпочтение полярности RhoA среди стационарных клеток. Таким образом, наши методы анализа изображений могут предоставить мощные инструменты для высокопроизводительного и систематического исследования пространственно-временной молекулярной активности в регулировании функций живых клеток с их формами и положением, непрерывно меняющимися во времени.

Образец цитирования: Eichorst JP, Lu S, Xu J, Wang Y (2008) Дифференциальная динамика RhoA в мигрирующих и стационарных клетках, измеренная с помощью FRET и автоматического анализа изображений. PLoS ONE 3 (12): e4082. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082

Редактор: Терри Минс, Массачусетская больница общего профиля / Гарвардский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 6 ноября 2008 г .; Одобрена: 26 ноября 2008 г .; Опубликован: 30 декабря 2008 г.

Авторские права: © 2008 Eichorst et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана отделом биоинженерии Иллинойского университета, Урбана-Шампейн, Фондом Уоллеса Х. Култера, Beckman Laser Institute Inc., грантом NSF 08-00870 и грантом NIH NS- 063405. Финансирующие агентства не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Введение

Миграция клеток играет важную роль в эмбриональном развитии, восстановлении тканей, инвазии рака и атеросклерозе [1]. Это высокоинтегрированный процесс, модулируемый множеством сигнальных путей, состоящий из расширения цитоскелета и образования фокальных комплексов спереди, а также разборки фокальной адгезии и сокращения цитоскелета сзади [1].Семейство малых Rho GTPases играет ключевую роль в регуляции актинового цитоскелета и, следовательно, миграции [1] — [3]. Эти GTPases функционируют как молекулярные переключатели в клетке, чередуя активные GTP-связанные и неактивные GDP-связанные состояния, опосредованные факторами обмена гуаниновых нуклеотидов (GEFs) и белками, активирующими GTPase (GAP), соответственно [1] — [4]. Среди известных представителей малых Rho GTPases, таких как RhoA, Rac1 и Cdc42 [2], [3], RhoA, как сообщается, опосредует сборку сократительных актомиозиновых филаментов в задней части мигрирующих клеток через один из его нижележащих эффекторов, ROCK [3] — [5]. Таким образом, было высказано предположение, что активность RhoA может концентрироваться в хвосте мигрирующих клеток [3]. Однако при использовании биосенсоров, основанных на резонансном переносе энергии флуоресценции (FRET) [6], недавно было обнаружено удивительно высокая активность RhoA, которая присутствует не только в хвосте, но также и в передней части мигрирующих клеток [7], [8]. Эти результаты предполагают, что RhoA может выполнять разные функции в разных субклеточных местоположениях.

FRET — это явление квантовой механики. Когда два флуоресцентных белка (FP), донор и акцептор, находятся рядом с благоприятной ориентацией, возбуждение донорного FP может вызвать излучение от акцептора [9].FRET позволил разработать множество биосенсоров, способных обнаруживать молекулярную активность или белок-белковые взаимодействия в живых клетках [10], [11]. Два биосенсора RhoA на основе FRET были разработаны для визуализации пространственно-временной динамики активности RhoA в живых клетках [7], [12]. Группа Мацуда разработала биосенсор RhoA (Raichu-RhoA), который содержит RhoA (аминокислота 1–189), гибкий линкер и RhoA-связывающий домен (RBD) из его молекулы субстрата PKN, соединенный между голубым и желтым флуоресцентным светом. белок (CFP и YFP) [12].Активация RhoA может вызвать внутримолекулярное связывание между RhoA и доменом RBD в биосенсоре. Результирующее конформационное изменение может приблизить CFP и YFP и усилить сигналы FRET. Биосенсор Raichu-RhoA позволяет отслеживать активность RhoA во время деления клеток, поляризации и обмена фокальной адгезии в различных клетках [8], [12] — [15]. Другой биосенсор FRET RhoA был независимо разработан, содержащий последовательно полноразмерный RhoA, CFP, гибкий линкер, YFP и домен RBD ротекина [7].Этот биосенсор также успешно применялся для изучения различных клеточных функций, включая миграцию и полярность во время хемотаксиса [7], [16], [17].

Несмотря на то, что разработка биосенсоров FRET значительно расширила наши знания о передаче сигналов в живых клетках, огромное количество данных визуализации, производимых этими биосенсорами, требует автоматических, интеллектуальных и объективных инструментов анализа изображений, позволяющих точно и эффективно интерпретировать биологическую информацию [ 18]. В частности, очень необходимы эффективные алгоритмы для отслеживания движения ячеек и учета различий в форме и геометрии отдельных ячеек.

Регистрация изображений широко применяется в технике и науке для автоматического отслеживания движущихся объектов во времени и для нахождения пиксельного соответствия между двумя изображениями похожих объектов [19], [20]. При анализе изображений живых клеток этот метод использовался для выравнивания, посредством простого переноса и вращения, флуоресцентных изображений на разных длинах волн [21] — [23] и изображений ядра в разные моменты времени одной и той же клетки [24]. Его также применяли для отслеживания флуоресцентных частиц внутри клеток [25].Более сложные методы регистрации изображений также применялись для анализа экспрессии генов in situ в мозге мыши [20]. Другие методы количественной оценки были разработаны для изучения распределения белка и полярности молекулярной активности путем разделения всей клетки на небольшие клинья в полярно-скоординированной системе [23], [26] — [28], чтобы изучить подвижность и энергию одиночных сперматозоидов путем отслеживания и улавливания [29], [30] или для извлечения данных о трехмерной анатомии сосудов [31]. Тем не менее, автоматическая регистрация движущихся клеток изображения целой клетки с помощью пиксельного отслеживания по-прежнему остро нуждается в высоком разрешении и эффективном количественном анализе молекулярных сигналов в пространстве и времени.

В этой статье мы разработали автоматизированные методы анализа изображений для отслеживания движения отдельных клеток и количественной оценки сигналов FRET в субклеточных регионах с использованием биосенсора RhoA от доктора Мацуда [12]. Пространственно-временные паттерны активации RhoA анализировали в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa в ответ на стимуляцию фактором роста. Наши результаты предполагают, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках подавлялась в ответ на стимуляцию факторами роста в меньшей степени, чем в стационарных клетках.Активность RhoA была более сконцентрирована в противоположном направлении миграции в мигрирующих клетках, но не проявляла предпочтения в стационарных клетках.

Материалы и методы

Клеточные линии и культура

Клетки

HeLa (ATCC, Манассас, Вирджиния) культивировали в увлажненном 95% -ном воздухе, 5% -ном CO. 2 инкубаторе при 37 ° C. Культуральная среда представляла собой среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 ед. / Мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия.Реагенты для клеточных культур были получены от Invitrogen (Сан-Диего, Калифорния).

Переходная трансфекция и микроскопическая визуализация

Поскольку биосенсор Raichu-RhoA может быть легко трансфицирован и хорошо охарактеризован для клеток HeLa, мы использовали этот биосенсор для визуализации динамики активности RhoA в клетках HeLa на стекле, покрытом фибронектином [12]. Биосенсор Raichu-RhoA трансфицировали в HeLa с помощью липофектамина (Invitrogen) [12] перед голоданием с 0,5% FBS в течение 36–48 часов.Затем клетки суспендировали в трипсин-EDTA и высевали на покрытые фибронектином чашки со стеклянным дном на 3-6 часов перед стимуляцией EGF (50 нг / мл). Во время визуализации клетки содержали в CO 2 -независимой среде без сыворотки (Invitrogen) при 37 ° C. Объективный фокус был направлен около базальной стороны клетки. Изображения были получены с помощью аксиовертного инвертированного микроскопа Zeiss с фильтром возбуждения 420DF20, дихроичным зеркалом 450DRLP, двумя фильтрами излучения, управляемыми устройством смены фильтров (480DF30 для CFP и 535DF25 для YFP) и охлаждаемой камерой устройства с зарядовой связью (Cascade 512B; Фотометрия).Интенсивность возбуждающего света контролировалась регулируемыми фильтрами нейтральной плотности для обеспечения минимального фотообесцвечивания во время визуализации. Из изображений интенсивности флуоресценции CFP и YFP вычитали фон. Изображения отношения FRET были рассчитаны путем вычисления пиксельного отношения CFP / YFP для представления активности RhoA в пространстве и времени с использованием программного обеспечения MetaFluor 6.2 (Universal Imaging) или наших специализированных программ, разработанных в MATLAB (MathWorks).

Регистрация изображения

Для автоматической регистрации покадровых изображений движущейся клетки мы сопоставили эти изображения клеток с единичным диском, который служил эталонным изображением как для регистрации последовательности покадровых изображений той же самой клетки, так и для сравнения между ними. разные клетки различной формы.Чтобы отобразить ячейку на единичный диск, потребовалось четыре шага. Сначала с помощью сегментации определяли тело клетки. Во-вторых, контрольные точки на ячейке были вычислены путем триангуляции Делоне выпуклой оболочки тела ячейки. В-третьих, контрольные точки были сопоставлены с эталонным изображением (единичным диском) путем вычисления относительного положения точек в выпуклой оболочке. Наконец, ячейки были отображены в единичный диск с помощью кусочно-линейного преобразования [32], определяемого контрольными точками и триангуляцией Делоне (рисунок 1).

Рис. 1. Диаграммы, изображающие алгоритм отслеживания региона.

