Лада 4 х 4: Новое имя LADA Niva Legend

Содержание

Новое имя LADA Niva Legend

• Постоянный полный привод
• Блокировка межосевого дифференциала
• Понижающий ряд передач
• Сапуны переднего и заднего мостов
• Защита картера двигателя стальная

• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Розетки 12V

• Виброизоляция
• Гидроусилитель рулевого управления
• Легкая тонировка стекол
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Аудиоподготовка

• 16» стальные диски
• Запасное полноразмерное стальное колесо 16»

• Постоянный полный привод
• Блокировка межосевого дифференциала
• Понижающий ряд передач
• Сапуны переднего и заднего мостов
• Защита картера двигателя стальная

• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС

• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Розетки 12V
• Розетка 12V в багажном отделении

• Виброизоляция
• Гидроусилитель рулевого управления
• Легкая тонировка стекол
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Аудиоподготовка

• 16» легкосплавные диски Niagara
• Запасное стальное колесо временного использования 16»

• Постоянный полный привод
• Блокировка межосевого дифференциала
• Понижающий ряд передач
• Сапуны переднего и заднего мостов
• Защита картера двигателя стальная

• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Дневные ходовые огни
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС

• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Розетки 12V
• Розетка 12V в багажном отделении

• Виброизоляция
• Гидроусилитель рулевого управления
• Легкая тонировка стекол
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиоподготовка

• 16» легкосплавные диски Niagara
• Запасное стальное колесо временного использования 16»

• Постоянный полный привод
• Блокировка межосевого дифференциала
• Понижающий ряд передач
• Сапуны переднего и заднего мостов
• Защита картера двигателя стальная

• Подголовники задних сидений 2 шт.


• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Розетки 12V
• Розетка 12V в багажном отделении

• Виброизоляция
• Гидроусилитель рулевого управления
• Легкая тонировка стекол
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал
• Кондиционер
• Аудиоподготовка

• Бамперы в цвет кузова
• Накладки порогов пола
• 16» легкосплавные диски Grizzly двухцветные
• Запасное стальное колесо временного использования 16»

• Постоянный полный привод
• Блокировка межосевого дифференциала

• Понижающий ряд передач
• Сапуны переднего и заднего мостов
• Защита картера двигателя стальная

• Подголовники задних сидений 2 шт.
• Крепления для детских сидений ISOFIX
• Дневные ходовые огни
• Противотуманные фары
• Система экстренного оповещения ЭРА-ГЛОНАСС
• Антиблокировочная система с электронным распределением тормозных сил (ABS, EBD)
• Система вспомогательного торможения (BAS)

• Бортовой компьютер
• Обивка потолка черного цвета
• Оригинальная обивка сидений
• Розетки 12V
• Розетка 12V в багажном отделении

• Виброизоляция
• Гидроусилитель рулевого управления
• Легкая тонировка стекол
• Электростеклоподъемники передних дверей
• Подогрев передних сидений
• Электропривод и обогрев наружных зеркал

• Кондиционер
• Аудиоподготовка

• Бамперы в цвет кузова
• Накладки порогов пола
• 16» легкосплавные диски Niagara черные
• Запасное стальное колесо временного использования 16»

LADA Niva Legend 3 дв. – Технические характеристики – Официальный сайт LADA

  • Кузов
  • Колесная формула / ведущие колеса

  • Расположение двигателя

  • Тип кузова / количество дверей

  • Количество мест

  • Длина / ширина / высота, мм

  • База, мм

  • Колея передних / задних колес, мм

  • Дорожный просвет, мм

  • Код двигателя

  • Тип двигателя

  • Система питания

  • Количество, расположение цилиндров

  • Рабочий объем, куб. см

  • Максимальная мощность, кВт (л.с.) / об. мин.

  • Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.

  • Рекомендуемое топливо

  • Объем топливного бака, л

  • Динамические характеристики
  • Максимальная скорость, км/ч

  • Время разгона 0-100 км/ч, с

  • Расход топлива
  • Городской цикл, л/100 км

  • Загородный цикл, л/100 км

  • Смешанный цикл, л/100 км

  • Масса
  • Снаряженная масса, кг

  • Технически допустимая максимальная масса, кг

  • ..»>

    Максимальная масса прицепа без тормозной системы /…

  • Трансмиссия
  • Тип трансмиссии

  • Передаточное число главной передачи

  • Подвеска
  • Передняя

  • Задняя

  • Шины
  • Размерность

  • Lada Niva 4×4 3дв. 2021 обзор, комплектации и цены, характеристики

    Обзор LADA 4×4 3 дв.

    LADA 4×4. Создана для приключений

    Трудные дорожные условия. Теснота городских кварталов. Бескрайние поля и лесные тропинки… Это среда обитания LADA 4х4, она была, есть и будет. Именно поэтому LADA 4х4 входит в число самых легендарных автомобилей мира, вызывающих восхищение миллионов людей.

    Отличное сочетание компактности, проходимости и комфортной цены – это делает LADA 4х4 необыкновенно популярной. Сохраняя выдающие внедорожные свойства и узнаваемый стиль, мы сделали автомобиль более комфортным, более функциональным и безопасным.

    Добро пожаловать в мир LADA 4х4! Мир, в котором для вас открываются совершенно новые возможности!

    Новая эргономичная панель приборов. Увеличенный вещевой ящик, а главное – более удобная система управления отоплением и вентиляцией с тремя вращающимися рукоятками и электроприводом заслонок отопителя.

    Система экстренного оповещения обязательна для современных автомобилей.

    Более комфортные передние кресла получили развитую боковую поддержку и новый механизм складывания.

    Новый интерьер

    Цельноформованная обивка потолка, новые сиденья и панель приборов – современные стилевые решения идеально вписались в классический облик LADA 4х4.

    Улучшенная шумоизоляция

    Модернизированные опоры силового агрегата снизили уровень вибраций, а кроме того, на панели кузова и защиту моторного отсека наклеены дополнительные шумо-виброгасящие элементы.

    Комплектации и цены

    Индикация незастегнутого ремня безопасности водителя
    Крепления для детских сидений ISOFIX
    Корректор света фар гидравлический
    Дневные ходовые огни
    Антиблокировочная система тормозов с усилителем экстренного торможения (ABS+BAS)
    Электронная система распределения тормозных усилий (EBD)
    Обивка сидений тканевая
    Инструмент водителя: домкрат, ключ комбинированный колесный
    Оригинальная обивка сидений
    Гидроусилитель рулевого управления
    Легкая тонировка стекол
    Подогрев передних сидений
    Кондиционер
    Точки крепления прицепного устройства
    Колеса штампованные 16»
    Запасное колесо штампованное полноразмерное 16»
    Декоративные наклейки на боковинах
    Колеса литые 16»
    Окраска кузова металлизированная

    Характеристики

    Колесная формула / ведущие колеса
    Расположение двигателя
    Тип кузова / количество дверей
    Длина / ширина / высота, мм
    База, мм
    Колея передних / задних колес, мм
    Дорожный просвет, мм
    Объем багажного отделения в пассажирском / грузовом. ..
    Тип двигателя
    Система питания
    Количество, расположение цилиндров
    Рабочий объем, куб. см
    Максимальная мощность, л.с. / кВт / об. мин.
    Максимальный крутящий момент, Нм / об. мин.
    Топливо
    Максимальная скорость, км/ч
    Время разгона 0-100 км/ч, с
    Городской цикл, л/100 км
    Загородный цикл, л/100 км
    Смешанный цикл, л/100 км
    Снаряженная масса, кг
    Полная масса, кг
    Объем топливного бака, л
    Допустимая полная масса буксируемого прицепа с. ..
    Допустимая полная масса буксируемого прицепа без…
    Тип трансмиссии
    Передаточное число главной пары
    Передняя
    Задняя

    Фотографии

    Экстерьер

    Интерьер

    Руководства по эксплуатации

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 26.10.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 07.07.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 03.06.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 24.03.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 02.03.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 20.01.20

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 05.12. 19

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 04.09.19

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 04.06.19

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 07.09.18

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 08.06.18

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 30.05.18

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 28.12.17

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 08.06.17

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 13.03.17

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 31.01.17

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 18.01.17

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 23.12.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 26.09.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 26.05.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 18.04.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 07.04.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 03. 02.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 25.01.16

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 02.02.15

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 12.12.14

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 05.08.14

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 12.09.11

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 16.08.10

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 25.06.08

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 16.10.07

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 10.10.07

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 15.05.07

      Руководство по эксплуатации LADA 4х4 от 22.02.07

    LADA 4×4 Bronto – Руководство по эксплуатации – Первый Лада Центр, Краснодар.

    Отправляя сообщение, я соглашаюсь с политикой обработки персональных данных, выражаю свое согласие и разрешаю Первый Лада Центр (ООО «Центр-Моторс»), а также, по их поручению, третьим лицам осуществлять обработку моих персональных данных (фамилия, имя, отчество, год, месяц, дата и место рождения; адрес, номер паспорта и сведения о дате выдачи паспорта и выдавшем его органе; образование, профессия, место работы и должность; домашний, рабочий и мобильный телефоны; адрес электронной почты и другие данные, требуемые для отправки сообщения), включая сбор, систематизацию, накопление, хранение, уточнение, использование, распространение (в том числе трансграничную передачу), обезличивание, уничтожение персональных данных), в целях связанных с возможностью предоставления информации о товарах и услугах, которые потенциально могут представлять интерес, а также в целях сбора и обработки статистической информации и проведения маркетинговых исследований. Согласие на обработку персональных данных в соответствии с указанными выше условиями я предоставляю на 10 (десять) лет. Я уведомлен и согласен с тем, что указанное согласие может быть мной отозвано посредством направления письменного заявления заказным почтовым отправлением с описью вложения, либо вручено лично под подпись.

    «Нива» обновляется

    АВТОВАЗ провел серьезный рестайлинг внедорожника LADA Niva. Автомобиль получил новое имя – с приставкой Travel – и полностью новый экстерьер. Машина стала выглядеть современнее и эффектнее. Здесь и прищуренные фары, и светодиодная лента фонарей. Защитный обвес кузова теперь стал достаточно брутальным. Напоминающий: перед нами настоящий внедорожник с постоянным полным приводом. Рассказываем об истории автомобиля.

    «Нива» номер один

    История разработки началась в 1970 году, когда ведущим конструкторским бюро автопрома СССР была поставлена задача придумать автомобиль для жителей сельской местности, который объединил бы в себе повышенную проходимость с комфортом «легковушек». Первый полноприводный ВАЗ-2121 «Нива» сошел с конвейера Волжского автозавода более 43 лет назад. Довольно быстро новая машина набрала популярность, причем не только на родине, но и за рубежом. За свою историю «Нива» прошла несколько циклов модернизации, а в 2005 году сменила название на LADA 4х4.


    С 1977 года выпущено более 2 млн внедорожников LADA 4х4. Сегодня LADA 4х4 производится в Тольятти и Казахстане, а раньше ее сборка была организована в Греции, Эквадоре, Украине, Египте. 

    За свою карьеру LADA 4х4 покорила все шесть континентов, включая Антарктиду, единственной среди автомобилей АВТОВАЗа официально поставлялась в Японию, побывала на Северном полюсе и стала звездой мирового кино. Автомобиль три раза триумфально приходил на финиш ралли «Париж − Дакар», получив две серебряных и одну бронзовую награды. 

    LADA 4х4 входит в число самых продаваемых в России автомобилей сегмента кроссоверов и внедорожников и является одним из самых массовых и ликвидных на вторичном рынке, что говорит о настоящей народной любви к автомобилю, которому до сих пор нет альтернативы. Ведь это самый доступный внедорожник, который уже много лет выручает нас, помогает проехать там, где даже пешком не пройдешь, позволяет открыть для себя природу и новые виды активного отдыха.

    «Нива» номер два

    Автомобиль, о котором идет речь, уникален. По сути, это второе поколение всемирно известной «Нивы». Российская разработка, которую транснациональный концерн «Дженерал Моторс» приобрел и продавал под своим международным брендом!

    Однако начиналось производство под логотипом LADA. Тогда, в 2000-2002 годах, было выпущено около тысячи этих внедорожников с ладьей на решетке радиатора. А с сентября 2002-го заработало совместное предприятие «Джи Эм-АВТОВАЗ». 18 лет автомобиль был известен российскому покупателю как «Шевроле Нива». С конвейера сошло более 700 тыс. этих внедорожников. При этом современная машина отличается от первых образцов довольно существенно: за прошедшее время «Нива» получила около 2 тыс. конструктивных изменений.


    Обязанности совместного предприятия делились так: АВТОВАЗ выпускает кузов, мотор и шасси, а партнеры занимаются окраской и финальной сборкой. Сейчас, после того как АВТОВАЗ выкупил долю «Джи Эм», это производство – стопроцентное подразделение российского автозавода и называется оно «ЛАДА ЗАПАД Тольятти». Можно сказать, тогда совместное предприятие было началом интеграции АВТОВАЗа в мировой автопром. Сегодня, вместе с Renault, эта интеграция состоялась в полной мере.

    С июля 2020 года внедорожник Niva снова производится под маркой LADA: волжская ладья расположена на решетке радиатора и ступице руля. Маленькое конструктивное изменение, но важное событие в истории бренда LADA и этой конкретно модели.

    Но еще за несколько месяцев до этого «Нива» переехала в автосалоны LADA. Поскольку это автомобиль универсальный, предлагаются как городские опции, вроде кондиционера, обогрева лобового стекла и мультимедиа, так и внедорожные – шноркель, защита трансмиссии. При этом «Нива» была и остается настоящим честным внедорожником, у нее постоянный полный привод, предусмотрена понижающая передача и блокировка межосевого дифференциала. Для окраски кузова используется десять цветов, включая камуфляж под названием «Рыбак» − даже в этом названии есть отсылка к целевой аудитории. Кстати, по статистике, половина владельцев «Нивы» при смене автомобиля снова покупают ее. И теперь они смогут приобрести любимый внедорожник уже под российским брендом.
     

    История продолжается

    21 декабря 2020 года на тольяттинском заводе началось серийное производство новой «Нивы» – LADA Niva Travel.  

    Основные отличия от предыдущих моделей – во внешности. Дизайн автомобиля стал более выразительным и современным. Первой машиной новой линейки стала версия Off-road, оснащенная штатным шноркелем для преодоления бродов, внедорожными шинами и обвесом из неокрашенного пластика.


    Со временем LADA Niva Travel полностью заменит собой предыдущую версию автомобиля. Но, как и прежде, продаваться она будет параллельно с классической LADA 4х4.

    Продажи новой модели АВТОВАЗа должны стартовать в ближайшее время. «С возвращением легендарного названия Niva в семью LADA мы открываем новую страницу в его истории. Хочу вас заверить, что в ближайшие годы с этим именем будет связано много важных и интересных новостей», − заявил президент АВТОВАЗа Ив Каракатзанис.

    LADA (ВАЗ) ЛАДА 212140 ЛАДА 4Х4 LADA 212140 LADA 4Х4 1,7 MT (80 лс) цвета темно-вишневый 2010 года выпуска VIN XTA21214*A1****92

    LADA (ВАЗ) ЛАДА 212140 ЛАДА 4Х4 LADA 212140 LADA 4Х4 1,7 MT (80 лс)

    Модель
    LADA (ВАЗ) ЛАДА 212140 ЛАДА 4Х4 LADA 212140 LADA 4Х4
    Привод
    Полный
    Цвет
    темно-вишневый
    Объем двигателя, куб. см.
    1 700
    Год выпуска
    2010
    Мощность, лс
    80
    Кузов
    Внедорожник 3 дв.
    Тип топлива
    Бензин
    Состояние
    Хорошее
    Владельцев по ПТС
    один
    Модификация
    1,7 MT (80 лс)
    Пробег, км
    92 732

    Обращаем Ваше внимание на то, что информация, размещенная на данном сайте, носит исключительно информационный характер и не является публичной офертой, определяемой положениями статьи 437 Гражданского кодекса Российской Федерации. Все изображения и фотографии, размещенные на данном сайте, выполняют иллюстративную функцию.

    комплектации и цены от официального дилера

    Колёсная база

    2700

    Размер колёс

    185/75/R16

    Ширина задней колеи

    1420

    Ширина передней колеи

    1440

    Объем багажника мин/макс, л

    420/780

    Объём топливного бака, л

    65

    Полная масса, кг

    1850

    Снаряженная масса, кг

    1425

    Количество передач

    5

    Коробка передач

    механика

    Тип привода

    полный

    Подвеска и тормоза

    Задние тормоза

    барабанные

    Передние тормоза

    дисковые

    Тип задней подвески

    зависимая, пружинная

    Тип передней подвески

    независимая, пружинная

    Эксплуатационные показатели

    Максимальная скорость, км/ч

    137

    Марка топлива

    АИ-95

    Разгон до 100 км/ч, с

    19

    Расход топлива, л город

    Расход топлива, л город/смешанный

    Расход топлива, л город/трасса/смешанный

    12. 1/8.3/9.9

    Расход топлива, л смешанный

    Диаметр цилиндра и ход поршня, мм

    82 × 80

    Количество цилиндров

    4

    Максимальная мощность, л. с./кВт при об/мин

    83 / 61 при 5000

    Максимальный крутящий момент, Н*м при об/мин

    129 при 4000

    Объем двигателя, см³

    1690

    Расположение двигателя

    переднее, продольное

    Расположение цилиндров

    рядное

    Степень сжатия

    9. 3

    Тип двигателя

    Тип наддува

    нет

    Название рейтинга

    Оценка безопасности

    Аккумуляторная батарея

    Запас хода на электричестве, км

    smfBox — это платформа с открытым исходным кодом для одномолекулярного FRET

    Здесь мы представляем smfBox 18 , экономичную конфокальную платформу, способную измерять эффективность FRET между парами красителей на свободно диффундирующих одиночных молекулах, с использованием переменного переменного лазерного возбуждения (ALEX) 19 для проверки правильности стехиометрии красителя и определения точных поправочных коэффициентов FRET 5,20,21 . SmfBox (рис. 1a, b) сконструирован из легкодоступных оптических и оптомеханических компонентов, заменяя дорогой корпус микроскопа обработанным анодированным алюминием, который образует светонепроницаемую коробку, в которой находятся дихроичный возбуждающий элемент, объектив, линзы и точечное отверстие ( см. дополнительное примечание 1, дополнительный фильм 1 и онлайн 18 для полного списка деталей и анимированных протоколов построения и выравнивания).В собранном виде smfBox достаточно светонепроницаем, чтобы обеспечить безопасную и эффективную работу в условиях окружающего освещения, как лазерный продукт класса I (устраняя необходимость в обучении пользователя лазерной безопасности). SmfBox может работать либо с настраиваемым программным обеспечением LabVIEW для сбора данных, либо с автономным пользовательским интерфейсом, написанным на C ++. Обе версии программного обеспечения предоставляют все необходимые функции для настройки микроскопа (юстировка и фокусировка) и записи данных (рис. 1c и дополнительные примечания 2 и 3).Необработанные данные, включая время прихода фотонов и идентификатор детектора, сохраняются в формате данных Photon-HDF5 с открытым исходным кодом (дополнительное примечание 4) 22 и впоследствии могут быть проанализированы с помощью модуля Python FRETBursts 23 с использованием Jupyter Предоставленные ноутбуки (дополнительное примечание 6 и онлайн 18 ) или с пакетом MATLAB на основе графического интерфейса пользователя PAM 24 .

    Рис. 1: smfBox и smFRET.

    a Схема smfBox с деталями, обозначенными в соответствии с дополнительными таблицами 1, 2 и 4.Лазеры коллимируются (L1), обрезаются (Iris) и направляются двумя зеркалами (M1, M2) на светоделитель 10:90 (BS1). 10% луча фокусируется на фотодиоде для непрерывного измерения мощности и контроля цикла чередования. 90% луча направляется через дихроичное зеркало 1 (DC1) на объектив. Свет от заднего отражения отражается DC1 и BS1 на камеру CCD для точной фокусировки. Флуоресцентное излучение образца проходит через дихроичную схему возбуждения (DC1) и фокусируется в точечном отверстии (P1) для удаления света, находящегося вне фокуса, перед тем как разделиться по цвету (DC2) на один из двух лавинных фотодиодов (APD0, APD1). b 3D модель готового smfBox со снятой передней панелью корпуса микроскопа. Предоставляется файл САПР собранного инструмента (Дополнительные данные 1) вместе с анимированной последовательностью сборки (Дополнительный фильм 1). c Блок-схема платформы smfBox, демонстрирующая функциональные возможности программного обеспечения для сбора данных. d Схема: одиночные молекулы диффундируют через конфокальный объем (время пребывания ~ 1 мс), созданный путем фокусировки лазеров в пятно, почти ограниченное дифракцией, и использования точечного отверстия для разделения излучаемого света в тонкой фокальной плоскости.Лазеры (515 нм и 638 нм) чередуются (20 кГц), чтобы обеспечить многократное возбуждение донорных и акцепторных красителей для каждой молекулы. e Типичная временная диаграмма для эксперимента smFRET. Молекулы с флуоресцентной меткой диффундируют через конфокальный объем, испуская вспышки флуоресценции. Отдельные фотоны, генерируемые излучением донора при возбуждении донора (DD — зеленый), регистрируются на APD0. APD1 регистрирует фотоны, испускаемые акцептором либо при возбуждении донора (DA — красный), либо при прямом возбуждении акцептора (AA — фиолетовый). f 2D ES-гистограмма, показывающая нескорректированную эффективность FRET (E *) и стехиометрию (S). Молекулы только-донора появляются с низким значением E *, но высоким S, а молекулы только-акцептора появляются с низким S. при переменном лазерном возбуждении (рис. 1г, д). Излучение при возбуждении зеленым цветом используется для определения эффективности FRET (E; дополнительное уравнение 1), в то время как реакция на красный лазер подтверждает присутствие активного акцептора в молекуле и позволяет рассчитать параметр стехиометрии (S; дополнительное уравнение . 2) и все параметры коррекции, необходимые для точного определения FRET (Дополнительные уравнения 3–5) 5,20,21 . Точный цикл ALEX smfBox может быть полностью настроен, позволяя использовать более быстрые или более медленные циклы, периодическое возбуждение акцептора (PAX) 25 или асимметричную схему ALEX, которая, как мы показываем, может уменьшить ширину гистограмм FRET, тем самым увеличивая разрешение различных видов FRET (дополнительное примечание 7). Кроме того, конструкция smfBox включает в себя светоделитель 10:90 на пути возбуждения, направляющий свет возбуждения на фотодетектор (рис.1а), чтобы обеспечить точный мониторинг мощности обоих лазеров в реальном времени во время эксперимента, который может быть сохранен в файл HDF5. Для этой настройки предусмотрены наши оптимальные значения мощности лазера, диаметра диафрагмы и цикла ALEX по умолчанию (см. Методы).

    Чтобы проверить производительность smfBox, мы измерили эффективность FRET трех стандартов ДНК (рис. 2a), которые недавно были охарактеризованы в нескольких лабораториях с использованием ряда коммерческих и самодельных микроскопов 5 . Используя опубликованные процедуры исправления, реализованные в нашем анализе Python с открытым исходным кодом (записные книжки Jupyter — дополнительное примечание 6), мы получили данные, полностью согласующиеся с данными из других лабораторий в слепом исследовании.Это обеспечивает как отличную проверку smfBox, так и полезную диагностику для пользователей, позволяющих тестировать собственные сборки этого прибора, поскольку успешное воспроизведение этих данных означает, что все оборудование, программное обеспечение для сбора и анализа данных должно работать правильно.

    Рис. 2: Эксперименты по проверке smfBox.

    a Полностью скорректированные гистограммы эффективности FRET трех стандартов ДНК с двойной меткой (1a, 1b и 1c, рисунки с доступными для красителя объемами; последовательности см. В дополнительном примечании 5), измеренные с помощью smfBox (серый). Вертикальные черные линии и кривые показывают гауссовское соответствие наших данных, E = 0,17 ± 0,07, E = 0,57 ± 0,1, E = 0,77 ± 0,07 (среднее ± стандартное отклонение), по сравнению с результатами из 20 других лабораторий. часть сравнительного исследования нескольких лабораторий 5 (красные кресты — дополнительное примечание 6). b Гистограммы отношения близости (нескорректированная эффективность FRET) шпильки ДНК при указанных концентрациях соли (см. Дополнительное примечание 5). c Степень открытия шпильки ( k открыта ) и закрывания ( k закрытие ), определенная с помощью анализа динамического распределения фотонов (dPDA) > 1000 молекул на технический повтор на каждый [NaCl]) — Исходные данные представлены в файле исходных данных. d Гистограммы отношения близости шпилек с высоким, средним и низким FRET (при 300 мМ NaCl). Данные (серый) были подогнаны с использованием dPDA (черный) к модели с двумя состояниями, включающей замкнутую популяцию (синий), открытую популяцию (оранжевый) и взаимопревращающую динамическую популяцию (желтый). e График скоростей, определенных из dPDA девяти наборов данных для каждой шпильки, каждая из которых содержит 2000 молекул, с указанием среднего и стандартного отклонения для наборов данных, со средним значением хи-квадрат подгонок, нанесенным справа.

    Кроме того, мы продемонстрировали способность smfBox восстанавливать скорость молекулярной конформационной динамики, используя шпильки ДНК в качестве тестовой системы (рис. 2b). Было показано, что шпильки ДНК взаимно преобразуются между закрытым и открытым состояниями со скоростью, зависящей от концентрации NaCl 26,27 , в пределах временных масштабов, доступных для экспериментов smFRET (см. Дополнительное примечание 8). Во-первых, мы воспроизвели данные для шпильки, использованной в недавнем исследовании 26 , используя динамический анализ распределения фотонов (dPDA) 4 , чтобы определить скорость открытия и закрытия для ряда концентраций NaCl (рис.2в). Затем мы проанализировали еще две шпильки (рис. 2d), идентичные по последовательности ДНК, но с меньшим и большим межфлюорофорным расстоянием в закрытом состоянии, чтобы проверить влияние величины изменений эффективности FRET на точность извлеченных образцов. кинетические параметры. Как и следовало ожидать, скорости взаимопревращения шпильки с закрытым состоянием с более высокой эффективностью FRET могут быть определены более точно, тогда как анализ шпильки с более низким FRET дал более вариабельные результаты (рис.2д). В случаях, когда статические виды (с низким FRET и высоким FRET) в значительной степени перекрываются друг с другом (и, следовательно, с динамической популяцией), модель dPDA менее ограничена, что приводит к большему разбросу значений восстановленных показателей для данный размер выборки. Эти результаты имеют значение для оптимального размещения красителей FRET при разработке динамических экспериментов.

    Хотя описываемый нами микроскоп создан для конфокального SMFRET ALEX, его модульная конструкция позволяет легко расширить его до нескольких связанных методов. Без какого-либо дополнительного оборудования smfBox может выполнять флуоресцентную корреляционную спектроскопию (FCS — с использованием одного лазера непрерывного излучения) и кросс-корреляционную спектроскопию флуоресценции (FCCS — с использованием двух лазеров). Мы демонстрируем эту возможность, определяя константу диффузии для дуплексной ДНК (дополнительное примечание 10). Добавление одного или нескольких импульсных лазеров и электроники для коррелированного по времени однофотонного счета (TCSPC) сделает возможным проведение экспериментов по спектроскопии корреляции времени жизни флуоресценции (FLCS) и импульсному перемежающемуся возбуждению (PIE) 28 .Дальнейшее добавление поляризационных фильтров и двух дополнительных APD составило бы полную установку многопараметрического детектирования флуоресценции (MFD) 29 . Кроме того, добавление ступени XY к уже включенной ступени Z-позиционирования упростило бы любое количество методов визуализации путем сканирования образца. Список рекомендуемых компонентов для таких расширенных приложений можно найти в дополнительном примечании 9.

    В заключение, мы предоставили все необходимые инструкции и программное обеспечение, необходимые для создания и работы smfBox, экономичного микроскопа smFRET с открытым исходным кодом. с конкурентными возможностями 18 .Мы демонстрируем, что smfBox может определять абсолютную эффективность FRET с той же точностью, что и другие инструменты, используемые сообществом 5 , и может восстанавливать кинетику биомолекулярной межконверсии в диапазоне ~ 50-500 с -1 , в соответствии с предыдущими исследованиями 26 . Мы показали, что асимметричный рабочий цикл ALEX может уменьшить ширину гистограмм smFRET, увеличивая разрешение различных типов FRET. Наконец, мы экспериментально оценили способность определять кинетические скорости взаимного преобразования с помощью dPDA для систем с разной величиной изменений эффективности FRET, что дает полезную информацию для разработки динамических экспериментов smFRET. Мы ожидаем, что наш недорогой подход с открытым исходным кодом облегчит принятие smFRET более широким научным сообществом.

    Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    шаблонов шкалы ладов StewMac | stewmac.com

    Точные слоты для ладов без догадок. Предназначен для использования с нашей коробкой для резки под углом или вашей настольной пилой.

    Каждый шаблон изготовлен из прочной нержавеющей стали и имеет выемки для двух различных ладов. Включает установочный штифт и инструкции.

    Эти шаблоны обеспечивают точное позиционирование ладов для гитары, баса, банджо, мандолины или укулеле.
    # 4914 — # 4919 Шаблоны для гитары и баса допускают 24 слота для ладов. Шаблоны
    # 4911 баритон и # 4912 баса имеют 22 слота для ладов.
    # 4920 В шаблоне банджо / мандолины 22 лада для банджо и 29 для мандолины. Шаблон
    # 4909 для укулеле предоставит места для 18 ладов, а шаблон # 4910 укулеле будет располагать 20 слотов для укулеле.

    «Я попросил StewMac разработать шаблоны ладов для укулеле, потому что я очень впечатлен их шаблонами для гитарных гитар. Основываясь на моем опыте в области промышленного дизайна, я считаю, что стальные шаблоны StewMac более точны и надежны, чем акриловые шаблоны, которые ломаются легко и становятся менее точными по мере использования.И каждый шаблон имеет две длины шкалы по одной цене, так что это лучшая доступная цена ».
    —Марк Робертс, мастер-мастер

    Шаблоны имеют ширину 2-31 / 32 дюйма (75,5 мм) и толщину 5/64 дюйма (2,05 мм), нержавеющая сталь калибра 14

    Особые примечания:


    # 4915 Шкала Дредноута Мартина обычно упоминается как 25,4 «, но на самом деле 25,34».

    # 4916 Для Fender 25,5 «включает положение обрезки грифа и гайки. Также для 25-дюймовых гамм, таких как Paul Reed Smith ® , Dobro ® , Danelectro ® и Benedetto.