(A) Центроид ячейки ( C ), контрольная точка ( P ) и граница пересечения на выпуклой оболочке ( E , на левом изображении) использовались для вычисления относительного расстояния и ориентация вектора, указывающего от центроида до контрольной точки. ( r , θ ) — полярные координаты точки на единичном диске ( P ‘), соответствующей контрольной точке ( P ) в изображении ячейки (правое изображение). (B) Процесс регистрации показан слева направо. Сначала ячейка разбивается на треугольную сетку внутри ее границы. Во-вторых, сетка была сопоставлена ​​с единичным кругом путем вычисления относительного расстояния и ориентации векторов, указывающих от центроида до узлов сетки (или контрольных точек). Наконец, контрольные точки и изображение ячейки были отображены на единичный диск с помощью кусочно-линейной интерполяции внутри треугольной сетки. (C) Верхние панели показывают изображения отдельной клетки, подвергающейся расширению или перемещению, с выбранной областью интереса в первом кадре.На нижних панелях показаны единичные диски, преобразованные из ячейки в разные моменты времени. Граница преобразованной области интереса в первом кадре используется для отслеживания и количественной оценки сигналов из одной и той же области на этих различных единичных дисках.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g001

Метод Оцу [33] был использован для вычисления порога интенсивности для сегментации тела клетки, потому что флуоресцентные изображения, записанные с помощью биосенсора RhoA, были яркий и легко отделяемый от фона. Список узлов, очерчивающих контур клетки, был сформирован на основе идентифицированного тела клетки. Таким образом, внутри контура было создано изображение маски, представляющее форму ячейки. Изображения, собранные из канала YFP, использовались для обнаружения края ячейки и маски, поскольку они были ярче, чем изображения из канала CFP.

Чтобы зафиксировать форму ячейки единичным диском без неоднозначности, требуется, чтобы форма ячейки была выпуклой. Поэтому выпуклая оболочка, описывающая изображение маски ячейки, была вычислена [34] и использована в качестве границы для вычисления триангуляции Делоне [35].Затем узлы триангуляции использовались в качестве контрольных точек для изображения ячейки. Для каждой контрольной точки на изображении ячейки соответствующая контрольная точка в единичном диске была рассчитана на основе ее относительного положения в выпуклой оболочке. Вкратце, центроид ячейки () был сопоставлен с центром единичного диска () (рис. 1А). Для любой другой контрольной точки (), соответствующая точка на единичном диске, была рассчитана на основе относительного положения точки между центроидом и краем выпуклой оболочки. Предположим, есть полярные координаты () с центром в центре тяжести; и луч от до пересекает край выпуклой оболочки в точке. Тогда полярные координаты соответствующей точки () в единичном круге задаются выражением () с центром в, где представляет относительное расстояние от до, т.е. (Рисунок 1A – B). И наоборот, любая точка в единичном диске может быть отображена обратно в разные ячейки или в одну и ту же ячейку с разными формами в разные моменты времени.

Выпуклая оболочка всей ячейки отображалась на единичный круг кусочно-линейным преобразованием [32].Внутри каждого треугольника в триангуляции Делоне преобразование является линейным и однозначно определяется тремя контрольными точками, которые являются узлами треугольника (рисунок 1B). Преобразование также непрерывно на краях, общих для двух треугольников.

Отслеживание областей интереса (ROI)

Чтобы отслеживать интересующие области, покадровые изображения одной клетки сначала преобразовывались в серию единичных дисков. Затем пользователь выбрал и определил одну или несколько областей интереса на первом изображении ячейки.После этого была сгенерирована маска для области интереса и сопоставлена ​​с первым единичным диском с помощью нашего метода регистрации изображений. Для отслеживания среднего сигнала FRET в этой области предполагалось, что маска области интереса на единичном диске остается в том же месте во времени (рис. 1C). Таким образом, одна и та же маска может быть применена ко всем единичным изображениям диска для отслеживания и расчета временного хода среднего отношения FRET в выбранной области (ах), которое было вычислено путем взятия отношения общей интенсивности CFP и YFP в пределах области. (s) в ячейке (рисунок 1C).Предположение о постоянных областях интереса в дисках эталонных единиц является точным, если клетки перемещаются только в плоскости изображения или сжимаются / расширяются в радиальных направлениях, идущих от центроида. Предполагалось, что клетки не будут вращаться вокруг своих центроидов в ходе эксперимента. Эти предположения являются разумными для клеток с медленной миграцией в пределах временного окна наших экспериментов и согласуются с моделью градиентного радиального расширения (GRE) [36], где ожидается, что клетки будут вытягивать или втягивать свои ламеллиподии локально перпендикулярно краю клетки и вдоль актиновые волокна.

Области интереса на эталонном единичном диске были сопоставлены с исходными изображениями ячеек, чтобы визуально подтвердить, что они действительно могут отслеживать реальную область в мигрирующих ячейках (рис. 1С). Для повышения эффективности вычислений только узлы, очерчивающие ROI на единичном диске, но не всю маску, были преобразованы обратно в изображения ячеек.

Кластерный анализ

Чтобы изучить геометрические особенности субклеточных регионов со сходными уровнями активности RhoA, пиксели изображения клетки были классифицированы и разделены на шесть кластеров в соответствии со значениями их отношения RhoA FRET.Функция MATLAB kmeans использовалась для классификации пикселей в различные кластеры путем минимизации вариации значений FRET внутри кластера [37], [38]. В результате каждый кластер содержал пиксели с одинаковыми значениями отношения FRET.

Программы MATLAB, реализующие эти функции, можно получить, написав соответствующему автору этой статьи.

Результаты

Регистрация изображения

В ходе экспериментов наблюдались два класса клеток HeLa со значительно различающимися паттернами миграции: мигрирующие и стационарные.Чтобы определить, была ли клетка HeLa мигрирующей или неподвижной, местоположение ее центроида отслеживалось во времени. Наибольшее расстояние, пройденное центроидом от исходного положения, было разделено на сумму расстояний, пройденных на каждом временном шаге в течение примерно 60 минут в каждом эксперименте. При соотношении больше или равном 0,5 клетка считалась мигрирующей. В противном случае ячейка считалась стационарной. Результаты подтвердили, что четко существует два класса клеток HeLa с соотношением расстояний 0.71 и 0,1867 (таблица 1). Направление миграции каждой мигрирующей клетки можно определить по траектории ее центроида путем линейной аппроксимации.

С помощью нашего метода регистрации изображений, внутриклеточная активность RhoA при стимуляции фактора роста может быть визуализирована в рамках единой рамки эталонного изображения (рис. 2). Активность RhoA была высокой как на переднем, так и на заднем крае мигрирующих клеток (Рисунки 2A – 2B). Это подтвердило, что RhoA вносит вклад в удлинение актиновых филаментов и взъерошивание мембран на фронте клетки посредством mDia, тогда как регулирует сократимость актомиозина в задней части клетки [2].И в мигрирующих, и в неподвижных клетках можно четко наблюдать пространственные паттерны двух концентрических кольцеобразных субклеточных структур с высокой активностью RhoA (Figure 2 и Movie S1). Внешнее кольцо с высокой активностью RhoA может отражать возникающую и динамическую активацию интегрина при активности RhoA [39]. Высокая активность RhoA во внутреннем кольце может указывать на относительно высокий стресс, возникающий в конвергентной зоне, где ретроградный поток актина ламеллы встречается с антероградным потоком актина тела клетки [40]. Несмотря на эти отличительные субклеточные особенности, общая активность RhoA как мигрирующих, так и немигрирующих клеток HeLa снижалась после стимуляции EGF (Рисунок 2 и Movie S1). Оказывается, что после стимуляции EGF активность RhoA оставалась относительно стабильной в задней части мигрирующих, но не стационарных клеток (рис. 2В и Movie S1).

Рис. 2. Изображения FRET и их преобразованные карты на единичных дисках биосенсора Raichu-RhoA (Venus / ECFP) в мигрирующих и неподвижных клетках.

Панель (A) показывает последовательность покадровых изображений FRET для репрезентативной мигрирующей клетки HeLa. Белая стрелка указывает направление миграции. Панель (B) показывает изображения FRET мигрирующей клетки в (A), преобразованные в единичный диск. Пространственно-временная динамика изображений FRET движущейся клетки HeLa также показана в фильме S1. Панель (C) показывает последовательность покадровых изображений FRET для репрезентативной стационарной клетки HeLa. Панель (D) показывает изображения FRET неподвижной ячейки в (B), преобразованные в единичный диск.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g002

Отслеживание областей интересов

Для отслеживания и количественной оценки локальной активности RhoA в субклеточных регионах в клетках HeLa было выбрано четыре ROI как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках. Четыре области интереса в мигрирующих ячейках охватывают переднюю, заднюю и две стороны ячейки (рис. 3А и ролик S2). Поскольку область интереса может выходить за пределы тела ячейки (рис. 3A, область 1), пороговое значение изображения YFP ячейки использовалось для оценки и вычисления сигнала FRET в части области интереса внутри тела ячейки.Таким образом, средние отношения FRET в пределах каждой области интереса мигрирующих клеток в различные моменты времени были рассчитаны для мониторинга динамической активности RhoA в субклеточных местах (рис. 3B). Оказалось, что активность RhoA во всех четырех областях сразу упала и немного восстановилась после стимуляции EGF. Затем местная активность RhoA непрерывно снижалась в регионах на передовой и с обеих сторон. Однако в области рядом с задним краем мигрирующей клетки активность RhoA оставалась относительно постоянной без значительного подавления после стимуляции EGF (фиг. 3B).Это характерная особенность для различных проанализированных мигрирующих клеток. В результате разница между активностью областей интереса вблизи передней и задней части ячейки показала значительное увеличение для мигрирующих клеток. Это открытие подтверждает предыдущее исследование, что высокая активность RhoA важна в обеспечении сокращения хвоста мигрирующих клеток [2].

Рисунок 3. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных областях интереса мигрирующей клетки HeLa.

(A) Слева: в первом кадре были выбраны четыре области интереса для мониторинга активности RhoA на передней, задней и двух сторонах мигрирующей ячейки.Справа: вычисленные контуры и расположение областей интереса в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. Покадровые изображения автоматически отслеживаемых областей интереса также показаны в фильме S2. (B) Временные зависимости соотношений FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем областям интереса, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g003

В стационарных ячейках, поскольку ячейки не двигались значительно, позиции ROI оставались относительно неизменными во времени (рисунок 4A).Активность RhoA во всех четырех регионах сразу упала и немного восстановилась, прежде чем продолжить снижение после стимуляции EGF. В отличие от субклеточных различий активности RhoA, наблюдаемых в мигрирующих клетках, активность RhoA во всех четырех областях интереса стационарных клеток, по-видимому, снижалась с аналогичной кинетикой при стимуляции EGF (фиг. 4).

Рисунок 4. Отслеживание и анализ активности RhoA в различных областях интереса стационарной клетки HeLa.

(A) Слева: в первом кадре были выбраны четыре области интереса для отслеживания активности RhoA на передней, задней и двух сторонах стационарной ячейки.Справа: вычисленные контуры и расположение областей интереса в ячейке в разные моменты времени на основе нашего алгоритма отслеживания. (B) Временные зависимости соотношений FRET биосенсора Raichu-RhoA, усредненные по четырем областям интереса, показанным на (A).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g004

Из-за относительно стабильной активности RhoA в хвосте мигрирующих клеток при стимуляции EGF ожидалось, что глобальная активность RhoA в мигрирующих клетках будет снижаться медленнее. чем у стационарных ячеек.Следовательно, мы количественно оценили глобальную активность биосенсора RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках, взяв среднее значение активности RhoA во всех четырех областях интереса и нормализовав в соответствии с их соотношениями до EGF. Результаты подтвердили, что активность RhoA снижается как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках после EGF, с более медленной скоростью в мигрирующих клетках, чем в неподвижных клетках (фиг. 5). Разница между нормализованными соотношениями биосенсора RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках стала статистически значимой через 13–26 минут после стимуляции EGF (рис. 5), что соответствует времени, когда активность RhoA в хвосте мигрирующих клеток начала показывать разницу. из других субклеточных регионов (~ 25 минут после EGF на рисунке 3B).Эта разница между мигрирующими и неподвижными клетками продолжала увеличиваться во времени после стимуляции EGF (рис. 5). Эти результаты показывают, что активность RhoA в мигрирующих клетках после стимуляции EGF подавляется по-разному, чем в неподвижных клетках, возможно, из-за относительно высокой активности RhoA в задней части мигрирующих клеток после стимуляции EGF.

Рисунок 5. Глобальная активность RhoA в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa в разные моменты времени до и после стимуляции EGF.

Активность RhoA, усредненная по четырем областям интереса, охватывающим все тело клетки, была использована для представления глобальной активности RhoA. Столбики ошибок представляют стандартную ошибку, а звездочками отмечены моменты времени, когда средние активности RhoA значительно различались (t-тест, p <0,05) между мигрирующими и неподвижными клетками.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g005

Кластерный анализ

Мы дополнительно изучили геометрические особенности субклеточных областей с относительно высокой активностью RhoA после стимуляции EGF.Внутриклеточные пиксели изображения FRET были разделены на шесть кластеров в соответствии с их значениями отношения FRET. Как показано на рисунке 6A, пиксели изображения были закодированы по цвету в зависимости от кластера, которому они принадлежат, в порядке от синего к красному в соответствии со средним соотношением RhoA FRET в каждом кластере в диапазоне от низкого до высокого. Были отобраны три верхних кластера с наивысшим соотношением FRET и проведен мониторинг для изучения распределения высокой активности RhoA и их влияния на поведение клеток, например миграция (рисунки 6 и ролик S3).Программа MATLAB была разработана для автоматического выбора и количественной оценки площади этих регионов (рисунок 6). Результаты показали, что размер области этих выбранных областей увеличивается со временем после стимуляции EGF, особенно в задней части мигрирующих клеток (рис. 6C). Чтобы количественно проанализировать размер этих областей с высокой активностью RhoA, была установлена ​​полярная система координат с центром в центроиде каждой клетки. Затем ячейка была разделена на 18 угловых клиньев с шагом 20 ° (Рисунок 6B).Было вычислено количество пикселей во всем секторе,, а также количество пикселей в трех кластерах с высоким RhoA в секторе. Нормализованное количество пикселей в каждом сегменте рассчитывалось с использованием отношения. Нормализованное количество пикселей в каждом клине наносили на график в зависимости от угла клина, чтобы представить полярность активности RhoA. Как показано на фиг. 6D, эта кривая полярности репрезентативной мигрирующей клетки HeLa в разные моменты времени ясно демонстрирует повышенную пространственную полярность RhoA, инициированную стимуляцией EGF.Пиксели с относительно высокой активностью RhoA, по-видимому, накапливались в области, противоположной направлению миграции, примерно под 220 ° в координатах на Фигуре 6B.

Рисунок 6. Кластерный анализ активности RhoA в репрезентативной мигрирующей клетке.

(A) Шесть субклеточных областей с различными активностями RhoA были вычислены с использованием кластерного анализа K-средних. Эти области имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностями RhoA, причем холодные и горячие цвета указывают на низкий и высокий уровни активности RhoA соответственно.Направление миграции указано белой стрелкой. (B) Выбраны и продемонстрированы три области с наивысшими отношениями RhoA FRET из панели (A). Белые пунктирные линии очерчивают клин в ячейке. Система координат, используемая для полярного анализа, показана в правом нижнем углу. (C) Покадровые изображения, показывающие три кластера с высоким соотношением FRET до и после стимуляции EGF. На вставке выделено положение кластера с самым высоким соотношением FRET, который обычно находится на самом краю ячейки.(D) Ячейка была разделена на 18 клиньев, как показано на панели (B). Число пикселей в трех кластерах с наивысшим соотношением FRET в каждом секторе было нормализовано путем деления общего количества пикселей сектора. Это нормализованное количество пикселей с высоким FRET на клин нанесено на график в зависимости от угла клина. Динамическое поведение автоматически обнаруженных кластеров также показано в Movie S3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g006

Аналогичный кластерный анализ был проведен на стационарных ячейках.Репрезентативная стационарная сота с шестью кластерами имеет цветовую кодировку в соответствии с соотношением FRET и изображена на рисунке 7A, причем три самых высоких кластера и их покадровые изображения показаны на рисунках 7B и 7C соответственно. Нормализованное количество пикселей клина под разными углами было количественно определено и нанесено на график в зависимости от угла на рисунке 7D. Результат указывает на отсутствие значительного процесса поляризации при стимуляции EGF в неподвижных клетках.

Усредненные результаты полярности для нескольких мигрирующих клеток были рассчитаны путем выравнивания их направления движения к одному и тому же углу. Через 52 минуты после EGF нормализованное количество пикселей с высокой активностью RhoA в каждом угловом клине четко отображало поляризованный узор, при этом большее количество пикселей накапливалось в задней части мигрирующих клеток (рис. 8A). Напротив, распределение областей с более высокой активностью RhoA оказалось более случайным в стационарных клетках (фиг. 8B). Все эти результаты предполагают, что поляризация активности RhoA в клетках HeLa играет важную роль в регулировании миграции клеток и ее направлений.

Рисунок 8.Сравнение субклеточного распределения активности RhoA между неподвижными и мигрирующими клетками после стимуляции EGF.

Нормализованное количество пикселей с высоким FRET в каждом клине нанесено на график в зависимости от угла клина для множества (A) мигрирующих и (B) неподвижных клеток через 52 минуты после стимуляции EGF. Планки погрешностей представляют собой значения стандартной ошибки. Мигрирующие клетки вращали и выравнивали так, чтобы они имели одинаковое направление миграции. Передняя и задняя стороны направления миграции определялись относительным расположением клиньев по отношению к их соответствующим центроидам.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.g008

Обсуждение

Недавнее развитие технологий визуализации живых клеток предоставило множество мощных инструментов и позволило собрать огромное количество данных изображения / фильмов, что требует значительного времени и усилий для анализа и количественной оценки изображений. Однако не хватает удобных и автоматизированных инструментов анализа изображений с высокой пропускной способностью. Мы разработали алгоритмы и методы анализа изображений, основанные на регистрации изображений, для отслеживания сложного движения мигрирующих клеток.Эти методы применялись для автоматического отслеживания и количественной оценки замедленного отношения FRET биосенсора Raichu-RhoA в субклеточных областях в живых клетках HeLa, а также для анализа полярности внутриклеточных областей с высокой активностью RhoA. Результаты свидетельствуют о том, что субклеточное распределение высокой активности RhoA по-разному регулируется в мигрирующих и неподвижных клетках. Эти методы также могут применяться для анализа общих флуоресцентных изображений сигнальной трансдукции в живых клетках и обеспечения автоматизированной, эффективной и объективной количественной оценки большого количества данных визуализации.