    # 4914 и # 4917 Мы предлагаем шаблоны для длинной шкалы Гибсона 25,3 дюйма плюс три более коротких шкалы Гибсона. На протяжении многих лет Гибсон называл каждую из более коротких шкал как 24-3 / 4 дюйма.

    Подробнее о длине шкалы


    Для использования с настольной пилой: Установите прилагаемый указательный штифт в упор настольной пилы. Прикрепите шаблон к задней части грифа. На настольной пиле выровняйте лезвие перпендикулярно накладке грифа и пропилите пазы шаблоном вверх.Мы рекомендуем полотно для настольной пилы для продольной резки.

    Для использования с угловой коробкой мастера: Просто прикрепите шаблон к задней части грифа и пропилите каждую прорезь лада после размещения указательного штифта (предварительно установленного в нашем угловом корпусе) в соответствующей выемке для шаблона. Мы рекомендуем нашу коробку для резки под углом.


    КАЛИФОРНИЯ ПРЕДЛОЖЕНИЕ 65 ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ

    Исследование доступности теломерных последовательностей с помощью FRET-PAINT: свидетельство зависящего от длины уплотнения теломер | Исследование нуклеиновых кислот

    Аннотация

    Одноцепочечные оверхенги теломеров имеют длину около 200 нуклеотидов и могут образовывать тандемные G-квадруплексные (GQ) структуры, которые снижают их доступность для нуклеаз и белков, активирующих ответ на повреждение ДНК.Неизвестно, будут ли эти тандемные GQ складываться дальше, образуя компактные надстройки, которые могут обеспечить лучшую защиту более длинных теломер. Мы сообщаем об одномолекулярных измерениях, где доступность 24–144 нуклеотидных молекул теломерной ДНК человека опрашивается короткой молекулой ПНК, которая комплементарна одиночному повтору GGGTTA, как это реализовано в методе FRET-PAINT. Связывание цепи PNA с доступными последовательностями GGGTTA приводит к дискретным всплескам FRET, которые анализируют с точки зрения их времени пребывания, частоты связывания и топографического распределения.Частоты связывания были больше для связывания с промежуточными областями теломерной ДНК по сравнению с 3′- или 5′-концами, что позволяет предположить, что эти области более доступны. Примечательно, что частота связывания на теломерный повтор монотонно снижается с увеличением длины теломер. Эти результаты согласуются с тем, что теломеры образуют более компактные структуры большей длины, что снижает доступность этих критических участков генома.

    ВВЕДЕНИЕ

    Теломеры человека состоят из длинных участков повторов гексануклеотида d (GGGTTA), которые заканчиваются 3′-одноцепочечным выступом, длина которого составляет несколько сотен нуклеотидов (нт) (1–5). После каждого раунда репликации теломеры укорачиваются до тех пор, пока не запустится старение или апоптоз, когда длина выступа укорачивается до ~ 50 нуклеотидов (6). Теломераза, обратная транскриптаза, удлиняет теломеры, добавляя повторяющиеся сегменты d (GGGTTA) к 3′-концу, используя матрицу РНК TERRA. Теломераза высоко экспрессируется в большинстве раковых клеток (7–9), тогда как в нормальных клетках ее активность очень низкая (10). Четыре повтора последовательности d (GGGTTA) образуют структуру G-квадруплекса (GQ) in vitro (11,12) и in vivo (13-17).Сложенные копланарные тетрады, стабилизированные спариванием оснований типа Хугстина и одновалентными катионами, являются характеристиками структуры GQ (18–20). Структуры GQ очень стабильны и, как предполагается, защищают в остальном уязвимые теломерные выступы от ферментативной активности за счет уменьшения их доступности (21). Человеческие теломерные GQ ингибируют активность теломеразы, делая концы теломеров недоступными для теломеразо-опосредованного удлинения (22-24). Этот потенциал в сочетании с их отчетливой планарной структурой сделал их привлекательной мишенью для противораковых препаратов, которые стабилизируют GQ против активности теломеразы (25).Следовательно, изучение доступности теломерных выступов человека и характеристик складывания теломерных GQ имеет большое значение.

    В многочисленных исследованиях сообщалось о взаимосвязи между условиями раствора и стабильностью, топологией и путями сворачивания одиночных молекул GQ (20,24,26–30) и их взаимодействием с небольшими молекулами, стабилизирующими GQ (31). Их стабильность против связывающих оцДНК белков (32,33) и геликаз (34–36) также была исследована. Однако теломерные выступы достаточно длинные, чтобы вмещать ~ 10 тандемных GQs, которые могут формировать структуры более высокого порядка, которые влияют на общую доступность теломер (37-39).Достижения в синтезе теломерных повторов высокой чистоты, значительно более длинных, чем обычно используемые четыре d (GGGTTA) повтора, позволили расширить биофизические исследования на последовательности, которые лучше имитируют теломерные выступы. Более ранние работы (40–47) были сосредоточены на понимании структур, образованных множественными GQ, потенциальных взаимодействий между ними и того, как такие взаимодействия влияют на общую компактность и стабильность. Однако консенсуса по этим вопросам пока не достигнуто. Различные исследования обнаружили незначительные взаимодействия, стабилизирующие взаимодействия стекирования или нарушенное сворачивание и дестабилизирующие взаимодействия из-за соседних свернутых GQ, т.е.е. отрицательное сотрудничество. Краткое изложение этих исследований приводится ниже. Для краткости последовательность d (GGGTTA) будет называться «G-Tract» в этом резюме и остальной части рукописи.

    Используя биофизические анализы, Yu et al. пришел к выводу, что теломерные последовательности, которые содержат 8-16 G-трактов, образуют последовательные тандемные GQ, связанные с линкерами TTA, наподобие beads-on-a-string, с незначительными взаимодействиями стэкинга между GQ (40). Используя аналогичные методы и моделирование молекулярной динамики, Petraccone et al. предположил, что последовательности, содержащие 8-12 G-трактов, образуют структуры более высокого порядка с двумя или тремя смежными GQ, соответственно (41). Два исследования с помощью атомно-силовой микроскопии на теломерной последовательности длиной 96 нуклеотидов дали разные результаты, где Xu et al. сообщил о формировании компактной структуры из четырех тандемных GQ (42), в то время как Wang et al. сообщил только о двух тандемных GQ (43). В исследовании оптического пинцета Punnoose et al. сообщил, что GQs формируются случайным образом в длинных выступах теломер в течение секунд, но эти GQ были отделены друг от друга неструктурированными G-трактами (44).Это наблюдение было оправдано тем, что в процессе сворачивания преобладала кинетика, а не термодинамика. Используя электронную микроскопию, Kar et al. показали, что очень длинные (до 20000 нуклеотидов) теломерные последовательности человека в одноцепочечной ДНК (оцДНК) могут спонтанно конденсироваться в цепочки больших дискретных бусообразных частиц двух разных размеров, сжимая теломерные ДНК почти в 12 раз по длине ( 45). В исследовании ЯМР Sannohe et al. предложил образование стержневидных структур высшего порядка в Br G-замещенных теломерных олигонуклеотидах человека (46).В другом биофизическом исследовании Vorlíčková et al. сообщил, что термостабильность GQs снижается с увеличением числа G-Tract для 1-17 длинных теломерных последовательностей G-Tract, подтверждая дестабилизирующие взаимодействия между тандемными GQs (47). Учитывая чувствительность конформации и стабильности даже одного теломерного GQ к условиям отжига, хранения и ионным условиям (48), мы полагаем, что некоторые расхождения между этими исследованиями связаны с факторами, связанными с подготовкой образцов и условиями анализа.

    В этом исследовании мы исследовали, как доступность теломер изменяется в зависимости от длины последовательности и положения сайтов-мишеней внутри теломер. Последовательности теломерной ДНК, содержащие 4–24 G-тракта (24–144 нуклеотида), которые могут образовывать 1–6 тандемных GQ, были исследованы на уровне одной молекулы с использованием метода FRET-PAINT (49,50), который объединяет DNA-PAINT ( 51) (Накопление точек для визуализации в наномасштабной топографии) с помощью спектроскопии резонансного переноса энергии Фёрстера одиночных молекул (smFRET). DNA-PAINT использовался в качестве метода сверхвысокого разрешения, поскольку он позволяет флуоресцентно меченным ДНК-зондам временно связываться с различными областями системы и позволяет локализовать сайты связывания с высокой точностью. Накапливая большие наборы таких событий связывания и локализации, распределенных во времени, стало возможным создавать структуры за пределами дифракционного предела. Теломерные последовательности, которые были исследованы в этом исследовании, также имеют несколько сайтов связывания (G-тракты), которые распределены по теломерному выступу и не обязательно статичны.Следовательно, опрос таких сайтов с помощью зондов, которые временно связываются, может выявить детали лежащих в основе структур. Однако теломерные последовательности образуют компактные структуры, которые имеют характерную длину в диапазоне 1-10 нм, что сложно разрешить даже для микроскопии сверхвысокого разрешения. С другой стороны, это идеальный диапазон для smFRET, который побудил нас синтезировать элементы DNA-PAINT, такие как временное связывание флуоресцентно меченых нуклеиновых кислот, с помощью спектроскопии smFRET, которая позволяет разрешать субнанометровые расстояния в масштабе длины интерес.

    В нашем подходе короткая цепь пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), которая комплементарна одному G-тракту и флуоресцентно помечена акцепторным флуорофором (Cy5), вводится в микрофлюидный канал, который содержит иммобилизованную на поверхности частичную дуплексную ДНК. (pdDNA) конструкции. Конструкции pdDNA помечены донорным флуорофором (Cy3) и содержат теломерные последовательности на своих выступах (рис. 1A и B). Cy3-pdDNA с иммобилизованной поверхностью служит в качестве стыковочной конструкции, а Cy5-PNA — в качестве цепи формирования изображения.Молекула Cy5-PNA временно связывается с G-трактами, которые не являются частью GQ, что приводит к сигналу FRET, который варьируется в зависимости от того, насколько далеко Cy5-PNA связывается с Cy3. Используя достаточно низкую концентрацию Cy5-PNA, каждое событие связывания и диссоциации можно детектировать отдельно от других событий. Мы определили, как частота, время пребывания и топография событий связывания меняются для шести различных конструкций ДНК, которые могут образовывать 1–6 GQ. Для каждой из этих конструкций мы также охарактеризовали, как время пребывания и частота связывания изменяются для разных сегментов последовательности, например.грамм. 3 ‘конец, средняя часть или 5’-конец.

    Рисунок 1.

    Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Частичные дуплексные конструкции ДНК были образованы из биотинилированной короткой цепи (меченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепи, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA. Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно.( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции pdDNA иммобилизованы на ПЭГилированной поверхности посредством связывания биотин-нейтравидин. Донорный флуорофор возбуждается в режиме ПВО лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени, прежде чем диссоциировать. Эти события связывания приводят к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET.( C ) Пример графика времени smFRET, который показывает пять событий связывания с одним теломерным выступом. Время выдержки для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам выступа приводит к разным уровням FRET.

    Рисунок 1.

    Схема конструкций ДНК и пример трассировки smFRET. ( A ) Частичные дуплексные конструкции ДНК были образованы из биотинилированной короткой цепи (меченной донорным флуорофором Cy3) и более длинной цепи, которая содержит теломерный выступ с 4–24 повторами последовательности GGGTTA.Для краткости показаны только три из шести исследованных конструкций. Конструкции 4G-Tract, 16G-Tract и 24G-Tract могут складываться максимум в один, четыре и шесть тандемных GQ соответственно. ( B ) Схема поверхности канала smFRET, где конструкции pdDNA иммобилизованы на ПЭГилированной поверхности посредством связывания биотин-нейтравидин. Донорный флуорофор возбуждается в режиме ПВО лазерным лучом с длиной волны 532 нм. Нить ПНК, которая помечена акцепторным флуорофором (Cy5), комплементарна G-тракту и связывается с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени, прежде чем диссоциировать.Эти события связывания приводят к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET. ( C ) Пример графика времени smFRET, который показывает пять событий связывания с одним теломерным выступом. Время выдержки для одного из этих событий связывания указано оранжевыми стрелками. Привязка к разным сегментам выступа приводит к разным уровням FRET.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    ДНК-конструкций

    Последовательности

    ДНК и ПНК приведены в дополнительной таблице S1.Конструкции пдДНК были получены путем отжига короткой (18 нт) стволовой цепи с биотином на 3′-конце и Cy3 на 5′-конце, а также длинной цепи, которая содержит последовательность, комплементарную стеблю и 4-24 G-трактам. . Две нити нагревали до 95 ° C в течение 3 минут с последующим охлаждением до 30 ° C с шагом снижения температуры 5 ° C и ожиданием в течение 3 минут на каждом этапе в термоциклере (Hybaid Omn-E Thermal Cycler). . Реакцию отжига проводили при 150 мМ KCl и 2 мМ MgCl 2 (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовались 150 мМ LiCl и 2 мМ MgCl 2 ).

    Длинные цепи с 8–24 G-трактами были приобретены у Eurofins Genomics (Луисвилл, Кентукки, США) без дополнительной очистки, в то время как неочищенный 4G-тракт и очищенная с помощью ВЭЖХ стеблевая цепь были приобретены у Integrated DNA Technologies (Coralville, IA , США). Все неочищенные нити очищали в лаборатории с использованием денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). Дополнительный рисунок S1 показывает рентгенограммы денатурирующего PAGE для очищенных олигонуклеотидов ДНК, меченных радиоактивным изотопом Phosphorus-32.Очищенная с помощью ВЭЖХ короткая стыковочная цепь Cy5-PNA была приобретена у PNA Bio (Thousand Oaks, CA, USA). Схемы конструкций pd-4G-Tract, pd-16G-Tract и pd-24G-Tract показаны на рисунке 1A, где предполагались антипараллельная конформация GQ и максимальное количество укладок GQ.

    Подготовка проб и анализ smFRET

    Просверленные лазером кварцевые предметные стекла и покровные стекла были тщательно очищены гидроксидом калия (КОН) и ацетоном с последующим травлением пираньи, нанесением аминосиланового покрытия и пассивацией на основе сложного эфира NHS полиэтиленгликоля (ПЭГ).Смесь ПЭГ с соотношением м-ПЭГ-5000: биотин-ПЭГ-5000 (Laysan Bio Inc.) 100: 2 (Laysan Bio Inc.) использовали для пассивации поверхности. ПЭГ запрещает неспецифическое связывание молекул ДНК и ПНК с поверхностью, тогда как биотин-ПЭГ-5000 предлагает точку прикрепления для молекул биотинилированной ДНК, которые соединяются с биотин-ПЭГ через нейтравидин. Дополнительный раунд ПЭГилирования проводили с использованием небольшого (333 Да) МС (ПЭГ) 4 (приобретенного у Thermofisher Scientific) для уплотнения слоя ПЭГ. Камеры для образцов были подготовлены путем наложения двусторонней ленты между предметным стеклом и покровным стеклом, оба из которых были ПЭГилированы.Камеру обрабатывали 1% (об. / Об.) Tween-20 (15 мин инкубации) с последующей обширной промывкой и введением 0,01 мг / мл нейтравидина.