Представленные в статье методы анализа изображений полностью автоматизированы. Поскольку ROI автоматически отслеживались в движущихся ячейках, пользователям нужно только определить начальные интересующие области на первом изображении ячейки. Для каждого кадра с четырьмя областями интереса требуется несколько секунд для количественной оценки отношения FRET с помощью персонального компьютера. Автоматизация этого вида анализа имеет решающее значение, поскольку на текущем этапе большая часть анализа данных для визуализации FRET живых клеток выполнялась вручную с контурами ROI, перемещаемыми биологом, если клетка перемещается или меняет форму. Это ручное отслеживание ROI для живых клеток может привести к низкой эффективности, утомительности и неточности. С нашим методом анализа отслеживание в целом очень надежно, если области интереса были выбраны внутри тела ячейки и вдали от края ячейки. Поскольку выпуклая оболочка или контур ячейки, но не фактический край ячейки, были сопоставлены с единичным диском, этот метод стал бы менее точным, если бы область интереса была близка к некоторым краям ячейки, которые меняют свою форму с вогнутой на выпуклую. Дальнейшее совершенствование метода автоматического отслеживания потребует разработки и реализации более сложного алгоритма регистрации изображений.Тем не менее преобразование различных ячеек в единую схему, такую ​​как единичный диск, должно быть полезным и важным для стандартизации и сравнения сигналов от каждой отдельной ячейки.

Применение нового метода кластерного анализа полезно для анализа и количественной оценки субклеточного распределения и полярности активности RhoA. Абсолютное значение активности RhoA не показывало очевидной картины полярности. Однако наблюдалось значительное увеличение количества пикселей с относительно более высокой активностью RhoA в хвосте мигрирующих клеток после стимуляции EGF, о чем свидетельствует количественная оценка с использованием автоматического кластерного анализа (фигура 6D).Это высококоординированное распределение активности RhoA в пространстве, вероятно, может вносить вклад и контролировать направление миграции клеток. Концентрированное накопление высокой активности RhoA в задней части клетки может помочь отделению клеточного хвоста от субстрата во время миграции [41], возможно, за счет активации нижестоящей молекулы ROCK, которая контролирует фосфорилирование киназы легкой цепи миозина (MLCK) и фосфатазы ( MLCP) для регуляции сократимости актомиозина [5]. Ингибированная активность RhoA в направлении миграции клеток может приводить к активации Rac1 [42], небольшой GTPase, контролирующей выпячивание клеток и образование ламеллиподий [43]. Таким образом, клетки могут скоординированно перемещаться в направлении, противоположном полярности RhoA.

Сравнение результатов для мигрирующих и неподвижных клеток выявило различные пространственные паттерны активности RhoA в этих двух типах клеток. В отличие от поляризованной активности RhoA в мигрирующих клетках, глобальное подавление активности RhoA в стационарных клетках при стимуляции EGF может способствовать протрузии во всех направлениях без дискриминации, что предотвращает постоянную и направленную миграцию.Глобальное изменение активности RhoA при стимуляции EGF в мигрирующих клетках оказалось менее значительным по сравнению с таковым в неподвижных клетках. Это во многом связано с постоянным поддержанием высокой активности RhoA на заднем крае мигрирующих клеток, но не в стационарных клетках. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения детального молекулярного механизма, управляющего дифференциальными ответами RhoA стационарных и мигрирующих клеток.

Таким образом, наш метод анализа изображений может позволить использовать высокопроизводительные и автоматизированные средства для количественной оценки и анализа пространственно-временных молекулярных сигналов в живых клетках. Это особенно эффективно при анализе большого количества сигналов от ячеек с изменяющейся формой, например мигрирующие клетки. Мы также продемонстрировали важность этого метода, применив его для количественной оценки динамической активности RhoA на субклеточных уровнях в мигрирующих и неподвижных клетках HeLa. Результаты показали, что EGF индуцирует подавление RhoA как в мигрирующих, так и в неподвижных клетках HeLa. Однако поляризованное распределение активности RhoA может постоянно наблюдаться только в мигрирующих, но не в неподвижных клетках.

Дополнительная информация

Фильм S1.

Образы FRET были сопоставлены с диском. Пространственно-временная динамика отношения FRET, представляющего активность RhoA при стимуляции EGF, показана в типичной мигрирующей клетке (слева) и эталонных изображениях, отображенных на диске (справа). Красный и синий цвета указывают на высокую и низкую активность RhoA соответственно. Было показано, что ячейка перемещается в поле обзора, особенно во время более поздней части видео (слева), в то время как эталонные изображения ячейки оставались в пределах статического единичного диска (справа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s001

(9,81 МБ MOV)

Фильм S3.

Геометрические особенности шести кластеров (справа) и трех верхних кластеров (слева) в мигрирующей ячейке показаны во времени. Эти регионы имеют цветовую кодировку в соответствии с их активностями RhoA, причем холодные и горячие цвета представляют регионы с низким и высоким уровнями активности RhoA соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004082.s003

(10,26 МБ MOV)

Благодарности

Мы благодарим Dr.Мичиюки Мацуда за драгоценные реактивы и конструкции.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JPE SL YW. Проведены эксперименты: JX. Проанализированы данные: JPE SL YW. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: JPE SL. Написал статью: JPE SL YW.

Список литературы

  1. 1. Ридли А.Дж., Шварц М.А., Берридж К., Фиртель Р.А., Гинзберг М.Х. и др. (2003) Миграция клеток: интеграция сигналов спереди назад. Science 302: 1704–1709.
  2. 2. Jaffe AB, Hall A (2005) Rho GTPases: биохимия и биология. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 247–269.
  3. 3. Raftopoulou M, Hall A (2004) Миграция клеток: лидируют Rho GTPases. Дев Биол 265: 23–32.
  4. 4. Уиллер А.П., Ридли А.Дж. (2004) Почему три белка Rho? RhoA, RhoB, RhoC и подвижность клеток. Exp Cell Res 301: 43–49.
  5. 5. Риенто К., Ридли А.Дж. (2003) Камни: многофункциональные киназы в поведении клеток.Nat Rev Mol Cell Biol 4: 446–456.
  6. 6. Чжан Дж., Кэмпбелл Р. Е., Тинг А. Ю., Цзян Р. Ю. (2002) Создание новых флуоресцентных зондов для клеточной биологии. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906–918.
  7. 7. Pertz O, Hodgson L, Klemke RL, Hahn KM (2006) Пространственно-временная динамика активности RhoA в мигрирующих клетках. Природа 440: 1069–1072.
  8. 8. Курокава К., Мацуда М. (2005) Локальная активация RhoA как требование для индукции взъерошивания мембраны. Mol Biol Cell 16: 4294–4303.
  9. 9. Цзянь Р.Ю. (1998) Зеленый флуоресцентный белок. Анну Рев Биохим 67: 509–544.
  10. 10. Ван И, Шайи Джи-Дж, Чиен С. (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть значит верить. Annu Rev Biomed Eng 10: In Press.
  11. 11. Palmer AE, Jin C, Reed JC, Tsien RY (2004) Bcl-2-опосредованные изменения в Ca2 + эндоплазматического ретикулума анализируются с помощью улучшенного генетически кодируемого флуоресцентного сенсора. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 17404–17409.
  12. 12. Йошизаки Х, Охба Й, Курокава К., Ито Р. Э., Накамура Т. и др. (2003) Активность ГТФаз семейства Rho во время деления клеток, визуализированная с помощью зондов на основе FRET. J Cell Biol 162: 223–232.
  13. 13. Йошизаки Х., Охба Й., Паррини М.К., Дульянинова Н.Г., Бресник А.Р. и др. (2004) Тип-специфическая регуляция активности RhoA во время цитокинеза. J Biol Chem 279: 44756–44762.
  14. 14. Nakamura T, Aoki K, Matsuda M (2005) Визуализация FRET в конусах роста нервов показывает высокий уровень активности RhoA в периферическом домене.Brain Res. Mol. Brain Res. 139: 277–287.
  15. 15. Ямана Н., Аракава Ю., Нишино Т., Курокава К., Танджи М. и др. (2006) Путь Rho-mDia1 регулирует клеточную полярность и оборот фокальной адгезии в мигрирующих клетках посредством мобилизации Apc и c-Src. Mol Cell Biol 26: 6844–6858.
  16. 16. Эль-Сибай М., Перц О, Панг Х., Ип С.К., Лоренц М. и др. (2008) RhoA / ROCK-опосредованное переключение между Cdc42- и Rac1-зависимым выпячиванием в клетках карциномы MTLn3. Exp Cell Res 314: 1540–1552.
  17. 17. Wong K, Pertz O, Hahn K, Bourne H (2006) Поляризация нейтрофилов: пространственно-временная динамика активности RhoA поддерживает механизм самоорганизации. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 3639–3644.
  18. 18. Ван Й, Шайи Джи-Дж, Чиен С. (2008) Флуоресцентные белки, визуализация живых клеток и механобиология: видеть — значит верить. Ежегодный обзор биомедицинской инженерии 10: 1–38.
  19. 19. Зитова Б., Флюссер Дж. (2003) Методы регистрации изображений: обзор.Image and Vision Computing 21: 977–1000.
  20. 20. Jagalur M, Pal C, Learned-Miller E, Zoeller RT, Kulp D (2007) Анализ экспрессии генов in situ в мозгу мыши с регистрацией изображений, выделением признаков и кластеризацией блоков. BMC Bioinformatics 8: Дополнение 10S5.
  21. 21. Чемберлен CE, Крайнов В.С., Хан К.М. (2000) Визуализация пространственно-временной динамики активации Rac in vivo с помощью FLAIR. Методы Enzymol 325: 389–400.
  22. 22. Hodgson L, Nalbant P, Shen F, Hahn K (2006) Визуализация и коррекция фотообесцвечивания Mero-CBD, сенсора эндогенной активации Cdc42.Методы Enzymol 406: 140–156.
  23. 23. Шен Ф., Ходжсон Л., Рабинович А., Перц О, Хан К. и др. (2006) Функциональная протеометрия миграции клеток. Цитометрия A 69: 563–572.
  24. 24. Rieger B, Molenaar C, Dirks RW, Van Vliet LJ (2004) Выравнивание ядра клетки из меченых белков только для 4D визуализации in vivo. Microsc Res Tech 64: 142–150.
  25. 25. Матула П., Матула П., Козубек М., Дворжак В. (2006) Быстрое точечное трехмерное выравнивание живых клеток.IEEE Trans Image Process 15: 2388–2396.
  26. 26. Dormann D, Libotte T, Weijer CJ, Bretschneider T (2002) Одновременная количественная оценка подвижности клеток и ассоциации белка с мембраной с использованием активных контуров. Цитоскелет клеточного мотила 52: 221–230.
  27. 27. Dubin-Thaler BJ, Giannone G, Dobereiner HG, Sheetz MP (2004) Нанометрический анализ распределения клеток на покрытых матриксом поверхностях выявляет два различных состояния клеток и ШАГИ. Biophys J 86: 1794–1806.
  28. 28.Mott RE, Helmke BP (2007) Картирование динамики структурных изменений эндотелиальных клеток, вызванных напряжением сдвига. Am J Physiol Cell Physiol 293: C1616–1626.
  29. 29. Shi LZ, Nascimento JM, Berns MW, Botvinick EL (2006) Компьютерное отслеживание одиночной спермы. Дж. Биомед Опт 11: 054009.
  30. 30. Shi LZ, Nascimento JM, Chandsawangbhuwana C, Botvinick EL, Berns MW (2008) Автоматическая система для изучения подвижности и энергетики сперматозоидов. Биомедицинские микроустройства 10: 573–583.
  31. 31. Wischgoll T, Choy JS, Ritman EL, Kassab GS (2008) Валидация метода на основе изображений для извлечения морфометрии коронарных артерий. Энн Биомед Энг, 36: 356–368.
  32. 32. Гоштасби А. (1986) Кусочно-линейные функции отображения для совмещения изображений. Распознавание образов 19: 459–466.
  33. 33. Оцу Н. (1979) Метод выбора порога по гистограммам уровней серого. IEEE Transactions по системам, человеку и кибернетике 9: 62–66.
  34. 34.Barber CB, Dobkin DP, Huhdanpaa H (1996) Быстрый алгоритм для выпуклых оболочек. Транзакции ACM на математическом программном обеспечении 22: 469–483.
  35. 35. Джордж П.Л. (1991) Автоматическое построение сетки: приложение к методам конечных элементов. Нью-Йорк: Вили.
  36. 36. Ли Дж., Исихара А., Териот Дж. А., Джейкобсон К. (1993) Принципы передвижения для клеток простой формы. Природа 362: 167–171.
  37. 37. Спат Х. (1985) Рассмотрение и анализ кластеров: теория, программы FORTRAN, примеры.Гольдшмидт Дж., Переводчик, редактор. Нью-Йорк: Halsted Press ..
  38. 38. Seber GAF (1984) Многомерные наблюдения. Барнетт В., Брэдли Р.А., Хантер Дж. С., Кендалл Д. Г., Миллер Р. Дж. Мл. И др., Редакторы. Нью-Йорк: Wiley ..
  39. 39. Vielkind S, Gallagher-Gambarelli M, Gomez M, Hinton HJ, Cantrell DA (2005) Регулирование интегрина с помощью RhoA в тимоцитах. J Immunol 175: 350–357.
  40. 40. Salmon WC, Adams MC, Waterman-Storer CM (2002) Двухволновая флуоресцентная спекл-микроскопия выявляет связь микротрубочек и движений актина в мигрирующих клетках.J Cell Biol 158: 31–37.
  41. 41. Лауффенбургер Д.А., Хорвиц А.Ф. (1996) Миграция клеток: физически интегрированный молекулярный процесс. Ячейка 84: 359–369.
  42. 42. Родригес О.К., Шефер А.В., Мандато СА, Форшер П., Бемент В.М. и др. (2003) Консервативные взаимодействия микротрубочек с актином в движении и морфогенезе клеток. Nat Cell Biol. 5: 599–609.
  43. 43. Холл A (2005) Rho GTPases и контроль клеточного поведения. Biochem Soc Trans 33: 891–895.

Комментарий: Не волнуйтесь: вы не одиноки

Я не знал, что мой последний день в офисе будет моим последним днем ​​в офисе.

Я принял решение начать работать из дома 12 марта. Риск продолжения личных встреч с клиентами в моей психотерапевтической практике внезапно стал серьезным.

Я думал, что буду видеть клиентов через видеочат всего две недели. Теперь, конечно, из-за характера пандемии коронавируса я знаю, что она продлится намного дольше.

Я отправил свои молчаливые извинения двум растениям, которые процветали в моем офисе до сих пор. И моему терапевту, плюшевому мишке, Филбину, который в моем воображении, должно быть, чувствовал себя одиноким, глядя на пустую кушетку.

Всем нам сейчас предстоит столкнуться с новой реальностью. Судя по тому, что я заметил, некоторые люди считают уединение социального дистанцирования желанной передышкой от давления повседневной жизни. Другие испытывают сильную боль из-за того, что не могут обнять близких и испытать комфорт их физического присутствия.

К сожалению, многие люди потеряли работу и средства к существованию. А некоторые уже пережили смерть близких или сами заболели и испугались.

Во многих смыслах нас всех объединяет сейчас горе. И это не просто горе из-за того, что мы, возможно, уже потеряли, но ожидание того, что может быть потеряно в будущем.

Хотя каждый переживает траур по-разному, есть некоторые общие черты. Во-первых, он приходит волнами.Сегодня вы можете чувствовать себя хорошо, а завтра — нет. Или, может быть, этот цикл повторяется несколько раз в один и тот же день.

Горе тоже может казаться случайным; сильные чувства могут возникнуть в любое время и без видимой причины. Все это нормальные реакции на ненормальную ситуацию.

В рамках обучения на терапевта я работала консультантом в хосписе. Хотя я изучал пять стадий горя Элизабет Кюблер-Росс, я также обнаружил, что стадии должны применяться к тем, кто сталкивается с неизлечимой болезнью, а не обязательно к близким, которые их пережили.

Исследователь Дж. Уильям Уорден расширил тему горя и описывает процесс в своих «Четырех задачах скорби». Я считаю, что эти задачи могут быть адаптированы к коллективному горю, которое мы сейчас переживаем:

  • Задача первая : Принять реальность потери. Важно осознать жизнь такой, какой мы знали, возможно, она уже никогда не будет прежней. Это может занять некоторое время, и это нормально.
  • Задача вторая : Преодолеть боль горя.Эта задача может быть самой сложной. Когда мы не хотим испытывать отрицательные эмоции, мы часто их избегаем. Иногда это похоже на минимизацию эмоциональной боли. Парадокс в том, что когда мы признаем боль, она обычно утихает.
  • Задача третья : Приспособиться к среде, в которой умерший отсутствует. Мы не только можем потерять близких, но и потеряем чувство нормальной жизни и безопасности. Может потребоваться переоценка привычек, приоритетов и даже ценностей, чтобы освободить место для нашей новой жизни.
  • Задание четвертое : Найти прочную связь с умершим, вступая в новую жизнь. Независимо от того, как многое может измениться, жизнь продолжится. Мы можем использовать этот опыт, чтобы глубже ценить жизнь и свое место в ней.

Эти четыре задачи не должны быть линейными — вы можете сосредоточиться на каждой из них в разное время или даже на всех сразу.

Если в наши дни вы думаете или ведете себя неожиданным образом, не волнуйтесь.Ты не одинок. Однако, если вы чувствуете себя подавленным или чрезмерно тревожным в течение всего дня в течение многих дней подряд, возможно, стоит обратиться за профессиональной помощью.

Один из моих любимых советов взят из дзен-буддизма: «Когда голоден, ешь. Когда устал, спи ». Во всяком случае, эта пандемия приглашает нас жить именно настоящим моментом.

Что до меня, то в последнее время я избавляюсь от стресса, готовя галлоны овощного супа. Я режу, измельчаю, измельчаю овощи, перемешиваю, перемешиваю бульон и ставлю его на медленный огонь.А потом, как мы все делаем в наши дни, я жду.