    Образцы пдДНК разводили до ~ 40 пМ в несколько этапов и инкубировали в камере для образцов в течение 2–5 минут при 150 мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовалось 150 мМ LiCl) и 2 мМ MgCl 2 , который также сохраняется при всех измерениях. Затем камеры промывали буфером для визуализации для удаления избытка ДНК.Этот протокол привел к иммобилизации 300–330 молекул на область изображения ∼50 × 100 мкм 2 . Буфер для визуализации содержал трис-основание (50 мМ, pH 7,5), 2 мМ Trolox, 0,8 мг / мл глюкозы, 0,1 мг / мл глюкозооксидазы, 0,1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 мМ MgCl 2 и 150. мМ KCl (за исключением некоторых наборов данных на дополнительных рисунках S2 и S3, где использовалось 150 мМ LiCl вместо 150 мМ KCl) и 40 нМ Cy5-PNA. Исходный раствор цепи Cy5-PNA нагревали в течение 10 мин при 85 ° C для увеличения растворимости.После извлечения его из термостата пробирка, содержащая ПНК, оставлялась при комнатной температуре на 15 мин, прежде чем она была разбавлена ​​в 100 раз раствором для визуализации. Раствор для визуализации, содержащий Cy5-PNA, инкубировали с молекулами ДНК в канале в течение 15 минут до видеозаписи. Фильмы из 2000 кадров были записаны при времени интегрирования кадров 100 мс / кадр.

    FRET-PAINT

    Схема анализа FRET-PAINT представлена ​​на рисунке 1B. При возбуждении лазерным лучом на длине волны 532 нм образцы пдДНК с иммобилизованной поверхностью, меченные Cy3, дают почти нулевой FRET, если только цепь Cy5-PNA не связывается с G-трактом на выступе.Всплески интенсивности акцептора и эффективности FRET происходят, когда Cy5-PNA связывается с G-трактом.

    Настройка визуализации

    Измерения проводились с использованием флуоресцентной установки полного внутреннего отражения (TIR) ​​призменного типа, оснащенной микроскопом Olympus IX-71 и камерой Andor IXON EMCCD (IXON DV-887 EMCCD, Andor Technology, CT, США, теперь часть Oxford Instruments). Камера IXON имеет размер 512 × 512 пикселей и размер пикселя 16 мкм. Донорный флуорофор возбуждали лазерным лучом с длиной волны 532 нм (Spectra Physics Excelsior).Водный объектив Olympus (60 ×, 1,20 NA) использовался для сбора сигнала флуоресценции. Общее увеличение в нашей установке составляет 90x, что дает эффективный размер пикселя 178 нм. Интенсивность лазерного луча составляла примерно 1 кВт / см 2 .

    Анализ данных

    Записанные фильмы были проанализированы с использованием специального программного обеспечения, написанного на C ++, для создания временных графиков интенсивности донора ( I D ) и интенсивности акцептора ( I A ) для каждой молекулы.Используя специальный код MATLAB, временные кривые были проверены, чтобы убедиться, что они представляют отдельные молекулы. Фон вычитали из каждой из этих выбранных молекул, которые затем использовали для определения времени пребывания, частоты связывания и распределений FRET, представленных в этой рукописи. Эффективность FRET ( E FRET ) была рассчитана с использованием E FRET = I A / ( I A + I D ).Гистограммы популяции E FRET (фиг. 2A) были построены из отобранных следов одиночных молекул, которые показали по крайней мере одно событие связывания цепи Cy5-PNA. Вклад молекул был нормализован таким образом, чтобы каждая молекула вносила равный вклад в гистограмму, а общая популяция гистограммы была нормализована до 100%. Отобранные одиночные молекулы, которые не показали никакого события связывания, способствовали возникновению пика только для донора (DO), что связано с утечкой излучения донора в акцепторный канал.Пик DO использовался в качестве эталона для смещения DO E FRET до нуля и изменения масштаба диапазона FRET.

    Рисунок 2.

    Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рисунку 3, где эти события анализируются с точки зрения времени их пребывания). По мере увеличения количества G-трактов увеличивается популяция состояний с более низкой эффективностью FRET, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, у которых было хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порогового значения на рисунке 3. ( B ) Отношение общей популяции [ E FRET <0,50] к На графике нанесено [ E FRET > 0,50] состояний.Как и ожидалось, это соотношение увеличивается с увеличением количества G-трактов.

    Рисунок 2.

    Нормализованные гистограммы FRET на основе FRET-PAINT. ( A ) Каждая нормализованная гистограмма эффективности FRET построена из сотен коротких событий связывания PNA, как показано на рисунке 1C (точные числа приведены в подписи к рисунку 3, где эти события анализируются с точки зрения времени их пребывания). По мере увеличения количества G-трактов увеличивается популяция состояний с более низкой эффективностью FRET, поскольку становятся доступными сайты связывания, расположенные дальше от донора.Количество молекул (теломерные выступы, у которых было хотя бы одно событие связывания) на каждой гистограмме составляет N = 127, 170, 210, 260, 185 и 230 для 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и конструкция 24G-Tract соответственно. Красная стрелка в конструкции 24G-Tract указывает уровень E FRET = 0,13, который используется в качестве порогового значения на рисунке 3. ( B ) Отношение общей популяции [ E FRET <0,50] к На графике нанесено [ E FRET > 0,50] состояний.Как и ожидалось, это соотношение увеличивается с увеличением количества G-трактов.

    Уровни E FRET и время выдержки (τ) событий привязки во временных графиках smFRET были охарактеризованы автоматическим и свободным от смещения методом обнаружения шагов, Stepfinder (52), который может определять шаги в большие наборы данных, не требуя предварительного знания об их распределении. Он начинается с подбора данных за один шаг с таким расположением и размером, которые дают наименьший остаточный хи-квадрат (53).На рисунке 3A показана временная диаграмма smFRET и соответствующее соответствие Stepfinder (красная линия). Частоты связывания (общее количество событий связывания / общее время наблюдения) рассчитывали на основе подборов Stepfinder . Общее время наблюдения — это сумма времени индивидуального наблюдения для каждой молекулы, полученная по временным графикам smFRET. Индивидуальное время наблюдения для каждой молекулы — это период от начала записи до фотообесцвечивания донора или до конца записи, в зависимости от того, что наступит раньше.{- 1}} $ | ⁠. Анализ начальной загрузки (54) использовался для определения планок ошибок, связанных с частотами связывания для каждой конструкции G-Tract. В анализе начальной загрузки сценарий MATLAB сгенерировал 20 000 наборов начальной загрузки с уровнем достоверности 95% из набора данных, который перечисляет количество событий привязки в каждой временной трассировке (включая трассировки, которые не показали никакой привязки). Общее количество событий привязки в каждом наборе начальной загрузки было разделено на общее время наблюдения для каждого набора. Это приводит к распределению частот, как показано на рисунке 5A, которое может быть подогнано к функции Гаусса для определения пиковой частоты и стандартного отклонения.Положения пиков этих распределений превосходно согласуются со средними частотами, определенными путем деления общего количества событий привязки на общее время наблюдения фактического набора данных (а не сгенерированных наборов данных начальной загрузки). Стандартное отклонение этих распределений использовалось для оценки неопределенности частот связывания, представленных на Фигуре 5B-C. В таблице 1 представлено общее количество временных графиков, общее количество событий связывания, общее время наблюдения и результирующая частота связывания для каждой конструкции ДНК.

    Рисунок 3.

    Определение характерного времени задержки. ( A ) Пример графика времени smFRET, который показывает семь событий связывания PNA с одним теломерным выступом. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени выдержки (τ) событий привязки. Пунктирная линия в позиции E FRET = 0,13 представляет пороговый уровень, используемый для рассмотрения пакета FRET как события связывания PNA, а не шума.Пакеты сигналов также должны удовлетворять условию τ≥300 мс, чтобы считаться связывающим событием. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное из Stepfinder , пригодных для каждой конструкции. Распределения лучше описывались двойной экспоненциальной (красная линия) подгонкой по сравнению с одинарной экспоненциальной (пунктирная голубая линия) подгонкой, которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем пребывания. В двойной экспоненте | $ {t_1} $ | (более быстрый спад) — характерное время для коротких времен и | $ {t_2} $ | (более медленный распад) — характерное время для долгих времен.Количество событий связывания в гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

    Рисунок 3.

    Определение характерного времени задержки. ( A ) Пример графика времени smFRET, который показывает семь событий связывания PNA с одним теломерным выступом. Подгонка Stepfinder (красная линия) используется для характеристики уровней FRET и времени выдержки (τ) событий привязки. Пунктирная линия при E FRET = 0.13 представляет собой пороговый уровень, используемый для рассмотрения пакета FRET как события связывания PNA, а не шума. Пакеты сигналов также должны удовлетворять условию τ≥300 мс, чтобы считаться связывающим событием. ( B ) Распределение времени пребывания, определенное из Stepfinder , пригодных для каждой конструкции. Распределения лучше описывались двойной экспоненциальной (красная линия) подгонкой по сравнению с одинарной экспоненциальной (пунктирная голубая линия) подгонкой, которая последовательно занижала количество событий с более длительным временем пребывания.В двойной экспоненте | $ {t_1} $ | (более быстрый спад) — характерное время для коротких времен и | $ {t_2} $ | (более медленный распад) — характерное время для долгих времен. Количество событий связывания в гистограммах для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-Tract составляет N = 331, 394, 561, 556, 563 и 604 соответственно.

    Таблица 1. Статистика

    , использованная для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к количеству проанализированных молекул ДНК (временные кривые), N B к количеству событий связывания ПНК, T итого к общему времени наблюдения, f среднее к средней частоте ( N B / T до ) и f пик к пиковой частоте распределения бутстрепинга на рисунке 5A

    9050 395 12G-Tract 9050
    Построить .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
    4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
    8G-тракт 1632 110326 110326 1651 476

    5,17 5,16
    16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5.20
    20G-тракт 1748 449

    4,84 4,48
    24G-тракт 1794 567
    9050 395 12G-Tract 9050
    Построить . N ДНК . N B .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
    4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
    8G-тракт 1632 110326 110326 1651 476

    5,17 5,16
    16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5.20
    20G-тракт 1748 449

    4,84 4,48
    24G-тракт 1794 567
    Таблица 1. Статистика

    , использованная для расчета частоты связывания на рисунке 5. N ДНК относится к количеству проанализированных молекул ДНК (временные кривые), N B к количеству событий связывания ПНК, T до к общему времени наблюдения, f среднее к средней частоте ( N B / T до ) и f пик к пиковой частоте распределения бутстреппинга на рисунке 5A

    9050 395 12G-Tract 9050
    Построить .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
    4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
    8G-тракт 1632 110326 110326 1651 476

    5,17 5,16
    16G-Tract 2252 557 110646 5.03 5.20
    20G-тракт 1748 449

    4,84 4,48
    24G-тракт 1794 567
    9050 395 12G-Tract 8
  • 29. Ван Ф., Ван Броклин Дж. Р., Хобсон Дж. П., Мовафаг С., Зуковска-Гройец З., Мильстиен С. и др. Сфингозин-1-фосфат стимулирует миграцию клеток через рецептор клеточной поверхности, связанный с G (i). Возможное участие в ангиогенезе. J Biol Chem. 1999; 274: 35343–35350. pmid: 10585401
  • 30.Ляо JK, Homcy CJ. Белки G семейства G alpha i и G alpha q связывают рецептор брадикинина с высвобождением релаксирующего фактора эндотелия. J Clin Invest. 1993; 92: 2168–2172. pmid: 8227332
  • 31. ван Корвен EJ, Groenink A, Jalink K, Eichholtz T., Moolenaar WH. Пролиферация клеток, индуцированная лизофосфатидатом: идентификация и анализ сигнальных путей, опосредованных G-белками. Клетка. 1989; 59: 45–54. pmid: 2551506
  • 32. An S, Bleu T, Hallmark OG, Goetzl EJ.Характеристика нового подтипа человеческого рецептора, связанного с G-белком, для лизофосфатидной кислоты. J Biol Chem. 1998; 273: 7906–7910. pmid: 9525886
  • 33. Offermanns S, Wieland T, Homann D, Sandmann J, Bombien E, Spicher K и др. Трансфицированные мускариновые рецепторы ацетилхолина селективно связываются с белками G Gi-типа и Gq / 11. Mol Pharmacol. 1994; 45: 890–898. pmid: 81

  • 34. Akam EC, Challiss RA, Nahorski SR. Профили активации G (q / 11) и G (i / o) в клетках СНО, экспрессирующих человеческие мускариновые рецепторы ацетилхолина: зависимость от агониста, а также от подтипа рецептора.Br J Pharmacol. 2001; 132: 950–958. pmid: 11181437
  • 35. Хорниголд, округ Колумбия, Мистри Р., Раймонд П.Д., Бланк Д.Л., Челлисс Р.Дж. Доказательства перекрестного взаимодействия между мускариновыми ацетилхолиновыми рецепторами M2 и M3 в регуляции вторичных мессенджеров и сигнальных путей киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, в клетках яичников китайского хомячка. Br J Pharmacol. 2003. 138: 1340–1350. pmid: 12711635
  • 36. Blaukat A, Barac A, Cross MJ, Offermanns S, Dikic I. G-белок-связанный рецептор-опосредованная активация митоген-активируемой протеинкиназы через взаимодействие сигналов Galpha (q) и Galpha (i).Молекулярная и клеточная биология. 2000. 20: 6837–6848. pmid: 10958680
  • 37. Jongsma M, Matas-Rico E, Rzadkowski A, Jalink K, Moolenaar WH. LPA — хеморепеллент для клеток меланомы B16: действие через рецептор LPA5, повышающий цАМФ. PLoS ONE. 2011; 6: e29260. pmid: 22195035
  • 38. Хилл SJ, Бейкер JG. Взлеты и падения переключения Gs- на Gi-белок. Br J Pharmacol. 2003; 138: 1188–1189. pmid: 12711616
  • 39. Hoffmann C, Gaietta G, Bünemann M, Adams SR, Oberdorff-Maass S, Behr B и др.Подход FRET на основе FlAsH для определения активации рецепторов, связанных с G-белками, в живых клетках. Нат методы. 2005. 2: 171–176. pmid: 15782185
  • 40. Хайн П., Роша Ф., Хоффманн С., Дорш С., Николаев В.О., Энгельхардт С. и др. Активация GS ограничена по времени при инициировании передачи сигналов, опосредованной рецептором. Журнал биологической химии. 2006; 281: 33345–33351. pmid: 16963443
  • 41. Hoffmann C, Nuber S, Zabel U, Ziegler N, Winkler C, Hein P и др. Сравнение кинетики активации M3-ACh-рецептора и конститутивно активного мутантного рецептора в живых клетках.Mol Pharmacol. 2012; 82 (2): 236–245 pmid: 22564786
  • 42. Деванатан В., Хагедорн И., Келер Д., Пекса К., Черпокова Д., Крафт П. и др. Белок Gαi2 тромбоцитов является важным медиатором тромбовоспалительного поражения органов у мышей. Proc Natl Acad Sci USA. 2015; 112: 6491–6496. pmid: 25944935
  • 43. Нагаи Т., Ямада С., Томинага Т., Итикава М., Мияваки А. Расширенный динамический диапазон флуоресцентных индикаторов для Ca (2+) за счет циркулярно пермутированных желтых флуоресцентных белков.Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101: 10554–10559. pmid: 15247428
  • 44. Мартин П., Албагли О., Погги М.С., Булукос К.Э., Погнонец П. Разработка нового бицистронного ретровирусного вектора с сильной активностью IRES. BMC Biotechnol. 2006; 6: 4. pmid: 16409632
  • 45. Хекман К.Л., Пиз Л.Р. Сплайсинг генов и мутагенез с помощью ПЦР-управляемого удлинения перекрытия. Nat Protoc. 2007; 2: 924–932. pmid: 17446874
  • 46. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, Gadella TWJ.Регулирование закрепления мембраны PLCbeta1a его субстратом фосфатидилинозитол (4,5) -бисфосфатом. Журнал клеточной науки. 2008; 121: 3770–3777. pmid: 18957514
  • 47. Ziegler N, Bätz J, Zabel U, Lohse MJ, Hoffmann C. Датчики на основе FRET для человеческих рецепторов M1-, M3- и M5-ацетилхолина. Bioorg Med Chem. 2011; 19: 1048–1054. pmid: 20716489
  • 48. Klotz KN, Hessling J, Hegler J, Owman C, Kull B., Fredholm BB, et al. Сравнительная фармакология подтипов аденозиновых рецепторов человека — характеристика стабильно трансфицированных рецепторов в клетках СНО.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1998; 357: 1–9. pmid: 9459566
  • Включаемый гомодимерный флуоресцентный зонд на основе гомо-FRET для определения биотиолов в лизосомах: испытание новой стратегии включения

    Флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) часто применяется для создания флуоресцентных зондов для достижения высокой селективности и чувствительности. Согласно теории FRET, гомодимер, состоящий из двух идентичных флуорофоров с небольшим стоксовым сдвигом, имеет только слабую флуоресценцию из-за гомо-FRET между флуорофорами, и флуоресценция может быть восстановлена ​​после разрушения гомодимера.В этом исследовании мы разработали и синтезировали гомодимерный флуоресцентный зонд, а именно димер 1,3,5,7-тетраметил-8- (4′-фенилтиофенол) -дифторид-дипиррол-метан (D-TMSPB), по стратегии. В D-TMSPB дисульфидный фрагмент был выбран в качестве ответного фрагмента биотиолов, а флуорофор BODIPY был выбран как донор, так и акцептор в FRET из-за сверхмалых стоксовых сдвигов и очевидного перекрытия его пика возбуждения / испускания. D-TMSPB проявлял только слабую флуоресценцию. После селективной реакции с биотиолами FRET разрушался, и производное проявляло сильную флуоресценцию при 514 нм с пределом обнаружения около 0.15 мкМ для GSH. Примечательно, что производные биотиолов демонстрируют заметную флуоресценцию только в кислых условиях, что соответствует внутренней среде лизосомы. Таким образом, D-TMSPB применяли для изображения биотиолов лизосом в живых клетках. Флуоресценция включения D-TMSPB показала, что гомо-FRET представляет собой практическую стратегию разработки флуоресцентных зондов включения, особенно для механизма восприятия, основанного на уходящих группах.

    У вас есть доступ к этой статье

    Подождите, пока мы загрузим ваш контент… Что-то пошло не так. Попробуй еще раз?

    пальцев, ладов и струнных — уроки игры на гитаре для начинающих

    Добро пожаловать в третье видео из серии «Быстрый старт игры на гитаре для начинающих».В этом уроке мы рассмотрим 3 системы нумерации для гитары, включая систему, используемую для ваших пальцев, ладов на гитаре и для гитарных струн. Этот урок может показаться вам очень легким, но это важный урок. Знание этих систем внутри и снаружи сделает все ваши будущие уроки игры на гитаре намного быстрее.

    Пальцы

    Указательный палец — это первый палец, средний палец — это второй палец, безымянный палец — это третий палец, а мизинец — это безымянный палец.Я уверен, что вам это кажется простым, но когда вы начнете читать диаграммы аккордов, диаграммы масштабов, табуляции и ноты, вам нужно будет сразу же знать, какой палец использовать.

    Лады

    Лады на гитаре представляют собой металлические полосы, расположенные вдоль грифа. Первый лад — это металлическая полоса, ближайшая к грифе гитары, а затем отсчитывается оттуда.

    Струны

    Большинство людей думает, что самая близкая к ним струна, самая толстая струна, — это первая струна гитары, но на самом деле все наоборот.Самая тонкая струна — это первая струна, ближайшая к полу. Следующая струна вверх, вторая самая тонкая струна, становится второй струной и так далее. Просто помните, что самая тонкая струна — это первая струна, а самая толстая струна — это шестая струна.

    Собираем все вместе

    Если кто-то скажет вам положить палец на первый лад, вы перейдете к первому ладу и поместите палец прямо за ладом. Если бы вам сказали перейти к пятому ладу на первой струне с указательным пальцем, вы бы сосчитали пять ладов и поместили первый палец позади этого лада на самой тонкой струне.

    Вы захотите испытать себя во всех системах счисления, чтобы быстро сыграть нужный лад на правой струне и правым пальцем. Уделите столько времени, сколько вам нужно, чтобы освоиться со всеми тремя системами, проверяя себя, просматривая вкладки и изучая диаграммы аккордов.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Построить . N ДНК . N B .{- 3}} {\ boldsymbol {\}} $ | s −1 ) .
    4G-тракт 2017 331 104353 3,17 3,15
    8G-тракт 1632 110326 110326 1651 476

    5,17 5,16
    16G-Tract 2252 557 110646 5.{- [{({x — {x_0}}) / {t_2}}]}} $ | ⁠) экспоненциальных функций затухания к гистограммам на рисунке 3B. Происхождение также использовалось для проверки статистических гипотез на рисунках 3B, 4B, C и 5D. Количество молекул или количество событий связывания, включенных в каждый набор данных, указано в заголовке соответствующего рисунка.

    Рисунок 4.

    Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени задержки и . Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4.Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-тракта составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C). ( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

    Рисунок 4.

    Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени задержки и .Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4. Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-тракта составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C).( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

    Рисунок 5. Частоты связывания

    ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением. Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания).Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения числа G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t 1 ). Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации для распределений в (A).( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET. Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

    Рисунок 5. Частоты связывания

    ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением.Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания). Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения числа G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t 1 ).Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации для распределений в (A). ( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET.Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

    РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

    Анализ FRET-PAINT для исследования доступности длинных теломерных выступов

    Анализ FRET-PAINT был разработан для изучения доступности тандемных GQ, образующихся в длинных теломерных последовательностях (рис. 1A и B). Связывание цепи формирователя изображения, Cy5-PNA, с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени приводит к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET ( E FRET ).Привязка к разным G-трактам приводит к пакетной передаче с разными уровнями E FRET . На рисунке 1C показан пример временной диаграммы smFRET, демонстрирующей такие всплески.

    Выбор ПНК в качестве цепи формирователя изображения был решающим для этого анализа. Диссоциация цепи формирователя изображения должна быть достаточно быстрой, чтобы гарантировать, что отдельные события связывания с стыковочной конструкцией не перекрываются, что устанавливает верхний предел концентрации цепи формирователя изображения. С другой стороны, концентрация должна быть достаточно высокой, чтобы наблюдать большое количество событий связывания и получать надежную статистику (50).Концентрация цепи Cy5-PNA поддерживалась на уровне 40 нМ, что было достаточно высоким, чтобы получить надежную статистику связывания, но достаточно низким, чтобы поддерживать низкий фон флуоресценции и незначительные ложноположительные пики FRET из-за неспецифического связывания Cy5-PNA с поверхностью в близость стыковочных сооружений. Нить формирователя изображения также должна оставаться связанной со стыковочной конструкцией в течение достаточно длительного времени, чтобы обеспечить надежное обнаружение событий привязки, то есть по крайней мере в несколько раз дольше, чем время интеграции кадра (100 мс для наших измерений).Обычно это может быть достигнуто с помощью более длинных нитей тепловизора, которые имеют больше дополнительных оснований для стыковочной конструкции. Однако использование более длинных цепей имидж-сканера потребует, чтобы они связались более чем с одним G-трактом, что приведет к перекрестным помехам между соседними G-трактами. В идеале нить тепловизора должна дополнять только один G-тракт, например 6 нт или меньше. Несмотря на то, что использовались последовательности, отличные от нашей, время диссоциации для цепей формирователя изображения ДНК длиной 6 н., 7 н., 8 н. И 9 н. Было указано как 3.7 мс, 4,8 мс, 63 мс и 670 мс соответственно (50). Учитывая это время диссоциации и ограничения во временном разрешении анализов smFRET (10–100 мс), минимально возможная длина цепи сканера ДНК будет 8–9 нуклеотидов. Однако наши исследования демонстрируют, что время диссоциации более 1 с возможно с цепью визуализатора PNA, которая комплементарна одному G-тракту.

    Дополнительные рисунки S2 и S3 демонстрируют измерения, подтверждающие принцип действия, которые подтверждают использование анализа FRET-PAINT для изучения доступности длинных теломерных выступов.Присутствие GQ и их стабильность, как ожидается, будут влиять как на частоту связывания, так и на время пребывания цепей ПНК на теломерных выступах. Ожидается, что GQ с более высокой стабильностью будут разворачиваться реже, что приведет к менее частым событиям связывания PNA. Ожидается, что после их сворачивания более стабильные GQ будут более эффективно вытеснять любые связанные цепи ПНК из теломерных выступов. Чтобы проверить, наблюдаются ли они в данных FRET-PAINT, мы сравнили время пребывания и частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в 150 мМ KCl и 150 мМ LiCl.Поскольку K + значительно более эффективен в стабилизации GQ по сравнению с Li + , мы ожидаем более длительного времени пребывания и более высоких частот связывания в LiCl по сравнению с KCl, что было подтверждено данными, представленными на дополнительных рисунках S2B-C и S3. Средние частоты связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract были в 8,4 и 6,8 раз соответственно выше в LiCl по сравнению с KCl (дополнительный рисунок S2B-C). Характерные времена выдержки ( т 2 ) составили 2.В 1 и 2,5 раза дольше в LiCl по сравнению с KCl для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract, соответственно (дополнительный рисунок S3). Кроме того, мы сравнили влияние небольшой молекулы, стабилизирующей GQ (36), на частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в KCl (дополнительный рисунок S2B, C). Для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract частоты связывания были в 2,9 раза ниже с небольшой молекулой по сравнению с ее отсутствием. Наконец, мы сравнили частоты связывания в KCl и LiCl для конструкции, которая не может образовывать GQ (конструкция 1G-Tract) и имеет единственный сайт связывания.Мы наблюдали практически одинаковые частоты связывания для конструкции 1G-Tract в KCl и LiCl (дополнительный рисунок S2A), предполагая, что различия, которые мы наблюдали для конструкций, образующих GQ, обусловлены вариациями в стабильности GQ.

    Гистограммы пакетов FRET для конструкций 4G-Tract, 8G-Tract, 12G-Tract, 16G-Tract, 20G-Tract и 24G-Tract показаны на рисунке 2A. По мере увеличения количества G-трактов более низкие состояния FRET становятся более населенными, так как сайты связывания дальше от донора становятся доступными для Cy5-PNA.Увеличение популяции нижних состояний FRET количественно оценивается отношением общей популяции состояний [E FRET <0,50] к [E FRET > 0,50], как показано на рисунке 2B. С увеличением количества G-Tract в свесе это соотношение увеличивается с 0,13 для 4G-Tract до 0,72 для 24G-Tract. Уплотнение выступа за счет образования GQ позволило изучить такие длинные последовательности с помощью FRET.

    Анализ времени выдержки

    Программа Stepfinder использовалась для характеристики уровней E FRET и времени пребывания (τ) событий связывания на временных графиках smFRET.На рисунке 3A показана временная диаграмма smFRET с подгонкой Stepfinder (красная линия). Пунктирная линия на E FRET = 0,13 ( E FRET = 0,25 до коррекции DO) указывает пороговый уровень FRET для рассмотрения пакета FRET как события связывания Cy5-PNA. Этот пороговый уровень FRET был определен на основе распределений FRET, представленных на рисунке 2A. Как указано красной стрелкой на гистограмме 24G-Tract, самой длинной конструкции, которую мы изучили, популяции FRET незначительны из-за событий связывания при E FRET <0.13. Также требовалось, чтобы события оставались выше этого порогового уровня FRET для 4 последовательных точек, то есть τ ≥300 мс, чтобы отличить их от случайных флуктуаций сигнала. Распределение времени пребывания для всех конструкций показано на рисунке 3B. Распределение времени пребывания аппроксимируется с использованием функций одно- и двухэкспоненциального затухания, которые показаны пунктирными голубыми линиями и сплошными красными линиями на рисунке 3B. Полученные параметры подгонки двойного экспоненциального затухания приведены в дополнительной таблице S2.Двойное экспоненциальное совпадение было значительно лучше, чем одинарное экспоненциальное совпадение для всех конструкций ( P <0,001 для всех конструкций). F-статистика для этого сравнения приведена в дополнительной таблице S3. Двойная экспоненциальная аппроксимация дала постоянную времени быстрого затухания t 1 и более медленную постоянную затухания t 2 , которые перечислены на соответствующих гистограммах на рисунке 3B. В то время как время быстрого затухания одинаково для всех конструкций (≈0.7 ± 0,1 с), более медленные константы распада находятся в диапазоне 4,0–8,6 с, без явной зависимости от длины. Согласованность коротких времен пребывания для разных конструкций подразумевает, что они являются результатом одного и того же механизма, такого как частичная гибридизация PNA с G-трактами или с петлями TTA в GQ.

    Данные времени пребывания могут быть дополнительно проанализированы, чтобы исследовать, приводит ли связывание PNA к различным сегментам конструкции, которые должны давать разные уровни FRET, к разному времени пребывания.Контурные графики времени пребывания и . E FRET были созданы, чтобы ответить на этот вопрос (рис. 4A). Чтобы исключить случаи короткого связывания, которые могут быть следствием частичной гибридизации зонда PNA с теломерными последовательностями, мы включили в эти контурные графики времена пребывания, превышающие 1,0 с. Для ясности рисунков верхний предел на этих графиках установлен на уровне 7,0 с, даже несмотря на то, что малонаселенные карманы существуют при более длительном времени пребывания. Контурные графики, которые включают более короткие времена пребывания (<1.0 с) приведены на дополнительном рисунке S4. Связывание Cy5-PNA с 3'-концом и 5'-концом конструкции ДНК приводит к более низким и более высоким уровням FRET, соответственно. Как показано на рисунке 2A, совокупность нижних состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением длины выступа. Для оценки среднего времени выдержки для различных положений выступа шкала E FRET (0,0–1,0) была разделена на пять сегментов FRET равной ширины 0,2, как показано белыми пунктирными линиями на рисунке 4A. Для каждой конструкции было рассчитано среднее время пребывания в каждом из этих сегментов, как показано на рисунке 4B.За исключением конструкции 20G-Tract, односторонний анализ ANOVA не показал значимой разницы между средним временем пребывания для разных сегментов FRET для любой из конструкций. Чтобы получить глобальное среднее значение, время пребывания для каждого диапазона FRET было усреднено по всем конструкциям (рис. 4C). Однофакторный анализ ANOVA в этом случае также не показал существенной разницы во времени пребывания для разных сегментов FRET. Статистика одностороннего теста ANOVA приведена в дополнительной таблице S4. На основании этого мы заключаем, что время пребывания для связывания с разными сегментами теломерного выступа не различимо в пределах разрешающей способности наших измерений.