Рэйчел Мур, LMFT, лицензированный семейный терапевт с частной практикой в ​​Хиллкресте. Она специализируется на терапии по десенсибилизации и повторной обработке движением глаз (EMDR), уделяя особое внимание творческому сообществу Сан-Диего — писателям, художникам и музыкантам. Она — бывший редактор в газете The San Diego Union-Tribune. Ее веб-сайт: rachelmoorecounseling.com

Гриф для укулеле Примечания: диаграммы и схемы

Самая важная часть фундаментальных знаний игрока — это, без сомнения, записи на грифе укулеле.

В них есть ключ ко всему, и тем не менее, эти 48 маленьких мест назначения оттеснены почти всеми! Они похожи на таблицы умножения вашего уке — не забавные, но полезные и необходимые.

Содержание:
Схема хроматической накладки грифа
Схема грифа GCEA PDF-файлы
Схемы других настроек
Запоминание грифа

Прежде чем мы будем слишком взволнованы тем, что есть где (если вы действительно не можете ждать, нажмите кнопку), неплохо иметь смутное представление, почему ноты расположены так, как они расположены на грифе укулеле.

Хроматическая раскладка грифа для укулеле:

В западной музыке используется 12 нот в следующем порядке:

 A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb - G - G # / Ab 

Это называется хроматической шкалой. Как только вы дойдете до конца, он повторится до A. Эта хроматическая гамма также точно такая же, как и A-струна. Если бы вы играли каждую ноту на своей А-струне по порядку, начиная с открытой ноты А, вы играли бы указанную выше строку букв.

12-й лад отмечает так называемую «октаву» — ту же ноту, на расстоянии целой гаммы до-ре-ме-фа-со-ла-ти-до. Это означает, что как только вы дойдете до 12-го лада, все будет повторяться!

Это верно для всех струн. Открытые струны укулеле: G-C-E-A. Какие ноты на 12 ладу укулеле? G-C-E-A на октаву выше!

Вывод: Вам действительно нужно выучить ноты укулеле до 11 лада.

Из хроматической гаммы можно найти 7 натуральных нот:

 A - B - C - D - E - F - G 

Они считаются «натуральными», потому что не изменяются острыми предметами или балками.

Диез (#) повышает высоту ноты на полтона. Бемоль (b) понижает высоту ноты на полтона. Полушаг — это один лад на укулеле.

Эти плоские или острые ноты называются «энгармониками», и каждая имеет два названия. Всего 5 энгармоник:

 A # / Bb - C # / Db - D # / Eb - F # / Gb - G # / Ab 

Из-за того, что 12 нот расположены на грифе укулеле, между каждой естественной нотой и следующей есть энгармония, кроме :

Если вы помните, что B / C и E / F всегда являются ближайшими соседями, вы всегда можете определить хроматический масштаб.

Вот диаграмма того, где они случайно упали на гриф укулеле.

Смещение хроматической шкалы для каждой струны:

Поскольку хроматическая буквенная линия снова повторяется от G # / Ab до A, вы можете начать с любой ноты и каждый раз получать один и тот же порядок. Именно это происходит с тремя другими струнами.

E-string просто:

 E - F - F # / Gb - G - G # / Ab - A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb 

С-образный шнур :

 C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb - G - G # / Ab - A - A # / Bb - B 

Стринги :

 G - G # / Ab - A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb 

Сложите все вместе, и вы получите первую приблизительную карту грифа укулеле:

 A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb - G - G # / Ab
E - F - F # / Gb - G - G # / Ab - A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb
C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb - G - G # / Ab - A - A # / Bb - B
G - G # / Ab - A - A # / Bb - B - C - C # / Db - D - D # / Eb - E - F - F # / Gb 

Войдите в матрицу

Понимать ноты на клавиатуре фортепиано проще, чем на грифе укулеле. Это потому, что для каждой ноты есть только одно место — средняя до существует только в одном месте.

Однако на укулеле (за некоторыми исключениями) каждая нота существует в нескольких местах. Мне нравится думать об этом как о «матрице» грифа. Из-за того, как хроматическая гамма попадает на каждую струну, картинку становится намного сложнее понять. Поиск «правильной» ноты превращается в тяжелую работу. Вам нужно не только найти варианты, но и решить, какие из них использовать для воспроизведения песни!

Теперь, когда вы понимаете, почему все обстоит именно так, давайте перейдем к делу и раскачиваем таблицу грифа для вашей уке!

Таблицы для нот грифа укулеле GCEA

В грифовой диаграмме ничего особенного.Один набор линий проходит горизонтально и представляет собой струны. Остальные — вертикальные и представляют лады. Заметки отображаются в пространстве для каждого пальца. Простой.

Вот несколько таблиц нот на грифе укулеле в различных форматах для справки.

В некоторых случаях может быть полезен файл .jpg. Нажмите на изображение, чтобы получить полноразмерную версию:

Если вам нужна модная версия с выделенными естественными нотами, вот цветная таблица накладки грифа:

Наконец, я собрал загружаемый PDF-файл с высоким разрешением с несколькими грифами на страницу, которую вы можете использовать, чтобы попрактиковаться в запоминании грифов.

Схема грифа для укулеле PDF

Схема грифа для укулеле PDF: для левой руки

Пустая таблица грифа (примечания не показаны)

Другие настройки:

Большинство людей, попадающих на эту страницу, будут искать вышеуказанную информацию. Но чтобы охватить все основы, вот таблицы для других основных настроек. Если вы заметили, все то же самое, меняется только начальная точка. Хроматическая гамма снова в действии!

Запоминание нот грифа

Одна из первых битв, с которой вы столкнетесь на пути к более компетентному исполнению на укулеле, — это выучить ноты и их расположение на грифе. Не просто: [пауза] «… вот она!», А скорее:

БУМ!

Вы хотите иметь возможность мгновенно найти ближайшее местоположение той одной заметки, которую вы ищете. Это требует времени, и вы всегда можете быть быстрее, но знакомство с укулеле займет у вас много времени.

Процесс

Я предлагаю начать с изучения естественных нот до 3-го лада . Поскольку гамма до мажор состоит только из естественных нот, это отличное место для начала.

Я мог бы объяснить это здесь, но Бретт из Ukulele Tricks проделал отличную работу, демонстрируя базовую шкалу до мажор первой позиции.

Эта базовая форма покрывает три нижние струны, поэтому все, что вам нужно добавить, это открытая струна G и ля на 2-м ладу, струна G:

Затем поработайте над изучением всех естественных нот до 5-го лада . Этот шаг просто добавляет все ноты на 5-м ладу и две на 4-м ладу, струны G и C к тому, что у нас уже есть на предыдущем шаге.

Продвигайтесь вверх по грифу (лады или струны, если хотите) и выучите остальные естественные ноты. Это все просто большая С.

Вместо того, чтобы пытаться делать все сразу, я продолжал учиться с 5-го лада, добавляя по два лада естественных нот за раз. Это более управляемо и научит вас видеть «зоны», существующие между паттернами нот.

Оттуда вам просто нужно заполнить пробелы с энгармониками.

Поскольку название энгармоника в значительной степени является дорожной картой, ведущей прямо к месту нахождения заметки, их довольно легко найти.Например: что находится между C и D? Хм… C # / Db. Довольно просто. C # / Db находится между ВСЕМИ C и D. Любая энгармония окружена двумя однофамильцами.

По мере того, как вы изучаете каждую часть грифа и отбрасываете темноту, окружающую ноты на укулеле, вам понадобятся некоторые идеи для упражнений и упражнений.

Весы , вероятно, наиболее подходят для обучения игре на грифе, потому что вы в любом случае учите ноты. Подобно тому, как шкала C знакомит большинство людей с естественными нотами внутри первых 3 ладов, любая другая шкала может научить вас нотам, которые находятся между ними и выше по грифу.Вот вкладка основных шкал и страница видеоуроков с вкладкой:

Просто сыграйте и подумайте о нотах. Просто, но когда вы разучиваете песню, вы действительно думаете о нотах или просто о том, где проходят ваши пальцы? Если вы пробежитесь по названиям нот во время игры, вы сможете убить двух зайцев одним выстрелом. Это особенно важно, если вы учитесь только на вкладках, поскольку ничто не заставляет вас даже заботиться о заметках.

Найдите записку во всех местах .Если у вас есть метроном, включайте его медленно, если нет, просто практикуйте его равномерно (и медленно), считая в голове или постукивая ногой. Выберите заметку и найдите ее на любой строке. Найдя ноту, сыграйте ее одним щелчком (метроном или виртуальный — «1 2 3 4…»). Найдите ноту на следующей струне и сыграйте ее при следующем щелчке (я сказал, идите медленно, верно?). И следующее, и следующее, пока вы не закроете все струны.

Есть несколько струн (в зависимости от количества ладов, с которыми вам нужно работать), у которых будет два расположения нот.Я предлагаю вам попрактиковаться в игре и в них. Затем выберите другую заметку и найдите ее. Попробуйте проделать это с разными нотами (в том числе с энгармониками!). Например, чтобы выполнить это упражнение с нотой G, это будет выглядеть так:

  1. Открыть стринги G — «щелкнуть / выбрать»
  2. 12 лад, струна G — «щелкни / выбери»
  3. 7 лад, струна C — «щелкни / выбери»
  4. 3-й лад, струна E — «click / pick»
  5. 15 лад, струна ми — «click / pick»
  6. 10 лад, струна — «щелкни / выбери»

Запишите. Распечатайте несколько копий пустой таблицы грифа и заполните пробелы в любом порядке (сначала естественные ноты, строка за строкой, лад за ладом и т. Д.). Изучите расположение этих записок!

Об авторе: Брэд Бордесса. Я художник укулеле из Хонока, Гавайи, и я управляю этим сайтом из автономной хижины в джунглях. Я проводил семинары по всему миру, заставлял Херба Охта-младшего смеяться до слез, а однажды на сцене играл с HAPA в своих шортах.Больше обо мне

Полное руководство по интонации гитары (со схемами)

Гитарную интонацию важно понимать и правильно настраивать на вашей гитаре.

Если на вашей гитаре неправильно настроена интонация, вы будете звучать расстроено, даже если правильно настроите струны.

В этом руководстве я объясню, что такое гитарная интонация, как ее настроить, общие проблемы с интонацией и общие советы по интонации.

После того, как вы прочтете это руководство, я настоятельно рекомендую прочитать эти два руководства, чтобы правильно настроить и настроить вашу гитару для достижения наилучших результатов:

  • Окончательное руководство по игре на гитаре.Высота действия и интонация влияют друг на друга, поэтому прочтите руководство, чтобы узнать об этом.
  • Полное руководство по анкерам. Как только вы проверите интонацию и действие вашей гитары, вы можете обнаружить, что вам нужно отрегулировать анкерный стержень. В этом руководстве объясняется все, что вам нужно знать.

Что означает интонация на гитаре

Прежде чем мы рассмотрим настройку интонации вашей гитары, важно понять, что это такое и как это влияет на вашу игру.

Гитарная интонация — это то, насколько ваша гитара настроена по всей длине грифа.Гитара с хорошей интонацией будет гармонировать везде на грифе. Гитара с плохой интонацией будет расстроена в некоторых областях грифа.

Важно помнить, что гитара с плохой интонацией может расстроиться, даже если струны идеально настроены.

Если вы играете на гитаре и замечаете, что по мере того, как вы играете на грифе, она постепенно становится все более расстроенной, это признак того, что ваша интонация отсутствует.

Давайте посмотрим, почему интонация важна для правильной работы и как проверить интонацию вашей гитары.

Насколько важна интонация на гитаре

Лучшая гитара в мире будет звучать как мусор, если нет интонации.

Интонация важна для правильной игры на гитаре, чтобы быть уверенным, что вы всегда будете в гармонии, независимо от того, где вы играете на грифе. Хорошая гитара будет ужасно звучать, если интонация неправильно настроена.

Если интонация вашей гитары настроена неправильно, не имеет значения, насколько точно вы настроите гитарные струны, вы все равно будете расстроены.

Интонация вашей гитары может меняться со временем, поэтому важно регулярно проверять свою интонацию, как описано ниже.

Как проверить интонацию на гитаре

Если вам кажется, что интонация вашей гитары сбилась, это легко и быстро проверить. Выполните следующие действия, чтобы проверить интонацию вашей гитары прямо сейчас:

Шаг 1. Настройте гитару

Intonation — это то, насколько ваша гитара настроена на себя, поэтому важно сначала настроить гитарные струны.

Настройте каждую струну как можно точнее с помощью точного гитарного тюнера.

Ознакомьтесь с моим полным руководством по настройкам гитары, чтобы узнать о лучших доступных настройках гитары. В руководстве также обсуждаются приложения для тюнера, если вы не хотите покупать педаль тюнера или устройство.

Шаг 2. Сыграйте естественную гармонику на 12-м ладу

Самый простой способ проверить интонацию вашей гитары — это сравнить высоту ладовой ноты 12-го лада с естественной гармоникой 12-го лада.

Чтобы сыграть естественную гармонику на 12-м ладу, слегка коснитесь своей гитарной струны прямо над 12-м ладом на нижней струне E, как показано ниже:

Не давите на веревку — только слегка дотрагивайтесь до нее.Струна не должна давить на лад.

Не снимая тюнера, проверьте настройку гармоники 12-го лада. Он должен быть идеально настроен.

Если она не настроена идеально, отрегулируйте струну до идеальной настройки. Идеально подобранная струна облегчает проверку интонации.

Шаг 3. Сыграйте ноту 12 лада

Нажмите на 12-й лад нижней струны ми и сыграйте ноту.

Проверьте свой гитарный тюнер, чтобы увидеть, насколько настроена нота.Настройка этой ноты покажет вам, правильна ли интонация для этой струны или нет. В приведенном выше примере ладовая нота плоская, потому что она ниже, чем высота гармоники 12-го лада.

Если ладовый 12-й лад плоский (ниже правильного тона) или резкий (выше правильного тона), ваша интонация отсутствует. Чем дальше нота от гармонии, тем хуже будет ваша интонация.

На фотографиях выше вы можете видеть, что гармоника 12-го лада идеально настроена, но ладовый 12-й лад ровный.Это означает, что интонация отсутствует, и нам нужно ее откорректировать (поясняется ниже).

Если ладовый 12-й лад настроен на , это означает, что интонация правильная для этой струны. Это не означает, что у всей гитары хорошая интонация, это означает, что правильна только одна струна.

Шаг 4: Повторите шаги для каждой строки

Гитарную интонацию необходимо проверять на каждой струне вашей гитары. Возможны некоторые струны с идеальной интонацией и другие струны с плохой интонацией.

Выполните указанные выше действия для каждой струны на гитаре и обратите внимание на интонацию каждой струны.

Теперь, когда вы знаете, отсутствует ли интонация вашей гитары для каждой струны, мы можем посмотреть, как отрегулировать интонацию.

Как настроить интонацию гитары

Способ настройки интонации гитары зависит от того, какой у вас тип гитары.

Интонация регулируется путем увеличения или уменьшения длины гитарной струны.Самый простой способ сделать это — отрегулировать положение бриджа гитары.

На некоторых гитарах отрегулировать положение бриджа — простая работа. На других гитарах, таких как акустические, это практически невозможно.

Как отрегулировать мост

Прежде чем мы рассмотрим различные типы мостов и способы регулировки каждого из них, вот общие правила, в каком направлении настраивать мост.

Если ладовая нота на 12-м ладу резкая (высота звука выше, чем у гармоники), вам необходимо увеличить длину гитарной струны.

Увеличение длины струны снижает высоту ладовой ноты. Вы хотите постепенно увеличивать длину струны до тех пор, пока высота ладовой ноты не будет соответствовать высоте звука 12-й гармоники лада.

Чтобы увеличить длину струны, вы хотите, чтобы седло вашего бриджа отодвигалось дальше от грифа, как показано на фотографии ниже:

Чем дальше от грифа вы отодвинете седло, тем длиннее будет струна.

Совет: Если вы увеличиваете длину струны, убедитесь, что вы ослабили натяжение струны, прежде чем вносить изменения, чтобы предотвратить разрыв струны.

Если ладовая нота 12-го лада плоская (ниже по высоте, чем гармоника), вам необходимо уменьшить длину гитарной струны.

Уменьшение длины струны увеличивает высоту ладовой ноты. Вы хотите постепенно уменьшать длину струны до тех пор, пока высота ладовой ноты не будет соответствовать высоте звука 12-й гармоники лада.

Чтобы уменьшить длину струны, вы хотите, чтобы седло вашего бриджа было сдвинуто ближе к грифу, как показано ниже:

Уменьшение длины струны ослабит струну, поэтому вам не нужно беспокоиться о ее ослаблении перед выполнением регулировки.

Мосты Fender

На фото ниже показан мост Stratocaster от крыла, и другие бренды могут использовать мост аналогичного стиля:

В бридже шесть «седел» — по одной на каждую струну.Обратите внимание, что каждое седло соединено с мостом винтом, проходящим через конец моста.

Регулируя винт, седло подтягивается ближе к мосту или дальше.

При повороте винта по часовой стрелке длина гитарной струны увеличивается. Если ладовая нота 12-го лада — диез , поворот винта по часовой стрелке улучшит интонацию.

При повороте винта против часовой стрелки длина гитарной струны уменьшается. Если ладовая нота на 12-м ладу плоская , поворот винта по часовой стрелке улучшит интонацию.

Изменяйте седло только небольшими изменениями за раз. Сделайте небольшую корректировку, затем настройте заново и проверьте интонацию. Затем вы можете решить, нужно ли вам вносить дополнительные корректировки или нет.

Мосты в стиле Гибсона

На фото ниже показан бридж Gibson Les Paul Tune-o-matic:

Вы можете видеть, что каждая струна покоится на небольшом роликовом седле, у которого есть место для движения вперед или назад.

На другой стороне моста вы увидите винт для каждой струны. Эти винты регулируют положение опоры ролика.

Поскольку доступ к винтам осуществляется с другой стороны моста, направление вращения винта также изменяется по сравнению с мостом типа Fender.

Поверните винт по часовой стрелке, чтобы уменьшить длину струны. Сделайте эту ладовую ноту плоской.

Поверните винт против часовой стрелки, чтобы увеличить длину струны. Сделайте это резкой ладонной нотой.

Уменьшите натяжение струн, чтобы не повредить струну или седла.

Мостовидные перемычки PRS или стоптели

Если у вас есть PRS с бриджем, у которого есть седла и винты, которые похожи на бридж в стиле Fender, как показано ранее, следуйте приведенным выше инструкциям, чтобы настроить вашу интонацию.