    Частота связывания PNA

    Доступность теломер может быть определена количественно путем вычисления частоты связывания цепей Cy5-PNA с G-трактами. Частота связывания рассчитывается путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения для каждой конструкции. Количество событий привязки было определено с использованием настраиваемого кода MATLAB, который обрабатывал соответствия, сгенерированные Stepfinder , и подсчитывал события привязки, которые имеют время задержки> 300 мс и E FRET > 0.13, как описано ранее.

    На рис. 5A показано распределение средних частот, полученное с помощью анализа бутстрэппинга. Пиковые значения этих распределений превосходно согласуются с вычисленными средними частотами связывания, полученными путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения. Разброс распределений описывает неопределенность средних частот связывания. Планки погрешностей на рисунках 5B и C представляют собой стандартное отклонение гауссовых подходов к распределениям начальной загрузки, показанным на рисунке 5A.

    Рисунок 5B показывает, что частота связывания обычно увеличивается с увеличением длины теломер, что согласуется с увеличением числа потенциальных сайтов связывания. С другой стороны, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с длиной теломер (Рисунок 5B, где включены как короткие, так и длинные времена пребывания). Подобные тенденции также наблюдаются, когда рассматриваются только события связывания с τ> 2 t 1 , чтобы исключить события, которые потенциально представляют частичную гибридизацию PNA (рис. 5C).Уменьшение частоты связывания G-тракта с увеличением длины теломер предполагает уплотнение в структуре, которое становится более заметным по мере увеличения длины теломер. Это может быть связано с образованием структур более высокого порядка, возможно, опосредованным стэкингом GQ.

    На фиг. 5D показаны частоты связывания, классифицированные на основе их уровней FRET, где шкала FRET разделена на пять сегментов, как на фиг. 4B. Как и ожидалось, из-за близости донорского флуорофора к доступным сайтам связывания в более коротких конструкциях (таких как 4G-Tract или 8G-Tract) более высокие частоты связывания наблюдаются для более высоких сегментов FRET.Частоты связывания более равномерно распределены для более длинных конструкций (таких как 20G-Tract или 24G-Tract), поскольку сайты связывания, расположенные дальше от донорского флуорофора, становятся доступными для связывания ПНК. Чтобы проверить, демонстрируют ли наблюдаемые частоты связывания значительные различия для разных сегментов FRET, был проведен односторонний анализ ANOVA с повторными измерениями, который показал значительные различия в пределах каждой конструкции. Результаты этого теста приведены в дополнительной таблице S5. Это особенно важно для более длинных конструкций, которые показывают более высокие частоты связывания в промежуточных сегментах по сравнению с 3 ‘или 5’ концами.Мы также выполнили тест попарного сравнения для сегментов FRET конструкции 20G-Tract и 24G-Tract, где частоты связывания для разных сегментов сравниваются с каждым из других сегментов. Результаты этого анализа представлены в виде контурного графика значений t на дополнительном рисунке S5 и в виде таблицы в дополнительной таблице S6. Эти анализы показывают, что GQ на 3′- и 5′-концах выступов в среднем менее доступны по сравнению с промежуточными областями, что согласуется с GQ, ингибирующими экзонуклеазную активность на концах теломеров (55).

    Наши исследования демонстрируют, что даже хотя события связывания становятся более частыми по мере увеличения длины теломерной ДНК, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с увеличением длины теломер, указывая на общее уплотнение структуры на более длинных участках. Это дает потенциальную основу для понимания того, как более длинные теломерные выступы уменьшают их доступность, формируя более компактные структуры. Это уплотнение будет способствовать защите концов теломеров от нуклеазной активности или агентов, которые в противном случае вызывали бы повреждение ДНК.Это также сделало бы теломерные выступы менее доступными для связывающих оцДНК белков, таких как RPA, накопление которых на теломерах будет запускать контрольную точку повреждения ДНК. С другой стороны, более компактная структура может также сделать теломерные GQ менее доступными для малых молекул и предъявить более строгие требования к потенциальным противораковым лекарствам, разработанным для ингибирования активности теломеразы.

    По техническим причинам мы демонстрируем возможность использования FRET-PAINT в качестве инструмента для изучения доступности теломерных последовательностей, сходных по длине с теми, которые встречаются в физиологических условиях.Используя ПНК в качестве зонда, который образует более стабильный гетеродуплекс с ДНК по сравнению с гомодуплексом ДНК-ДНК или гетеродуплексом ДНК-РНК, можно было уменьшить размер зонда так, чтобы один G-тракт опрашивается за раз, сохраняя при этом измеримое время ожидания (∼1 с). Наши исследования также демонстрируют возможность распространения этого подхода на более сложные условия, где доступность теломер изучается в присутствии белков Shelterin, ДНК-связывающих белков, геликаз или агентов краудинга.

    НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

    Все данные FRET отдельных молекул, представленные в этой рукописи, могут быть предоставлены по запросу от соответствующего автора.

    ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

    Дополнительные данные доступны в NAR Online.

    БЛАГОДАРНОСТИ

    Мы благодарим доктора Лука Лёффа (Технический университет Делфта, Нидерланды) за то, что он поделился с нами программой Stepfinder и за его помощь в ее реализации.Мы хотели бы поблагодарить Кристин Йегер и Викторию Рейнольдс (статистический консалтинг, библиотеки Кентского государственного университета) за их помощь в проведении статистического анализа. Мы благодарим Эрика Йоки за его помощь в вычитке и редактировании рукописи.

    ФИНАНСИРОВАНИЕ

    Национальные институты здравоохранения США [1R15GM109386 и 1R15GM123443 — H.B]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH [1R15GM123443].

    Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

    ССЫЛКИ

    1.

    Блэкберн

    E.H.

    Строение и функции теломер

    .

    Природа

    .

    1991

    ;

    350

    :

    569

    573

    ,2.

    Макаров

    В.Л.

    ,

    Hirose

    Y.

    ,

    Langmore

    J.P.

    Длинные G-хвосты на обоих концах хромосом человека предполагают механизм деградации С-цепи для укорочения теломер

    .

    Ячейка

    .

    1997

    ;

    88

    :

    657

    666

    .3.

    Wright

    W.E.

    ,

    Тесмер

    В.М.

    ,

    Huffman

    K.E.

    ,

    Levene

    S.D.

    ,

    Shay

    J.W.

    Нормальные человеческие хромосомы имеют длинные G-богатые теломерные выступы на одном конце

    .

    Genes Dev.

    1997

    ;

    11

    :

    2801

    2809

    .4.

    Stewart

    S.A.

    ,

    Ben-Porath

    I.

    ,

    Carey

    V.J.

    ,

    O’Connor

    B.F.

    ,

    Hahn

    W.C.

    ,

    Weinberg

    R.A

    Эрозия теломерного однонитевого выступа при репликативном старении

    .

    Nat. Genet.

    2003

    ;

    33

    :

    492

    496

    ,5.

    Verdun

    R.E.

    ,

    Karlseder

    J.

    Репликация и защита теломер

    .

    Природа

    .

    2007

    ;

    447

    :

    924

    931

    ,6.

    Rhodes

    D.

    ,

    Lipps

    H.J.

    Обзор и сводка G-квадруплексов и их регуляторные роли в биологии

    .

    Nucleic Acids Res.

    2015

    ;

    43

    :

    8627

    8637

    .7.

    Testorelli

    C.

    Теломераза и рак

    .

    J. Exp. Clin. Cancer Res.

    2003

    ;

    22

    :

    165

    169

    .8.

    Hanahan

    D.

    ,

    Weinberg

    R.A.

    Признаки рака: новое поколение

    .

    Ячейка

    .

    2011

    ;

    144

    :

    646

    674

    .9.

    Джафри

    M.A.

    ,

    Ansari

    S.A.

    ,

    Alqahtani

    M.H.

    ,

    Shay

    J.W.

    Роль теломер и теломеразы в развитии рака и достижения в области терапии, направленной на теломеразу

    .

    Геном Мед

    .

    2016

    ;

    8

    :

    69

    .10.

    Shay

    J.W.

    ,

    Wright

    W.E.

    Теломеры и теломераза в нормальных и раковых стволовых клетках

    .

    FEBS Lett.

    2010

    ;

    584

    :

    3819

    3825

    . 11.

    Хендерсон

    E.

    ,

    Hardin

    C.C.

    ,

    Прогулка

    S.K.

    ,

    Тиноко

    I.

    ,

    Блэкберн

    E.H.

    Теломерные олигонуклеотиды ДНК образуют новые внутримолекулярные структуры, содержащие пары оснований гуанин · гуанин

    .

    Ячейка

    .

    1987

    ;

    51

    :

    899

    908

    .12.

    Sen

    D.

    ,

    Gilbert

    W.

    Образование параллельных четырехцепочечных комплексов богатыми гуанином мотивами в ДНК и его значение для мейоза

    .

    Природа

    .

    1988

    ;

    334

    :

    364

    366

    . 13.

    Biffi

    G.

    ,

    Tannahill

    D.

    ,

    McCafferty

    J.

    ,

    Balasubramanian

    S.

    Количественная визуализация структур G-квадруплексов ДНК в клетках человека

    .

    Nat. Chem.

    2013

    ;

    5

    :

    182

    186

    .14.

    Оганесян

    L.

    ,

    Karlseder

    J.

    Теломерная броня: слои торцевой защиты

    .

    J. Cell Sci.

    2009

    ;

    122

    :

    4013

    4025

    .15.

    Henderson

    A.

    ,

    Wu

    Y.

    ,

    Huang

    Y.C.

    ,

    Чавес

    E.A.

    ,

    Platt

    J.

    ,

    Johnson

    F.B.

    ,

    Брош

    Р.М.

    ,

    Сен

    D.

    ,

    Lansdorp

    P.M.

    Обнаружение G-квадруплексной ДНК в клетках млекопитающих

    .

    Nucleic Acids Res.

    2014

    ;

    42

    :

    860

    869

    . 16.

    Zhang

    S.

    ,

    Sun

    H.

    ,

    Wang

    L.

    ,

    Liu

    Y.

    ,

    Chen

    H.

    ,

    Li

    Q.

    ,

    Гуань

    А.

    ,

    Лю

    М.

    ,

    Tang

    Y.

    Мониторинг G-квадруплексов ДНК в живых клетках в реальном времени с помощью низкомолекулярного флуоресцентного зонда

    .

    Nucleic Acids Res.

    2018

    ;

    46

    :

    7522

    7532

    . 17.

    Di Antonio

    M.

    ,

    Ponjavic

    A.

    ,

    Radzevičius

    A.

    ,

    Ranasinghe

    R.T.

    ,

    Catalano

    M.

    ,

    Zhang

    X.

    ,

    Шен

    Дж.

    ,

    Нидхэм

    Л.-М.

    ,

    Ли

    S.F.

    ,

    Кленерман

    D.

    et al. .

    Одномолекулярная визуализация образования G-квадруплексов ДНК в живых клетках

    .

    Nat. Chem.

    2020

    ;

    12

    :

    832

    837

    0,18.

    Gellert

    M.

    ,

    Lipsett

    M.N.

    ,

    Дэвис

    D.R.

    Образование спирали гуаниловой кислотой

    .

    Proc. Natl. Акад. Sci. США

    1962

    ;

    48

    :

    2013

    2018

    ,19.

    Neidle

    S.

    ,

    Parkinson

    G.N.

    Строение теломерной ДНК

    .

    Curr. Opin. Struct. Биол.

    2003

    ;

    13

    :

    275

    283

    .20.

    Burge

    S.

    ,

    Parkinson

    г.N.

    ,

    Hazel

    P.

    ,

    Todd

    A.K.

    ,

    Neidle

    S.

    Квадруплексная ДНК: последовательность, топология и структура

    .

    Nucleic Acids Res.

    2006

    ;

    34

    :

    5402

    5415

    ,21.

    Hwang

    H.

    ,

    Kreig

    A.

    ,

    Calvert

    J.

    ,

    Lormand

    J.

    ,

    Kwon

    Y.

    ,

    Daley

    J.M.

    ,

    Sung

    P.

    ,

    Opresko

    P.L.

    ,

    Myong

    S.

    Длина теломерного выступа определяет структурную динамику и доступность для теломеразы и ALT-ассоциированных белков

    .

    Строение

    .

    2014

    ;

    22

    :

    842

    853

    .22.

    Wang

    Q.

    ,

    Liu

    J.Q.

    ,

    Чен

    З.

    ,

    Zheng

    K.W.

    ,

    Chen

    C.Y.

    ,

    Хао

    Y.H.

    ,

    Tan

    Z.

    Образование G-квадруплекса на 3′-конце теломерной ДНК ингибирует его удлинение с помощью теломеразы, полимеразы и раскручивание с помощью геликазы

    .

    Nucleic Acids Res.

    2011

    ;

    39

    :

    6229

    6237

    . 23.

    Cheong

    В.В.

    ,

    Хедди

    Б.

    ,

    Lech

    C.J.

    ,

    Phan

    A.T.

    Ксантин и 8-оксогуанин в G-квадруплексах: образование тетрады G · G · X · O

    .

    Nucleic Acids Res.

    2015

    ;

    43

    :

    10506

    10514

    . 24.

    Spiegel

    J.

    ,

    Adhikari

    S.

    ,

    Balasubramanian

    S.

    Структура и функции G-квадруплексов ДНК

    .

    Trends Chem

    .

    2020

    ;

    2

    :

    123

    136

    0,25.

    Neidle

    S.

    Теломерный G-квадруплекс человека: Текущее состояние теломерных G-квадруплексов как терапевтических мишеней при раке человека

    .

    FEBS J.

    2010

    ;

    277

    :

    1118

    1125

    0,26.

    Серый

    R.D.

    ,

    Trent

    J.O.

    ,

    Стулья

    J.B.

    Пути сворачивания и разворачивания теломерного G-квадруплекса человека

    .

    J. Mol. Биол.

    2014

    ;

    426

    :

    1629

    1650

    0,27.

    Bessi

    I.

    ,

    Jonker

    H.R.A.

    ,

    Richter

    C.

    ,

    Schwalbe

    H

    Участие долгоживущих промежуточных состояний в сложном пути сворачивания теломерного G-Quadruplex человека

    .

    Angew. Chem. — Int. Эд.

    2015

    ;

    54

    :

    8444

    8448

    . 28.

    Marchand

    A.

    ,

    Gabelica

    V.

    Пути сворачивания и неправильного сворачивания G-квадруплекса ДНК

    .

    Nucleic Acids Res.

    2016

    ;

    44

    :

    10999

    11012

    . 29.

    Bhattacharyya

    D.

    ,

    Arachchilage

    G.M.

    ,

    Басу

    С.

    Катионы металлов в складчатости и стабильности G-квадруплекса

    .

    Фронт. Chem.

    2016

    ;

    4

    :

    38

    30.

    Fujii

    T.

    ,

    Podbevšek

    P.

    ,

    Plavec

    J.

    ,

    Sugimoto

    N.

    Влияние ионов металлов и соолутов на топологию G-квадруплекса

    .

    J. Inorg. Biochem.

    2017

    ;

    166

    :

    190

    198

    .31.

    Maleki

    P.

    ,

    Ma

    Y.

    ,

    Iida

    K.

    ,

    Nagasawa

    K.

    ,

    Balci

    H.

    Исследование одной молекулы флуоресцентно меченное производное теломестатина и G-квадруплексные взаимодействия

    .

    Nucleic Acids Res.

    2017

    ;

    45

    :

    288

    295

    .32.

    Ray

    S.

    ,

    Bandaria

    J.N.

    ,

    Qureshi

    M.H.

    ,

    Yildiz

    A.

    ,

    Balci

    H.

    Образование G-квадруплекса в теломерах усиливает защиту POT1 / TPP1 от связывания RPA

    .

    Proc. Natl. Акад. Sci. США

    2014

    ;

    111

    :

    2990

    2995

    0,33.

    Ray

    S.

    ,

    Qureshi

    M.H.

    ,

    Малкольм

    Д.У.

    ,

    Budhathoki

    J.B.

    ,

    Çelik

    U.

    ,

    Balci

    H.

    RPA-опосредованное разворачивание систематически изменяющихся структур G-квадруплекса

    .

    Biophys. J.

    2013

    ;

    104

    :

    2235

    2245

    . 34.

    Budhathoki

    J.B.

    ,

    Ray

    S.

    ,

    Urban

    V.

    ,

    Janscak

    P.

    ,

    Yodh

    J.G.

    ,

    Бальчи

    H.

    RecQ-ядро BLM разворачивает теломерный G-квадруплекс в отсутствие ATP

    .

    Nucleic Acids Res.

    2015

    ;

    42

    :

    11528

    11545

    0,35.

    Budhathoki

    J.B.

    ,

    Stafford

    E.J.

    ,

    Йод

    J.G.

    ,

    Balci

    H.

    АТФ-зависимый G-квадруплекс, разворачивающийся с помощью геликазы Блума, обнаруживает низкую процессивность

    .

    Nucleic Acids Res.

    2015

    ;

    43

    :

    5961

    5970

    ,36.

    Maleki

    P.

    ,

    Mustafa

    G.

    ,

    Gyawali

    P.

    ,

    Budhathoki

    JB

    ,

    Ma

    Y.

    ,

    Nagasawa

    K.

    ,

    Nagasawa

    K.

    ,

    H.

    Количественная оценка воздействия низкомолекулярных лигандов на стабильность G-квадруплекса против геликазы Блума

    .

    Nucleic Acids Res.

    2019

    ;

    47

    :

    10744

    10753

    0,37.

    Chandradoss

    S.D.

    ,

    Haagsma

    A.C.

    ,

    Lee

    Y.K.

    ,

    Hwang

    J.H.

    ,

    Nam

    J.M.

    ,

    Joo

    C.

    Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков

    .

    J. Vis. Exp.

    2014

    ;

    86

    :

    e50549

    .38.

    Neidle

    S.

    Квадруплексные нуклеиновые кислоты как новые терапевтические мишени

    .

    J. Med. Chem.

    2016

    ;

    59

    :

    5987

    6011

    0,39.

    Abraham Punnoose

    J.

    ,

    Cui

    Y.

    ,

    Koirala

    D.

    ,

    Yangyuoru

    P.M.

    ,

    Ghimire

    C.

    ,

    Shrestha

    P.

    ,

    Mao

    H.

    Взаимодействие G-квадруплексов в 3-м теломерном оверхенге во всю длину

    .

    J. Am. Chem. Soc.

    2014

    ;

    136

    :

    18062

    18069

    .40.

    Yu

    H.Q.

    ,

    Miyoshi

    D.

    ,

    Sugimoto

    N.

    Характеристика структуры и стабильности G-квадруплексов длинной теломерной ДНК

    .

    J. Am. Chem. Soc.

    2006

    ;

    128

    :

    15461

    15468

    .41.

    Petraccone

    L.

    ,

    Spink

    C.

    ,

    Trent

    J.O.

    ,

    Garbett

    N.C.

    ,

    Mekmaysy

    C.S.

    ,

    Giancola

    C.

    ,

    Chaires

    J.B.

    Структура и стабильность теломерных квадруплексов человека высшего порядка

    .

    J. Am. Chem. Soc.

    2011

    ;

    133

    :

    20951

    20961

    .42.

    Xu

    Y.

    ,

    Ishizuka

    T.

    ,

    Kurabayashi

    K.

    ,

    Komiyama

    M.

    Последовательное образование G-квадруплексов в ДНК человека, перекрывающего теломерию: структура концов теломер

    .

    Angew. Chemie — Int. Эд.

    2009

    ;

    48

    :

    7833

    7836

    . 43.

    Ван

    Х.

    ,

    Нора

    Г.J.

    ,

    Ghodke

    H.

    ,

    Opresko

    P.L.

    Исследования одиночных молекул физиологически релевантных теломерных хвостов выявили механизм POT1, способствующий разворачиванию G-квадруплексов

    .

    J. Biol. Chem.

    2011

    ;

    286

    :

    7479

    7489

    . 44.

    Abraham Punnoose

    J.

    ,

    Ma

    Y.

    ,

    Hoque

    M.E.

    ,

    Cui

    Y.

    ,

    Sasaki

    S.

    ,

    Guo

    AH

    ,

    Nagasawa

    K.

    ,

    Mao

    H. кинетический шаблон складывания с целевыми свободными G-Tracts

    .

    Биохимия

    .

    2018

    ;

    57

    :

    6946

    6955

    .45.

    Кар

    А.

    ,

    Джонс

    Н.

    ,

    Ozlem Arat

    N.

    ,

    Fishel

    R.

    ,

    Griffith

    JD

    Длинно повторяющаяся (TTAGGG) n одноцепочечная ДНК самоконденсируется в компактные бисерные нити, стабилизированные образованием G-квадруплекса

    .

    J. Biol. Chem.

    2018

    ;

    293

    :

    9473

    9485

    , 46.

    Sannohe

    Y.

    ,

    Sato

    K.

    ,

    Matsugami

    A.

    ,

    Shinohara

    K. ichi

    ,

    Mashimo

    T.

    ,

    Katahira

    M.

    ,

    Sugiyama

    H. удлиненные олигонуклеотиды

    .

    Bioorganic Med. Chem.

    2009

    ;

    17

    :

    1870

    1875

    0,47.

    Vorlíčková

    M.

    ,

    Chládková

    J.

    ,

    Kejnovská

    I.

    ,

    Fialová

    M.

    ,

    Kypr

    J.

    Топология гуанинового тетраплекса теломер ДНК человека определяется количеством (TTAGGG) повторов

    .

    Nucleic Acids Res.

    2005

    ;

    33

    :

    5851

    5860

    . 48.

    Maleki

    P.

    ,

    Budhathoki

    J.B.

    ,

    Roy

    W.A.

    ,

    Balci

    H.

    Практическое руководство по изучению структур G-квадруплексов с использованием одномолекулярного FRET

    .

    Мол. Genet. Геномика

    .

    2017

    ;

    292

    :

    483

    498

    , 49.

    Auer

    A.

    ,

    Strauss

    M.T.

    ,

    Schlichthaerle

    T.

    ,

    Jungmann

    R.

    Быстрая визуализация ДНК-PAINT без фона с использованием зондов на основе FRET

    .

    Nano Lett.

    2017

    ;

    17

    :

    6428

    6434

    .50.

    Lee

    J.

    ,

    Park

    S.

    ,

    Hohng

    S.

    Ускоренная микроскопия FRET-PAINT

    .

    Мол. Мозг

    .

    2018

    ;

    11

    :

    70

    ,51.

    Jungmann

    R.

    ,

    Steinhauer

    C.

    ,

    Scheible

    M.

    ,

    Kuzyk

    A.

    ,

    Tinnefeld

    P.

    ,

    Simmel

    F.C.

    Кинетика одиночных молекул и микроскопия сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной визуализации временного связывания на ДНК оригами

    .

    Nano Lett.

    2010

    ;

    10

    :

    4756

    4761

    ,52.

    Loeff

    L.

    Борьба с микробами: освещение адаптивного иммунитета CRISPR с использованием флуоресценции одиночных молекул

    .

    2017

    ;

    Делфтский технологический университет

    .53.

    Kerssemakers

    J.W.J.

    ,

    Лаура Мунтяну

    E.

    ,

    Laan

    L.

    ,

    Noetzel

    T.L.

    ,

    Janson

    M.E.

    ,

    Dogterom

    M

    Динамика сборки микротрубочек при молекулярном разрешении

    .

    Природа

    .

    2006

    ;

    442

    :

    709

    712

    . 54.

    Эфрон

    Б.

    ,

    Тибширани

    Р.J.

    Введение в Bootstrap

    .

    1993

    ;

    NY

    Chapman & Hall

    ,55.

    Тан

    Дж.

    ,

    Кан

    З.Й.

    ,

    Yao

    Y.

    ,

    Wang

    Q.

    ,

    Hao

    Y.H.

    ,

    Tan

    Z.

    G-квадруплекс преимущественно образуется на самом 3′-конце теломерной ДНК позвоночных

    .

    Nucleic Acids Res.

    2008

    ;

    36

    :

    1200

    1208

    .

    © Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

    Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинал работа правильно процитирована.

    Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

    Abstract

    Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с субсекундной кинетикой.Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 . Для обеспечения количественной долгосрочной визуализации биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном требуются флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами.Следовательно, мы используем самый яркий и наиболее фотостабильный вариант CFP, mTurquoise2, в качестве донора, слитого с субъединицей Gα и , и cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ 2 , в качестве акцептора. Конструкции биосенсоров Gα i FRET экспрессируются вместе с Gβ 1 из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенными вариациями в клетках млекопитающих. Датчики Gα i FRET показали устойчивый ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась токсином коклюша.Более того, мы наблюдали активацию FRET-сенсора Gα i в отдельных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецептор LPA 2 , M 3 и BK 2 . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном диапазоне времени. Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 будет полезно для измерений на живых клетках, которые проверяют активацию Gα i .

    Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 в отдельных клетках. PLoS ONE 11 (1): e0146789. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

    Редактор: Микель Гарсиа-Маркос, Медицинский факультет Бостонского университета, США

    Поступила: 25 сентября 2015 г .; Одобрена: 22 декабря 2015 г .; Опубликован: 22 января 2016 г.

    Авторские права: © 2016 van Unen et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

    Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Подкласс Gα i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у человека, Gα i1,2,3 , кодируемых генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1], и активируется широким диапазоном Рецепторы, сопряженные с G-белком. Семейство G-белков Gα i вовлечено в многочисленные патологии, от участия в ожирении и диабете [2], функций иммунной системы [3] до их критических ролей на нескольких этапах биологии рака [4-7]. .Активация Gα i преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако недавно активация Gα i была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K / Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

    Измерение активации Gα i обычно проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования дальше по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11–13].

    Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически закодированные биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14]. Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям в эффективности RET, которые могут быть определены количественно.

    Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с миллисекундным разрешением, что может использоваться для определения межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров. Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

    i был успешно помечен люциферазой в различных внутренних сайтах и ​​использован для измерения BRET между различными субъединицами Gα i и GPCR [16–19] или Gγ [19].Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

    Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23]. Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα i , мы соединили Gα i1 i2 и Gα i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным циановым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25].В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутированную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ 2 , которая ранее использовалась в качестве акцептора в единственном плазмиде Gα q FRET-сенсоре [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию для облегчения протоколов трансфекции и обеспечения четко определенного соотношения экспрессии донора и акцептора в клетках [27]. Эта стратегия экспрессии должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию создания, проверку и описание этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα i1 i2 и Gα i3 .Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет определять фармакологические характеристики лекарственного средства и определять on- и off-кинетику для агонистов и антагонистов в Gα и -связанных GPCR.

    Результаты

    Создание конструкций

    Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC.Этот сайт встраивания, который, как было ранее показано, сохраняет скорости обмена нуклеотидов и GTPase реакции, сопоставимые с белками дикого типа [20]. Gα i1 -mTq2 обнаруживает локализацию плазматической мембраны при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1A). Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации комплекса гетеротримерного G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21].Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα q достигается с cpVenus-Gγ 2 [26]. Поскольку Gα i имеет высокую структурную гомологию с Gα q и сайт, в который вставлен mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET. Следовательно, чтобы ввести меченый гетеротримерный G-протеиновый комплекс в клетки, мы совместно экспрессировали Gα i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ 2 и немаркированным Gβ 1 [26].Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α 2 2 AR) с UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, отражающую потерю FRET. Утрата FRET может быть интерпретирована как диссоциация гетеротримеров или изменение относительной конформации донора и акцептора. Чтобы обеспечить устойчивую коэкспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα q (рис. 1B) [26].В этой стратегии используется вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ 2 ) в отдельных клетках при минимизации гетерогенности межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα i1 -mTq2 неправильно локализован в цитоплазме многих клеток (Рис. 1C). Субъединица Gα i1 миристоилирована и требует наличия остатка глицина сразу после ее исходного метионина.Детальный анализ плазмидной последовательности выявил дополнительный стартовый кодон для Gα i1 -mTq2 перед нативным стартовым кодоном, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα i1 -mTq2 транслируется из вышележащего метионина в последовательности IRES, что не приводит к образованию миристоилированного белка. Мы удалили вышестоящий метионин с помощью ПЦР с полным вектором (см. Материалы и методы), в результате чего остался только нативный стартовый кодон Gα i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования.Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованный Gα i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα i2 и датчик Gα i3 . Чтобы изучить коэкспрессию трех субъединиц (Gα i1 -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D). Флуоресценция CFP и YFP при трансфекции стратегии одиночной плазмиды имела коэффициент детерминации r 2 , равный 0.64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r 2 0,36 между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3: 1 выше и ниже последовательности IRES, что, как ранее было показано, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα q FRET. датчик [27].Наконец, отдельные плазмидные конструкции упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα i -сенсорами.

    Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα i1 .

    (A) Типичное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -CFP, управляемую промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке под последовательностью ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ 2 ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правый столбец ) датчика Gα i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ 2 и Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмиды ( слева, ) по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид ( справа, ). Точки отображают интенсивность CFP и YFP, количественно определенную для отдельных отдельных ячеек. R 2 — коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0146789.g001

    Показатели в анализах активации GPCR

    Для тестирования нового биосенсора Gα i1 при визуализации живых клеток мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связан с Gα i1 , адренергическим рецептором α 2 2 AR). Клетки HeLa, которые, как было показано ранее, эндогенно содержат АР α 2 [20], были трансфицированы биосенсором Gα i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα i1 , которая была возвращена к исходному уровню добавлением 60 мкМ α 2 AR. антагонист Йохимбин (рис. 2А). Токсин коклюша (PTX), как было показано, инактивирует передачу сигналов Gα i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα i [28], что предотвращает его взаимодействие с GPCR. Активация Gα i1 была полностью отменена инкубацией в течение ночи с PTX, что показывает, что слияние белка Gα i1 -mTq2 все еще остается чувствительным к PTX (рис. 2A). Чтобы подтвердить, что датчик может быть использован для анализа активации эндогенных рецепторов в первичных клетках Gα i1 , мы повторили этот эксперимент на HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало стойкое снижение отношения FRET для Gα i1 -сенсора (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы исследовать, насколько надежен датчик Gα i1 на других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связаны с Gα i . Рецептор брадикинина 2B (BK 2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA 2 ) [31,32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M 3 ) [33,34] были котрансфицированы биосенсор Gα i1 в клетках HeLa.После стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение соотношения FRET биосенсора Gα i1 (рис. 2C). Рецептор M 3 также показал полное восстановление до исходного уровня отношения FRET после добавления антагониста атропина. Рецептор M 3 в основном известен своей передачей сигналов через Gα q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα i через рецептор M 3 [19,33–36], что согласуется с нашими наблюдениями.

    Рис. 2. Характеристики Gα i -сенсоров в анализах передачи сигналов GPCR одиночной клетки.

    (A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 . Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP / CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфического агониста α 2 AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации отношения FRET в Huvecs, трансфицированных Gα i1 -сенсором. Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα i1 -сенсор в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты по визуализации отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα i1 и BK 2B ( вверху справа ), LPA 2 ( вверху слева ), M 3 ( внизу справа ) и β 2 AR-2A2-m Черри ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK 2B ), 1 мкМ лизофосфатидовой кислоты (LPA 2 ), 100 мкМ карбахола и 10 мкМ атропина. (M 3 ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β 2 AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK 2B , LPA 2 и M 3 , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP / CFP FRET при добавлении их соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β 2 AR не изменяет FRET. передаточное отношение датчика Gα i1 . В контрольных условиях клетки HeLa, трансфицированные только сенсором Gα i1 , получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα i2 или датчиком Gα i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) коклюшного токсина (PTX) устраняет ответ на биосенсоры Gα i2 и Gα i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t, = 32 секунды, и антагонист добавляли при t, = 152 секунды, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 секунд.Временные диаграммы показывают среднее изменение отношения флуоресценции YFP / CFP (± s.e.m). Средние кривые состоят из данных по меньшей мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

    В условиях контроля, например отсутствие сверхэкспрессированного GPCR, мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом, и мы наблюдали только очень незначительный ответ на датчике Gα i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных рецепторов LPA в клетках HeLa [37]. Когда мы котрансфицировали адренергический рецептор β 2 2 AR), ни одна из клеток не показала активацию Gα i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2C). Следует отметить, что β 2 AR является классическим активатором Gα s , но при определенных условиях сообщалось о переходе на Gα i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и сходные условия (сверхэкспрессия β 2 AR и сенсоры гетеротримерных G-белков) [19].Также в этом случае не наблюдалась активация Gα i1 при стимуляции β 2 AR (и только небольшая активация Gα i2 и Gα i3 , которая была> 10 раз ниже, чем активация альфа-2C. адренергический рецептор, сильный активатор Gα i ).

    Чтобы проверить работоспособность биосенсоров Gα i2 и Gα i3 , мы трансфицировали клетки HeLa их соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, и сигнал вернулся к исходному уровню при добавлении 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα i . И Gα i2 -mTq2, и Gα i3 -mTq2 все еще чувствительны к лечению PTX, как показано отменой ответа FRET после инкубации с PTX в течение ночи (рис. 2D).

    Быстрые кинетические измерения

    Чтобы более подробно изучить субсекундную кинетику активации Gα i1 в живых клетках, клетки HEK293 котрансфицировали с помощью Gα i1 -сенсора и α 2 AR или рецептора аденозина A1. соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET одной клетки показывают быструю потерю отношения FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После отмывания лиганда сигнал FRET возвращается к исходным уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3А). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после непродолжительного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3B).

    Рис 3.Характеристики датчика Gα i1 при кинетических измерениях.

    (A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и α 2 AR, многократно стимулировали 20 мкМ норэпинефрина в течение интервалов, обозначенных короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что показано короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (C) Увеличенное изображение он-кинетики активации Gα i1 , показывающее нормализованное соотношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0.18 (R = 0,99). (D) График разброса, показывающий средние экспоненциальные постоянные времени (тау) объединенных данных из (n = 10) индивидуальных подборов клеток HEK293, трансфицированных Gα i1 -сенсором, и α 2 AR, стимулированных 100 мкМ норэпинефрина или объединенных данные (n = 14) по индивидуальным подборам Gα i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал.

    https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

    Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα i1 с субсекундным разрешением (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана к однокомпонентной функции экспоненциального затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

    Чтобы оценить точную динамическую кинетику датчика Gα i1 , клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина).Каждый индивидуальный ответ был подогнан к однокомпонентной экспоненте, что привело к средним значениям τ для α 2 AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равным 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полувыведения 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями активации G-белка с помощью FRET [21,40,41].

    Заключительные замечания

    В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα i1 , Gα i2 , Gα i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорским флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора FRET Gα q обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримеров (Gα i -mTq2, Gβ 1 и cpVenus-Gγ 2 ) были сконфигурированы на одной плазмиде, что позволило обеспечить устойчивую коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью ратиометрической визуализации FRET одной клетки.Стандартизированная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-протеина повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри лабораторий и между ними. Примером в данной статье является надежная работа датчика Gα i1 в трех разных лабораториях без оптимизации экспериментальных условий.

    Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримеров, что может влиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

    Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα i в первичных клетках через эндогенные GPCR. Более того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 между различными GPCR, связанными с Gα i , что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα i . сигнальные пути [42].

    Методы

    Конструирование флуоресцентных слитых белков

    Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в белки Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 , версию mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на его N-конце и C-конце. был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3 ‘и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3’. Чтобы ввести Age1-сайт в Gα i1 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha i1 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3 ‘и обратным праймером 5’-ATaccggtCAGCCCTGTCATAA -3 ‘.Чтобы ввести Age1-сайт в Gα i2 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha i2 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3 ‘и обратным праймером 5’TGTG -3 ‘. КДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha i3 с сайтом Age1, была синтезирована Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα i1 , Gα i2 и Gα i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha i1 , помеченного mTq2 после позиции 121, и HsGalpha i2,3 , помеченного mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченному Gα i1,2,3 [20].

    Для создания варианта 1.0 сенсора Gα i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ‘и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3’ для введения Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем было выполнено тройное лигирование с продуктом ПЦР (разрезанным с помощью BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ 1 -T2A-cp173Venus-Gγ 2 [43] (разрезанным с помощью BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG -IRES [44] (вырезано с помощью NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-MATT-Gα i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации плазматической мембраны), pGβ 1 и cp173Venus-Gγ 2 (рис. 1B).

    Для создания варианта 2.0 сенсора Gα i1 мы выполнили ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямым 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5’-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCTTC-3TGT-3.Полученная плазмида, pGβ 1 -2A-cp173Venus-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα i1 -mTq2 (правильно расположенная на плазматической мембране), pGβ 1 и cpVenus-Gγ 2 (рис. 1B).

    Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα i2 и Gα i3 , мы выполнили ПЦР с расширением перекрывания [45]. Gα i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5 -TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а Gα i3 -mTCat ‘ACGatgTgata и обратным праймером’ 5 праймер ‘5 -TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’.Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмидном сенсоре Gα q с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag -3». Впоследствии описанный выше продукт ПЦР Gα i2 -mTq2 или Gα i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР датчика Gα q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3 ‘и обратный праймер’ 5- TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3 ‘и прямой праймер’ 5- GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и обратный праймер’ 5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3 ‘соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в основную цепь сенсора Gα q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus -Gγ 2 -IRES-Gα i2 -mTurquoise2-Δ9 и pGβ 1 — 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα i1 -mCitrine и HsGα i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα i1 отличается только одной аминокислотой от человеческого Gα i1 (S98A). Рецептор LPA 2 был получен с cDNA.org. BK 2 R [46], α 2 AR [21], M 3 R [47] и рецептор A1 [48] были описаны ранее. β 2 AR-P2A-mЧерри — подарок Анны Пьетрашевской (Амстердамский университет).

    Культура клеток и подготовка проб

    клеток HeLa (American Tissue Culture Collection: Manassas, VA, USA) культивировали в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 Ед / мл). ) и стрептомицин (100 мкг / мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

    Клетки трансфицировали в 35-миллиметровой чашке со стеклянным покровным стеклом 24 мм Ø # 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1-2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5-1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37 ° C и 5% CO 2 покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL 2 , 0,8 мМ MgCl 2 и 20 мМ глюкозы). Вся микроскопия живых клеток проводилась при 37 ° C.

    Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Verviers, Бельгия). HUVEC использовали в пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Один импульс генерировали при 1300 В в течение 30 мс для микропорации HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

    Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 клетки HEK293 культивировали в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 мМ). (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) и хранили при 37 ° C в атмосфере 7% CO2.Клетки собирали и высевали на 24-миллиметровые покровные стекла, покрытые D-полилизином, при ~ 40% конфлюентности. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α 2 AR или аденозин A1) и 3,0 мкг pGβ 1 -2A-YFP-Gγ 2 -IRES-Gα i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперслили с этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютерной системы. Устройство быстрой суперфузии с электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

    Широкопольная микроскопия

    Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды). выдерживали при 37 ° C, снабжали иммерсионным масляным объективом (Plan-Neoflor 40 × / 1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновую дуговую лампу с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с заряженной связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Tucson, AZ, США). Типичное время экспозиции составляло от 75 мс до 150 мс, а интервал камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждались светом 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражались на образец дихроичным зеркалом 455DCLP, эмиссия CFP регистрировалась фильтром BP470 / 30, а эмиссия YFP регистрировалась фильтром BP535 / 30 путем вращения колеса фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец дихроичным 515DCXR, а излучение регистрировали с помощью фильтра BP535 / 30. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, просачивание эмиссии CFP в канал YFP (55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

    Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) микроскоп Zeiss Observer Z1 использовался в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) с 40x NA 1.3 масляный иммерсионный объектив и возбуждающий источник света HXP 120 В. CFP возбуждали через кубический фильтр FRET (Exciter ET 436 / 20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на прикрепленный адаптер двойной камеры (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Эмиссионные волны с длиной волны 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Длина волны излучения 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40 м (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США), а затем фиксируется второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений осуществлялось с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и утечку эмиссии CFP в канале YFP ​​(62% от интенсивности, измеренной в канале CFP).

    Для быстрых кинетических измерений активации Gα i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализация проводилась на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оборудованном масляным иммерсионным объективом 63x и фотометрическая система с двойным излучением (Till Photonics), описанная ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом от полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP / CFP) регистрировались одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на длине волны 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировались фотодиодами и оцифровывались с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были подогнаны к однокомпонентной функции экспоненциального затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени tau [39]. Полупериод активации (t 1/2 ) определяется как τ * ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкм), йохимбином (60 мкм), брадикинином (1 мкм), LPA (1 мкм), карбахолом (100 мкм), атропином (10 мкм), изопротеренолом (10 мкм), пропранололом (10 мкм), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здоровья) использовался для анализа необработанных изображений микроскопии. Дальнейшая обработка данных была проведена в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика были выполнены с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

    Конфокальная микроскопия

    клеток HeLa, трансфицированных указанными конструкциями, получали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

    Образцы последовательно возбуждали лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP482 / 35; Эмиссию YFP фильтровали через эмиссионный фильтр BP540 / 30. Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал.

    Благодарности

    Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (магистранта Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (магистранта Амстердамского университета) за создание Gα i1 -mTurquoise2 и Gα i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Пьетрашевскую и Скотта Гибсона за предоставленные плазмиды.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Проведены эксперименты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

    Ссылки

    1. 1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по меньшей мере три неаллеллических G-белка с субъединицами альфа i-типа. FEBS Lett. 1987; 220: 187–192. pmid: 2440724
    2. 2. Kimple ME, Neuman JC, Linnemann AK, Casey PJ. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Exp Mol Med. 2014; 46: e102. pmid: 24946790
    3. 3.Ван И, Ли Й, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных белков G в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
    4. 4. Дорсам РТ, Гуткинд Ж.С. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и рак. Нат Рев Рак. 2007; 7: 79–94. pmid: 17251915
    5. 5. Даака Ю. Белки G при раке: парадигма рака простаты. Sci STKE. 2004; 2004: re2. pmid: 14734786
    6. 6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S и др.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Bioorg Med Chem. 2014; 22: 3423–3434. pmid: 24818958
    7. 7. Раймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К.. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Ovarian Res. 2014; 7: 6. pmid: 24423449
    8. 8. Гарсия А., Ким С., Бхавараджу К., Шенвалдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и генерации тромбоксана А2, опосредованной сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010. 429: 369–377. pmid: 20441566
    9. 9. la Sala A, Gadina M, Kelsall BL. G (i) -зависимое ингибирование продукции IL-12 опосредуется активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B / Akt и JNK. J Immunol. 2005; 175: 2994–2999. pmid: 16116186
    10. 10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака простаты и передаче сигналов. J Urol. 2000. 164: 2162–2167. pmid: 11061948
    11. 11. Hur EM, Kim KT.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение скорости и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. pmid: 11882384
    12. 12. Брюс ДжиЭ, Штрауб С.В., Йол Д.И. Перекрестные помехи между передачей сигналов цАМФ и Са2 + в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003. 34: 431–444. pmid: 14572802
    13. 13. Фей Д., Краучер Д. Р., Колч В., Холоденко Б. Н.. Перекрестные помехи и переключатели сигналов в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Front Physiol. 2012; 3: 355. pmid: 23060802
    14. 14.Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
    15. 15. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов GPCR с помощью RET-биосенсоров в живых организмах. Mol Pharmacol. 2015. 88 (3): 589–595.
    16. 16. Гейлс С., Ван Дурм Дж.Дж., Шаак С., Понтье С., Першрансье Й., Одет М. и др.Исследование структурных перестроек, вызванных активацией, в предварительно собранных комплексах рецептор-G-белок. Nat Struct Mol Biol. 2006. 13: 778–786. pmid: 168
    17. 17. Gales C, Rebois RV, Hogue M, Trieu P, Breit A, Hébert TE и др. Мониторинг в реальном времени взаимодействий рецепторов и G-белков в живых клетках. Нат методы. 2005; 2: 177–184. pmid: 15782186
    18. 18. Ayoub MA, Maurel D, Binet V, Fink M, Prezeau L, Ansanay H, et al. Анализ в реальном времени индуцированной агонистами активации протеазо-активированного комплекса рецептор 1 / Galphai1, измеренный с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии в живых клетках.Mol Pharmacol. 2007. 71: 1329–1340. pmid: 17267663
    19. 19. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012; 8: 623–631.
    20. 20. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка α2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212.
    21. 21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединиц, а не с диссоциацией. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003; 100: 16077.
    22. 22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Датчик цАМФ на основе mTurquoise как для FLIM, так и для логометрического считывания имеет улучшенный динамический диапазон. PLoS ONE. 2011; 6: e19170. pmid: 21559477
    23. 23. Спарта Б, Парджетт М, Минге М, Дистор К, Белл Дж, Олбек Дж.Механизмы рецепторного уровня необходимы для импульсов активности киназы, регулируемой эпидермальным фактором роста (EGF), регулируемой внеклеточным сигналом (ERK). J Biol Chem. 2015; 290: 24784–24792. pmid: 26304118
    24. 24. Hamers D, van Voorst Vader L, Borst JW, Goedhart J. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. pmid: 24337770
    25. 25. Goedhart J, Stetten von D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA и др.Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков в направлении квантового выхода 93%. Nature Communications. 2012; 3: 751. pmid: 22434194
    26. 26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32. pmid: 21619590
    27. 27. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I, Hink MA, Gadella TWJ. Количественная совместная экспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET.Дельпрато А.М., редактор. PLoS ONE. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
    28. 28. Бернс DL. Субъединичная структура и ферментативная активность токсина коклюша. Microbiol Sci. 1988. 5: 285–287. pmid: 2