Если у вас есть PRS и струны оборачиваются вокруг бриджа, нужен немного другой подход.

Некоторые из этих мостовидных протезов имеют регулируемые седла, как показано на фотографии выше.

Чтобы отрегулировать интонацию на этих мостах, вам необходимо отрегулировать отдельные винты, доступные с другой стороны моста.

Это немного неудобно, так как вам нужно вставить отвертку под шнурки.

Поскольку доступ к винтам осуществляется с другой стороны перемычки, направление вращения винта также изменяется.

Поверните винт по часовой стрелке, чтобы уменьшить длину струны. Сделайте эту ладовую ноту плоской.

Поверните винт против часовой стрелки, чтобы увеличить длину струны. Сделайте это резкой ладонной нотой.

Если у вашего бриджа нет отдельных седел и он выглядит как на фото ниже, у вас нет индивидуального контроля интонации каждой струны.

Хотя вы не сможете отрегулировать каждую струну по отдельности, вы можете отрегулировать весь мост.

На концах моста есть два регулировочных винта, которые можно повернуть, чтобы наклонить мост влево или вправо.

Если все струны острые или плоские, вы можете попробовать отрегулировать положение бриджа, чтобы улучшить интонацию.Но вы можете обнаружить, что добиться хорошей интонации в каждой струне практически невозможно.

Допустим, у вас острые три струны. Чтобы улучшить интонацию, вам нужно увеличить длину этих струн.

Поверните регулировочный винт по часовой стрелке на конце верхней струны бриджа, чтобы отодвинуть его от стойки.

Как вы, наверное, догадались по фотографиям выше, эти типы мостов ужасны для точной настройки интонации.

Флойд Роуз Бриджес

Бриджи Флойд Роуз действительно позволяют регулировать интонацию каждой струны, но это неудобно.

Узнайте больше о мостах Floyd Rose в моем полном путеводителе.

На фотографии выше вы видите шестигранные гайки, которые удерживают каждое седло на месте. После того, как эти гайки ослаблены, вы можете переместить седло назад или вперед и снова затянуть гайку.

Как и следовало ожидать, это затруднительно из-за размещения шестигранной гайки. Сначала вам нужно ослабить струну, чтобы можно было ослабить гайку (поверните против часовой стрелки). Затем струна должна быть достаточно слабой, чтобы вы могли физически сместить седло.

Вам, вероятно, придется снова и снова настраивать и настраивать гитарные струны по мере того, как вы будете определять идеальное положение седла для каждой струны.

Хотя это и неудобно, но точная интонация того стоит.

Акустические гитары

Хотя существует много разных типов бриджей для электрогитары, все они позволяют каким-то образом регулировать интонацию.

Акустические гитары

отличаются друг от друга и не позволяют легко настроить интонацию.

На фотографии выше видно, что нет возможности отрегулировать положение седла моста.

Вы можете купить «компенсированное» акустическое седло, как показано ниже, которое предлагает небольшую регулировку интонации на каждой струне.

Некоторые акустические гитаристы даже подпиливают седло, чтобы немного изменить интонацию.

Если вы чувствуете, что ваша интонация немного искажена, вы можете попробовать компенсировать седло. Если вы это сделаете, я рекомендую иметь несколько запасных частей на случай, если это не сработает.

Если ваша интонация отсутствует на акустической гитаре, я рекомендую проверить высоту действия и анкерный стержень.Руководства по этим ссылкам помогут вам внести изменения, которые могут решить ваши проблемы с интонацией.

Проблемы с интонацией гитары

Интонацию на гитаре сложно получить, потому что на нее влияет очень много разных вещей.

Вот некоторые общие проблемы, которые могут возникнуть при работе с интонацией.

Мостовые седла полностью назад

Допустим, у вас резкая интонация, и вам нужно увеличить длину струны. Вы поправляете седло, еще раз проверяете интонацию, а она все еще отсутствует.

Продолжайте регулировку седла, пока это не произойдет:

Седло бриджа полностью сдвинуто назад, а интонация все еще отсутствует. Вы не можете регулировать его дальше (есть пружина, которая удерживает седло на месте и сжимается до определенной точки).

Первое, что нужно сделать, это проверить изгиб грифа гитары. Вогнутый лук на шее может сбить вашу интонацию.

Прочтите это руководство по регулировке анкерного стержня, чтобы узнать, на что обращать внимание и как исправить изгиб в шее гитары.

Если ваша шея установлена ​​правильно, а проблема остается, это может быть связано с плохими струнами. То, как струна соприкасается с седлом бриджа, играет большую роль в интонации, поэтому замените струны, если проблема только в одной или двух струнах.

Высота действия и интонация

Высота звука вашей гитары влияет на интонацию. Чем выше звук вашей гитары, тем сильнее она будет отбрасывать интонацию, потому что струну нужно продвигать дальше, чтобы дотянуться до лада.

На диаграмме выше показано, как высота действия влияет на интонацию.Если у вас высокий строй, вам нужно переместить струну на большее расстояние, чтобы дотянуться до лада. Это дополнительное расстояние расстраивает струну.

Чем ниже высота действия, тем меньше будет интонация. Конечно, обратная сторона низкой высоты подъема — жужжащие лады, поэтому вам нужно решить, какая высота вам подходит.

Узнайте здесь о высоте действия, в том числе о том, как отрегулировать ее в соответствии с вашим стилем игры.

Давление пальцами и интонация

Вы чувствуете, что каждая гитара, на которой вы играете, всегда имеет резкую интонацию? Это может быть результатом того, насколько сильно вы нажимаете на струны.

Чем сильнее вы нажимаете на струну, тем выше вы ее расстраиваете.

На приведенной выше фотографии вы можете увидеть, как кто-то, сделав легкое прикосновение, получит другую высоту звука, чем кто-то с тяжелым прикосновением. Изгиб, который вы видите в струне из-за сильного надавливания пальцем, приводит к расстроению ноты.

Гитара может быть идеально интонированной для легкого прикосновения, но кажется, что интонация отсутствует, если у гитариста есть тяжелое прикосновение.

Если у вас сильная струна, вам придется жонглировать между гармоничными ладонными нотами и настроенными открытыми струнами.

Советы по интонации гитары

Вот несколько советов, которые помогут облегчить настройку интонации и улучшить интонацию гитары.

Ослабляйте струны при настройке интонации

Если вы настраиваете седло бриджа для увеличения длины струны (отодвигая седло от грифа), натяжение струны будет увеличиваться по мере того, как вы регулируете седло.

Чтобы не допустить поломки струны или повреждения вашего седла, отрегулируйте струну перед регулировкой.

Если вы регулируете бридж для уменьшения длины струны (перемещая седло по направлению к грифу), натяжение струны будет уменьшаться по мере того, как вы регулируете седло. Это означает, что вам не нужно заранее беспокоиться о настройке струны.

Если вы регулируете мост Floyd Rose, убедитесь, что струна провисает, прежде чем регулировать шестигранную гайку.

Перед повторной проверкой интонации убедитесь, что вы перенастроили струну.

Защитите свою гитару

Каждый раз, когда вы подносите отвертку к корпусу гитары, примите меры по ее защите.

Если вы поскользнетесь при регулировке седел бриджа, отвертка может быстро испортить покрытие вашей гитары.

Используйте сложенную тряпку или любой другой барьер для защиты гитары от случайного скольжения, как показано на фото выше.

Сначала проверьте свою высоту

Перед тем, как приступить к настройке интонации гитары, рекомендуется сначала проверить высоту действия.

Высота гитары напрямую влияет на интонацию. Если действие будет слишком высоким, это выбьет вашу интонацию.

Проверьте высоту гитары и отрегулируйте ее, прежде чем работать над интонацией.

Используйте хороший тюнер

Знание того, насколько далеко у вас интонация, упрощает правильную настройку. Гитарный тюнер, который вы используете, облегчит или усложнит вашу работу в зависимости от того, как он отображает настройку.

Хороший совет — обращайте внимание на количество потраченных вами центов при внесении корректировок.

Допустим, ваша струна расстроена на 20 центов. Вы регулируете седло и повторно проверяете настройку. Если он сейчас на 15 центов, вы знаете, что можете сделать большую корректировку, не заходя слишком далеко.

Регулярно заменять строки

Когда вы используете гитарные струны, струна лада изнашивает струны. В конце концов, вы можете заметить плоские пятна на нижней стороне струн, которые выходят на лады.

Это может постепенно вызывать проблемы с интонацией, поскольку меняется способ контакта струны с ладом.

Вам не нужно слишком часто менять струны (подробнее о том, как часто менять гитарные струны, читайте здесь), но если вы используете очень старые струны, вы можете обнаружить, что ваша интонация улучшится с новым набором.

Пусть ваша гитара успокоится

Если вы вносите изменения в анкерный стержень, дайте гитаре успокоиться, прежде чем вносить изменения в интонацию.

Гриф вашей гитары должен привыкнуть к изменению напряжения. Дайте гитаре отстояться на день или два, прежде чем вы посмотрите на смену интонации.

Есть ли у гитары идеальная интонация?

Если вы пытались добиться идеальной интонации на всем грифе, вы можете разочароваться, когда обнаружите, что это невозможно.

Даже если вам удастся добиться идеальной интонации на 12-м ладу на всех струнах, вы можете обнаружить, что некоторые области грифа по-прежнему имеют плохую интонацию.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *