Рисунок 4.

Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени задержки и . Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4.Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-тракта составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C). ( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рисунок 4.

Распределение времени пребывания. ( A ) Контурные графики времени задержки и .Уровни FRET. Диапазон времени выдержки от 1 до 7 с показан здесь, в то время как контурные графики для более коротких интервалов времени приведены на дополнительном рисунке S4. Количество событий связывания для конструкций 4G-, 8G-, 12G-, 16G-, 20G- и 24G-тракта составляет N = 195, 209, 293, 313, 285 и 323, соответственно. Как и ожидалось, популяция более низких состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением количества G-трактов. Пунктирные белые линии обозначают пять сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2, который мы рассмотрели для анализа в (B) и (C).( B ) Среднее время пребывания в различных сегментах FRET для каждой конструкции. Более низкие уровни FRET находятся ближе к 3′-концу конструкции ДНК. (C) Время пребывания для каждого диапазона FRET в (B) усредняется по всем конструкциям. Планки погрешностей в (B) и (C) представляют собой стандартную ошибку среднего для каждого сегмента FRET. Статистический анализ не показал существенной разницы между временем пребывания для разных сегментов FRET в каждой конструкции в (B) или между сегментами FRET усредненной гистограммы в (C).

Рисунок 5. Частоты связывания

ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением. Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания).Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения числа G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t ₁ ). Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации для распределений в (A).( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET. Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

Рисунок 5. Частоты связывания

ПНК. ( A ) Гистограммы частоты привязки из анализа начальной загрузки. Пиковое значение этого распределения представляет собой среднюю частоту, в то время как разброс описывает неопределенность, связанную со средним значением.Каждая гистограмма была создана из 20 000 различных наборов начальной загрузки. Статистические данные, связанные с этими данными, приведены в таблице 1. ( B ) График разброса средней частоты связывания (зеленый) и средней частоты связывания на G-тракт (красный) для всех событий (включая как короткое, так и длительное время пребывания). Частота связывания имеет тенденцию увеличиваться по мере увеличения числа G-трактов (потенциальных сайтов связывания), в то время как частота связывания на каждый G-тракт последовательно снижается. ( C ) График разброса средней частоты связывания (черный) и средней частоты связывания на G-тракт (синий) для событий с более длительным временем пребывания (включены только события с τ> 2t ₁ ).Тенденции аналогичны случаю, когда были включены все связывающие события. Планки погрешностей для частот в (B) и (C) вычисляются из стандартных отклонений гауссовой аппроксимации для распределений в (A). ( D ) Распределение средних частот связывания для пяти сегментов FRET, каждый из которых охватывает диапазон FRET 0,2. Более высокие состояния FRET ближе к 5′-концу. Поскольку конструкции 4G-Tract и 8G-Tract относительно короткие, частоты связывания ограничены высокими уровнями FRET.Планки погрешностей основаны на анализе начальной загрузки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ FRET-PAINT для исследования доступности длинных теломерных выступов

Анализ FRET-PAINT был разработан для изучения доступности тандемных GQ, образующихся в длинных теломерных последовательностях (рис. 1A и B). Связывание цепи формирователя изображения, Cy5-PNA, с доступными (развернутыми) G-трактами в течение короткого периода времени приводит к всплескам интенсивности акцептора и эффективности FRET ( E _FRET ).Привязка к разным G-трактам приводит к пакетной передаче с разными уровнями E _FRET . На рисунке 1C показан пример временной диаграммы smFRET, демонстрирующей такие всплески.

Выбор ПНК в качестве цепи формирователя изображения был решающим для этого анализа. Диссоциация цепи формирователя изображения должна быть достаточно быстрой, чтобы гарантировать, что отдельные события связывания с стыковочной конструкцией не перекрываются, что устанавливает верхний предел концентрации цепи формирователя изображения. С другой стороны, концентрация должна быть достаточно высокой, чтобы наблюдать большое количество событий связывания и получать надежную статистику (50).Концентрация цепи Cy5-PNA поддерживалась на уровне 40 нМ, что было достаточно высоким, чтобы получить надежную статистику связывания, но достаточно низким, чтобы поддерживать низкий фон флуоресценции и незначительные ложноположительные пики FRET из-за неспецифического связывания Cy5-PNA с поверхностью в близость стыковочных сооружений. Нить формирователя изображения также должна оставаться связанной со стыковочной конструкцией в течение достаточно длительного времени, чтобы обеспечить надежное обнаружение событий привязки, то есть по крайней мере в несколько раз дольше, чем время интеграции кадра (100 мс для наших измерений).Обычно это может быть достигнуто с помощью более длинных нитей тепловизора, которые имеют больше дополнительных оснований для стыковочной конструкции. Однако использование более длинных цепей имидж-сканера потребует, чтобы они связались более чем с одним G-трактом, что приведет к перекрестным помехам между соседними G-трактами. В идеале нить тепловизора должна дополнять только один G-тракт, например 6 нт или меньше. Несмотря на то, что использовались последовательности, отличные от нашей, время диссоциации для цепей формирователя изображения ДНК длиной 6 н., 7 н., 8 н. И 9 н. Было указано как 3.7 мс, 4,8 мс, 63 мс и 670 мс соответственно (50). Учитывая это время диссоциации и ограничения во временном разрешении анализов smFRET (10–100 мс), минимально возможная длина цепи сканера ДНК будет 8–9 нуклеотидов. Однако наши исследования демонстрируют, что время диссоциации более 1 с возможно с цепью визуализатора PNA, которая комплементарна одному G-тракту.

Дополнительные рисунки S2 и S3 демонстрируют измерения, подтверждающие принцип действия, которые подтверждают использование анализа FRET-PAINT для изучения доступности длинных теломерных выступов.Присутствие GQ и их стабильность, как ожидается, будут влиять как на частоту связывания, так и на время пребывания цепей ПНК на теломерных выступах. Ожидается, что GQ с более высокой стабильностью будут разворачиваться реже, что приведет к менее частым событиям связывания PNA. Ожидается, что после их сворачивания более стабильные GQ будут более эффективно вытеснять любые связанные цепи ПНК из теломерных выступов. Чтобы проверить, наблюдаются ли они в данных FRET-PAINT, мы сравнили время пребывания и частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в 150 мМ KCl и 150 мМ LiCl.Поскольку K ⁺ значительно более эффективен в стабилизации GQ по сравнению с Li ⁺ , мы ожидаем более длительного времени пребывания и более высоких частот связывания в LiCl по сравнению с KCl, что было подтверждено данными, представленными на дополнительных рисунках S2B-C и S3. Средние частоты связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract были в 8,4 и 6,8 раз соответственно выше в LiCl по сравнению с KCl (дополнительный рисунок S2B-C). Характерные времена выдержки ( т ₂ ) составили 2.В 1 и 2,5 раза дольше в LiCl по сравнению с KCl для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract, соответственно (дополнительный рисунок S3). Кроме того, мы сравнили влияние небольшой молекулы, стабилизирующей GQ (36), на частоту связывания для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract в KCl (дополнительный рисунок S2B, C). Для конструкций 12G-Tract и 16G-Tract частоты связывания были в 2,9 раза ниже с небольшой молекулой по сравнению с ее отсутствием. Наконец, мы сравнили частоты связывания в KCl и LiCl для конструкции, которая не может образовывать GQ (конструкция 1G-Tract) и имеет единственный сайт связывания.Мы наблюдали практически одинаковые частоты связывания для конструкции 1G-Tract в KCl и LiCl (дополнительный рисунок S2A), предполагая, что различия, которые мы наблюдали для конструкций, образующих GQ, обусловлены вариациями в стабильности GQ.

Гистограммы пакетов FRET для конструкций 4G-Tract, 8G-Tract, 12G-Tract, 16G-Tract, 20G-Tract и 24G-Tract показаны на рисунке 2A. По мере увеличения количества G-трактов более низкие состояния FRET становятся более населенными, так как сайты связывания дальше от донора становятся доступными для Cy5-PNA.Увеличение популяции нижних состояний FRET количественно оценивается отношением общей популяции состояний [E _FRET <0,50] к [E _FRET > 0,50], как показано на рисунке 2B. С увеличением количества G-Tract в свесе это соотношение увеличивается с 0,13 для 4G-Tract до 0,72 для 24G-Tract. Уплотнение выступа за счет образования GQ позволило изучить такие длинные последовательности с помощью FRET.

Анализ времени выдержки

Программа Stepfinder использовалась для характеристики уровней E _FRET и времени пребывания (τ) событий связывания на временных графиках smFRET.На рисунке 3A показана временная диаграмма smFRET с подгонкой Stepfinder (красная линия). Пунктирная линия на E _FRET = 0,13 ( E _FRET = 0,25 до коррекции DO) указывает пороговый уровень FRET для рассмотрения пакета FRET как события связывания Cy5-PNA. Этот пороговый уровень FRET был определен на основе распределений FRET, представленных на рисунке 2A. Как указано красной стрелкой на гистограмме 24G-Tract, самой длинной конструкции, которую мы изучили, популяции FRET незначительны из-за событий связывания при E _FRET <0.13. Также требовалось, чтобы события оставались выше этого порогового уровня FRET для 4 последовательных точек, то есть τ ≥300 мс, чтобы отличить их от случайных флуктуаций сигнала. Распределение времени пребывания для всех конструкций показано на рисунке 3B. Распределение времени пребывания аппроксимируется с использованием функций одно- и двухэкспоненциального затухания, которые показаны пунктирными голубыми линиями и сплошными красными линиями на рисунке 3B. Полученные параметры подгонки двойного экспоненциального затухания приведены в дополнительной таблице S2.Двойное экспоненциальное совпадение было значительно лучше, чем одинарное экспоненциальное совпадение для всех конструкций ( P <0,001 для всех конструкций). F-статистика для этого сравнения приведена в дополнительной таблице S3. Двойная экспоненциальная аппроксимация дала постоянную времени быстрого затухания t ₁ и более медленную постоянную затухания t ₂ , которые перечислены на соответствующих гистограммах на рисунке 3B. В то время как время быстрого затухания одинаково для всех конструкций (≈0.7 ± 0,1 с), более медленные константы распада находятся в диапазоне 4,0–8,6 с, без явной зависимости от длины. Согласованность коротких времен пребывания для разных конструкций подразумевает, что они являются результатом одного и того же механизма, такого как частичная гибридизация PNA с G-трактами или с петлями TTA в GQ.

Данные времени пребывания могут быть дополнительно проанализированы, чтобы исследовать, приводит ли связывание PNA к различным сегментам конструкции, которые должны давать разные уровни FRET, к разному времени пребывания.Контурные графики времени пребывания и . E _FRET были созданы, чтобы ответить на этот вопрос (рис. 4A). Чтобы исключить случаи короткого связывания, которые могут быть следствием частичной гибридизации зонда PNA с теломерными последовательностями, мы включили в эти контурные графики времена пребывания, превышающие 1,0 с. Для ясности рисунков верхний предел на этих графиках установлен на уровне 7,0 с, даже несмотря на то, что малонаселенные карманы существуют при более длительном времени пребывания. Контурные графики, которые включают более короткие времена пребывания (<1.0 с) приведены на дополнительном рисунке S4. Связывание Cy5-PNA с 3'-концом и 5'-концом конструкции ДНК приводит к более низким и более высоким уровням FRET, соответственно. Как показано на рисунке 2A, совокупность нижних состояний FRET постепенно увеличивается с увеличением длины выступа. Для оценки среднего времени выдержки для различных положений выступа шкала E _FRET (0,0–1,0) была разделена на пять сегментов FRET равной ширины 0,2, как показано белыми пунктирными линиями на рисунке 4A. Для каждой конструкции было рассчитано среднее время пребывания в каждом из этих сегментов, как показано на рисунке 4B.За исключением конструкции 20G-Tract, односторонний анализ ANOVA не показал значимой разницы между средним временем пребывания для разных сегментов FRET для любой из конструкций. Чтобы получить глобальное среднее значение, время пребывания для каждого диапазона FRET было усреднено по всем конструкциям (рис. 4C). Однофакторный анализ ANOVA в этом случае также не показал существенной разницы во времени пребывания для разных сегментов FRET. Статистика одностороннего теста ANOVA приведена в дополнительной таблице S4. На основании этого мы заключаем, что время пребывания для связывания с разными сегментами теломерного выступа не различимо в пределах разрешающей способности наших измерений.

Частота связывания PNA

Доступность теломер может быть определена количественно путем вычисления частоты связывания цепей Cy5-PNA с G-трактами. Частота связывания рассчитывается путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения для каждой конструкции. Количество событий привязки было определено с использованием настраиваемого кода MATLAB, который обрабатывал соответствия, сгенерированные Stepfinder , и подсчитывал события привязки, которые имеют время задержки> 300 мс и E _FRET > 0.13, как описано ранее.

На рис. 5A показано распределение средних частот, полученное с помощью анализа бутстрэппинга. Пиковые значения этих распределений превосходно согласуются с вычисленными средними частотами связывания, полученными путем деления общего количества событий связывания на общее время наблюдения. Разброс распределений описывает неопределенность средних частот связывания. Планки погрешностей на рисунках 5B и C представляют собой стандартное отклонение гауссовых подходов к распределениям начальной загрузки, показанным на рисунке 5A.

Рисунок 5B показывает, что частота связывания обычно увеличивается с увеличением длины теломер, что согласуется с увеличением числа потенциальных сайтов связывания. С другой стороны, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с длиной теломер (Рисунок 5B, где включены как короткие, так и длинные времена пребывания). Подобные тенденции также наблюдаются, когда рассматриваются только события связывания с τ> 2 t ₁ , чтобы исключить события, которые потенциально представляют частичную гибридизацию PNA (рис. 5C).Уменьшение частоты связывания G-тракта с увеличением длины теломер предполагает уплотнение в структуре, которое становится более заметным по мере увеличения длины теломер. Это может быть связано с образованием структур более высокого порядка, возможно, опосредованным стэкингом GQ.

На фиг. 5D показаны частоты связывания, классифицированные на основе их уровней FRET, где шкала FRET разделена на пять сегментов, как на фиг. 4B. Как и ожидалось, из-за близости донорского флуорофора к доступным сайтам связывания в более коротких конструкциях (таких как 4G-Tract или 8G-Tract) более высокие частоты связывания наблюдаются для более высоких сегментов FRET.Частоты связывания более равномерно распределены для более длинных конструкций (таких как 20G-Tract или 24G-Tract), поскольку сайты связывания, расположенные дальше от донорского флуорофора, становятся доступными для связывания ПНК. Чтобы проверить, демонстрируют ли наблюдаемые частоты связывания значительные различия для разных сегментов FRET, был проведен односторонний анализ ANOVA с повторными измерениями, который показал значительные различия в пределах каждой конструкции. Результаты этого теста приведены в дополнительной таблице S5. Это особенно важно для более длинных конструкций, которые показывают более высокие частоты связывания в промежуточных сегментах по сравнению с 3 ‘или 5’ концами.Мы также выполнили тест попарного сравнения для сегментов FRET конструкции 20G-Tract и 24G-Tract, где частоты связывания для разных сегментов сравниваются с каждым из других сегментов. Результаты этого анализа представлены в виде контурного графика значений t на дополнительном рисунке S5 и в виде таблицы в дополнительной таблице S6. Эти анализы показывают, что GQ на 3′- и 5′-концах выступов в среднем менее доступны по сравнению с промежуточными областями, что согласуется с GQ, ингибирующими экзонуклеазную активность на концах теломеров (55).

Наши исследования демонстрируют, что даже хотя события связывания становятся более частыми по мере увеличения длины теломерной ДНК, частота связывания на G-тракт последовательно снижается с увеличением длины теломер, указывая на общее уплотнение структуры на более длинных участках. Это дает потенциальную основу для понимания того, как более длинные теломерные выступы уменьшают их доступность, формируя более компактные структуры. Это уплотнение будет способствовать защите концов теломеров от нуклеазной активности или агентов, которые в противном случае вызывали бы повреждение ДНК.Это также сделало бы теломерные выступы менее доступными для связывающих оцДНК белков, таких как RPA, накопление которых на теломерах будет запускать контрольную точку повреждения ДНК. С другой стороны, более компактная структура может также сделать теломерные GQ менее доступными для малых молекул и предъявить более строгие требования к потенциальным противораковым лекарствам, разработанным для ингибирования активности теломеразы.

По техническим причинам мы демонстрируем возможность использования FRET-PAINT в качестве инструмента для изучения доступности теломерных последовательностей, сходных по длине с теми, которые встречаются в физиологических условиях.Используя ПНК в качестве зонда, который образует более стабильный гетеродуплекс с ДНК по сравнению с гомодуплексом ДНК-ДНК или гетеродуплексом ДНК-РНК, можно было уменьшить размер зонда так, чтобы один G-тракт опрашивается за раз, сохраняя при этом измеримое время ожидания (∼1 с). Наши исследования также демонстрируют возможность распространения этого подхода на более сложные условия, где доступность теломер изучается в присутствии белков Shelterin, ДНК-связывающих белков, геликаз или агентов краудинга.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Все данные FRET отдельных молекул, представленные в этой рукописи, могут быть предоставлены по запросу от соответствующего автора.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим доктора Лука Лёффа (Технический университет Делфта, Нидерланды) за то, что он поделился с нами программой Stepfinder и за его помощь в ее реализации.Мы хотели бы поблагодарить Кристин Йегер и Викторию Рейнольдс (статистический консалтинг, библиотеки Кентского государственного университета) за их помощь в проведении статистического анализа. Мы благодарим Эрика Йоки за его помощь в вычитке и редактировании рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальные институты здравоохранения США [1R15GM109386 и 1R15GM123443 — H.B]. Финансирование платы за открытый доступ: NIH [1R15GM123443].

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

Блэкберн

E.H.

Строение и функции теломер

Природа

1991

350

569

573

Макаров

В.Л.

Hirose

Y.

Langmore

J.P.

Длинные G-хвосты на обоих концах хромосом человека предполагают механизм деградации С-цепи для укорочения теломер

Ячейка

1997

88

657

666

Wright

W.E.

Тесмер

В.М.

Huffman

K.E.

Levene

S.D.

Shay

J.W.

Нормальные человеческие хромосомы имеют длинные G-богатые теломерные выступы на одном конце

Genes Dev.

1997

11

2801

2809

Stewart

S.A.

Ben-Porath

I.

Carey

V.J.

O’Connor

B.F.

Hahn

W.C.

Weinberg

R.A

Эрозия теломерного однонитевого выступа при репликативном старении

Nat. Genet.

2003

33

492

496

Verdun

R.E.

Karlseder

J.

Репликация и защита теломер

Природа

2007

447

924

931

Rhodes

D.

Lipps

H.J.

Обзор и сводка G-квадруплексов и их регуляторные роли в биологии

Nucleic Acids Res.

2015

43

8627

8637

Testorelli

C.

Теломераза и рак

J. Exp. Clin. Cancer Res.

2003

22

165

169

Hanahan

D.

Weinberg

R.A.

Признаки рака: новое поколение

Ячейка

2011

144

646

674

Джафри

M.A.

Ansari

S.A.

Alqahtani

M.H.

Shay

J.W.

Роль теломер и теломеразы в развитии рака и достижения в области терапии, направленной на теломеразу

Геном Мед

2016

8

69

Shay

J.W.

Wright

W.E.

Теломеры и теломераза в нормальных и раковых стволовых клетках

FEBS Lett.

2010

584

3819

3825

Хендерсон

E.

Hardin

C.C.

Прогулка

S.K.

Тиноко

I.

Блэкберн

E.H.

Теломерные олигонуклеотиды ДНК образуют новые внутримолекулярные структуры, содержащие пары оснований гуанин · гуанин

Ячейка

1987

51

899

908

Sen

D.

Gilbert

W.

Образование параллельных четырехцепочечных комплексов богатыми гуанином мотивами в ДНК и его значение для мейоза

Природа

1988

334

364

366

Biffi

G.

Tannahill

D.

McCafferty

J.

Balasubramanian

S.

Количественная визуализация структур G-квадруплексов ДНК в клетках человека

Nat. Chem.

2013

5

182

186

Оганесян

L.

Karlseder

J.

Теломерная броня: слои торцевой защиты

J. Cell Sci.

2009

122

4013

4025

Henderson

A.

Wu

Y.

Huang

Y.C.

Чавес

E.A.

Platt

J.

Johnson

F.B.

Брош

Р.М.

Сен

D.

Lansdorp

P.M.

Обнаружение G-квадруплексной ДНК в клетках млекопитающих

Nucleic Acids Res.

2014

42

860

869

Zhang

S.

Sun

H.

Wang

L.

Liu

Y.

Chen

H.

Li

Q.

Гуань

А.

Лю

М.

Tang

Y.

Мониторинг G-квадруплексов ДНК в живых клетках в реальном времени с помощью низкомолекулярного флуоресцентного зонда

Nucleic Acids Res.

2018

46

7522

7532

Di Antonio

M.

Ponjavic

A.

Radzevičius

A.

Ranasinghe

R.T.

Catalano

M.

Zhang

X.

Шен

Дж.

Нидхэм

Л.-М.

Ли

S.F.

Кленерман

D.

Одномолекулярная визуализация образования G-квадруплексов ДНК в живых клетках

Nat. Chem.

2020

12

832

837

Gellert

M.

Lipsett

M.N.

Дэвис

D.R.

Образование спирали гуаниловой кислотой

Proc. Natl. Акад. Sci. США

1962

48

2013

2018

Neidle

S.

Parkinson

G.N.

Строение теломерной ДНК

Curr. Opin. Struct. Биол.

2003

13

275

283

Burge

S.

Parkinson

г.N.

Hazel

P.

Todd

A.K.

Neidle

S.

Квадруплексная ДНК: последовательность, топология и структура

Nucleic Acids Res.

2006

34

5402

5415

Hwang

H.

Kreig

A.

Calvert

J.

Lormand

J.

Kwon

Y.

Daley

J.M.

Sung

P.

Opresko

P.L.

Myong

S.

Длина теломерного выступа определяет структурную динамику и доступность для теломеразы и ALT-ассоциированных белков

Строение

2014

22

842

853

Wang

Q.

Liu

J.Q.

Чен

З.

Zheng

K.W.

Chen

C.Y.

Хао

Y.H.

Tan

Z.

Образование G-квадруплекса на 3′-конце теломерной ДНК ингибирует его удлинение с помощью теломеразы, полимеразы и раскручивание с помощью геликазы

Nucleic Acids Res.

2011

39

6229

6237

Cheong

В.В.

Хедди

Б.

Lech

C.J.

Phan

A.T.

Ксантин и 8-оксогуанин в G-квадруплексах: образование тетрады G · G · X · O

Nucleic Acids Res.

2015

43

10506

10514

Spiegel

J.

Adhikari

S.

Balasubramanian

S.

Структура и функции G-квадруплексов ДНК

Trends Chem

2020

2

123

136

Neidle

S.

Теломерный G-квадруплекс человека: Текущее состояние теломерных G-квадруплексов как терапевтических мишеней при раке человека

FEBS J.

2010

277

1118

1125

Серый

R.D.

Trent

J.O.

Стулья

J.B.

Пути сворачивания и разворачивания теломерного G-квадруплекса человека

J. Mol. Биол.

2014

426

1629

1650

Bessi

I.

Jonker

H.R.A.

Richter

C.

Schwalbe

H

Участие долгоживущих промежуточных состояний в сложном пути сворачивания теломерного G-Quadruplex человека

Angew. Chem. — Int. Эд.

2015

54

8444

8448

Marchand

A.

Gabelica

V.

Пути сворачивания и неправильного сворачивания G-квадруплекса ДНК

Nucleic Acids Res.

2016

44

10999

11012

Bhattacharyya

D.

Arachchilage

G.M.

Басу

С.

Катионы металлов в складчатости и стабильности G-квадруплекса

Фронт. Chem.

2016

4

38

Fujii

T.

Podbevšek

P.

Plavec

J.

Sugimoto

N.

Влияние ионов металлов и соолутов на топологию G-квадруплекса

J. Inorg. Biochem.

2017

166

190

198

Maleki

P.

Ma

Y.

Iida

K.

Nagasawa

K.

Balci

H.

Исследование одной молекулы флуоресцентно меченное производное теломестатина и G-квадруплексные взаимодействия

Nucleic Acids Res.

2017

45

288

295

Ray

S.

Bandaria

J.N.

Qureshi

M.H.

Yildiz

A.

Balci

H.

Образование G-квадруплекса в теломерах усиливает защиту POT1 / TPP1 от связывания RPA

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2014

111

2990

2995

Ray

S.

Qureshi

M.H.

Малкольм

Д.У.

Budhathoki

J.B.

Çelik

U.

Balci

H.

RPA-опосредованное разворачивание систематически изменяющихся структур G-квадруплекса

Biophys. J.

2013

104

2235

2245

Budhathoki

J.B.

Ray

S.

Urban

V.

Janscak

P.

Yodh

J.G.

Бальчи

H.

RecQ-ядро BLM разворачивает теломерный G-квадруплекс в отсутствие ATP

Nucleic Acids Res.

2015

42

11528

11545

Budhathoki

J.B.

Stafford

E.J.

Йод

J.G.

Balci

H.

АТФ-зависимый G-квадруплекс, разворачивающийся с помощью геликазы Блума, обнаруживает низкую процессивность

Nucleic Acids Res.

2015

43

5961

5970

Maleki

P.

Mustafa

G.

Gyawali

P.

Budhathoki

JB

Ma

Y.

Nagasawa

K.

Nagasawa

K.

H.

Количественная оценка воздействия низкомолекулярных лигандов на стабильность G-квадруплекса против геликазы Блума

Nucleic Acids Res.

2019

47

10744

10753

Chandradoss

S.D.

Haagsma

A.C.

Lee

Y.K.

Hwang

J.H.

Nam

J.M.

Joo

C.

Пассивация поверхности для исследования одномолекулярных белков

J. Vis. Exp.

2014

86

e50549

Neidle

S.

Квадруплексные нуклеиновые кислоты как новые терапевтические мишени

J. Med. Chem.

2016

59

5987

6011

Abraham Punnoose

J.

Cui

Y.

Koirala

D.

Yangyuoru

P.M.

Ghimire

C.

Shrestha

P.

Mao

H.

Взаимодействие G-квадруплексов в 3-м теломерном оверхенге во всю длину

J. Am. Chem. Soc.

2014

136

18062

18069

Yu

H.Q.

Miyoshi

D.

Sugimoto

N.

Характеристика структуры и стабильности G-квадруплексов длинной теломерной ДНК

J. Am. Chem. Soc.

2006

128

15461

15468

Petraccone

L.

Spink

C.

Trent

J.O.

Garbett

N.C.

Mekmaysy

C.S.

Giancola

C.

Chaires

J.B.

Структура и стабильность теломерных квадруплексов человека высшего порядка

J. Am. Chem. Soc.

2011

133

20951

20961

Xu

Y.

Ishizuka

T.

Kurabayashi

K.

Komiyama

M.

Последовательное образование G-квадруплексов в ДНК человека, перекрывающего теломерию: структура концов теломер

Angew. Chemie — Int. Эд.

2009

48

7833

7836

Ван

Х.

Нора

Г.J.

Ghodke

H.

Opresko

P.L.

Исследования одиночных молекул физиологически релевантных теломерных хвостов выявили механизм POT1, способствующий разворачиванию G-квадруплексов

J. Biol. Chem.

2011

286

7479

7489

Abraham Punnoose

J.

Ma

Y.

Hoque

M.E.

Cui

Y.

Sasaki

S.

Guo

AH

Nagasawa

K.

Mao

H. кинетический шаблон складывания с целевыми свободными G-Tracts

Биохимия

2018

57

6946

6955

Кар

А.

Джонс

Н.

Ozlem Arat

N.

Fishel

R.

Griffith

JD

Длинно повторяющаяся (TTAGGG) n одноцепочечная ДНК самоконденсируется в компактные бисерные нити, стабилизированные образованием G-квадруплекса

J. Biol. Chem.

2018

293

9473

9485

Sannohe

Y.

Sato

K.

Matsugami

A.

Shinohara

K. ichi

Mashimo

T.

Katahira

M.

Sugiyama

H. удлиненные олигонуклеотиды

Bioorganic Med. Chem.

2009

17

1870

1875

Vorlíčková

M.

Chládková

J.

Kejnovská

I.

Fialová

M.

Kypr

J.

Топология гуанинового тетраплекса теломер ДНК человека определяется количеством (TTAGGG) повторов

Nucleic Acids Res.

2005

33

5851

5860

Maleki

P.

Budhathoki

J.B.

Roy

W.A.

Balci

H.

Практическое руководство по изучению структур G-квадруплексов с использованием одномолекулярного FRET

Мол. Genet. Геномика

2017

292

483

498

Auer

A.

Strauss

M.T.

Schlichthaerle

T.

Jungmann

R.

Быстрая визуализация ДНК-PAINT без фона с использованием зондов на основе FRET

Nano Lett.

2017

17

6428

6434

Lee

J.

Park

S.

Hohng

S.

Ускоренная микроскопия FRET-PAINT

Мол. Мозг

2018

11

70

Jungmann

R.

Steinhauer

C.

Scheible

M.

Kuzyk

A.

Tinnefeld

P.

Simmel

F.C.

Кинетика одиночных молекул и микроскопия сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной визуализации временного связывания на ДНК оригами

Nano Lett.

2010

10

4756

4761

Loeff

L.

Борьба с микробами: освещение адаптивного иммунитета CRISPR с использованием флуоресценции одиночных молекул

2017

Делфтский технологический университет

Kerssemakers

J.W.J.

Лаура Мунтяну

E.

Laan

L.

Noetzel

T.L.

Janson

M.E.

Dogterom

M

Динамика сборки микротрубочек при молекулярном разрешении

Природа

2006

442

709

712

Эфрон

Б.

Тибширани

Р.J.

Введение в Bootstrap

1993

NY

Chapman & Hall

Тан

Дж.

Кан

З.Й.

Yao

Y.

Wang

Q.

Hao

Y.H.

Tan

Z.

G-квадруплекс преимущественно образуется на самом 3′-конце теломерной ДНК позвоночных

Nucleic Acids Res.

2008

36

1200

1208

© Автор (ы) 2021. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gαi1, Gαi2 и Gαi3 в отдельных клетках

Abstract

Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), могут активировать гетеротримерный комплекс G-белка с субсекундной кинетикой.Генетически закодированные биосенсоры на основе резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET) идеально подходят для изучения таких быстрых сигнальных событий в отдельных живых клетках. Здесь мы сообщаем о создании и характеристике трех биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 . Для обеспечения количественной долгосрочной визуализации биосенсоров FRET с высоким динамическим диапазоном требуются флуоресцентные белки с улучшенными фотофизическими свойствами.Следовательно, мы используем самый яркий и наиболее фотостабильный вариант CFP, mTurquoise2, в качестве донора, слитого с субъединицей Gα _и , и cp173Venus, слитый с субъединицей Gγ ₂ , в качестве акцептора. Конструкции биосенсоров Gα _i FRET экспрессируются вместе с Gβ ₁ из одной плазмиды, обеспечивая предпочтительные относительные уровни экспрессии с уменьшенными вариациями в клетках млекопитающих. Датчики Gα _i FRET показали устойчивый ответ на активацию эндогенных или сверхэкспрессированных альфа-2А-адренорецепторов, которая ингибировалась токсином коклюша.Более того, мы наблюдали активацию FRET-сенсора Gα _i в отдельных клетках при стимуляции нескольких GPCR, включая рецептор LPA ₂ , M ₃ и BK ₂ . Кроме того, мы показываем, что датчики хорошо подходят для извлечения кинетических параметров из быстрых измерений в миллисекундном диапазоне времени. Это новое поколение биосенсоров FRET для активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 будет полезно для измерений на живых клетках, которые проверяют активацию Gα _i .

Образец цитирования: van Unen J, Stumpf AD, Schmid B, Reinhard NR, Hordijk PL, Hoffmann C, et al. (2016) Новое поколение датчиков FRET для надежного измерения кинетики активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 в отдельных клетках. PLoS ONE 11 (1): e0146789. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789

Редактор: Микель Гарсиа-Маркос, Медицинский факультет Бостонского университета, США

Поступила: 25 сентября 2015 г .; Одобрена: 22 декабря 2015 г .; Опубликован: 22 января 2016 г.

Авторские права: © 2016 van Unen et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: У авторов нет поддержки или финансирования, чтобы сообщить.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Подкласс Gα _i гетеротримерных G-белков состоит из 3 членов у человека, Gα _i1,2,3 , кодируемых генами GNAI1, GNAI2, GNAI3 [1], и активируется широким диапазоном Рецепторы, сопряженные с G-белком. Семейство G-белков Gα _i вовлечено в многочисленные патологии, от участия в ожирении и диабете [2], функций иммунной системы [3] до их критических ролей на нескольких этапах биологии рака [4-7]. .Активация Gα _i преимущественно связана с ингибированием аденилатциклаз, что приводит к снижению накопления цАМФ в клетках. Однако недавно активация Gα _i была связана с несколькими другими молекулярными эффекторами, включая PI3K / Akt [8,9], ERK [10] и c-Src [5].

Измерение активации Gα _i обычно проводят путем измерения ингибирования индуцированной форсколином продукции цАМФ. Подобно анализам фосфорилирования дальше по течению, такие измерения не имеют пространственного разрешения, имеют ограниченное временное разрешение и могут зависеть от значительных перекрестных помех и усиления или десенсибилизации сигнала [11–13].

Для прямого исследования активации G-белка с высоким пространственно-временным разрешением можно использовать генетически закодированные биосенсоры FRET (Förster Resonance Energy Transfer) или BRET (Bioluminescent Resonance Energy Transfer) [14]. Эти методы основаны на измерении безызлучательной передачи энергии от молекулы донора к молекуле акцептора, которая имеет место только тогда, когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости друг от друга (<10 нм). Изменения расстояния или ориентации между донорным и акцепторным диполем приводят к изменениям в эффективности RET, которые могут быть определены количественно.

Методы RET позволяют регистрировать кинетику отдельных клеток с миллисекундным разрешением, что может использоваться для определения межклеточной гетерогенности и записи фармакокинетических параметров. Более того, этот подход может регистрировать активацию GPCR в физиологических условиях in vivo [15].

Gα _i был успешно помечен люциферазой в различных внутренних сайтах и ​​использован для измерения BRET между различными субъединицами Gα _i и GPCR [16–19] или Gγ [19].Также были выполнены измерения FRET между флуоресцентно меченными Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 и Gβ [20] или Gγ [21].

Для выполнения измерений FRET необходима спектрально перекрывающаяся пара донора и акцептора [24], и ранее было показано, что использование более ярких флуоресцентных белков может улучшить чувствительность измерений биосенсора FRET [22,23]. Чтобы получить надежные измерения FRET, которые исследуют активацию Gα _i , мы соединили Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 с самым ярким и наиболее фотостабильным мономерным циановым флуоресцентным белком (CFP), доступным в настоящее время, mTurquoise2. (mTq2) [25].В качестве акцептора мы использовали кольцевую пермутированную Венеру (cpVenus), слитую с Gγ ₂ , которая ранее использовалась в качестве акцептора в единственном плазмиде Gα _q FRET-сенсоре [26]. Мы используем единую плазмидную стратегию для облегчения протоколов трансфекции и обеспечения четко определенного соотношения экспрессии донора и акцептора в клетках [27]. Эта стратегия экспрессии должна значительно облегчить использование и воспроизводимость результатов этих датчиков. Мы представляем стратегию создания, проверку и описание этого нового поколения датчиков FRET для активации Gα _i1 Gα _i2 и Gα _i3 .Эти биосенсоры очень хорошо подходят для микроскопии живых клеток и могут использоваться для быстрых кинетических измерений в миллисекундном диапазоне, что позволяет определять фармакологические характеристики лекарственного средства и определять on- и off-кинетику для агонистов и антагонистов в Gα _и -связанных GPCR.

Результаты

Создание конструкций

Мономерный вариант CFP mTurquoise2, предпочтительный донор в парах CFP-YFP FRET из-за его высокого квантового выхода и фотостабильности [25], был вставлен в Gα _i1 после аланина в положении 121 в петле αB-αC.Этот сайт встраивания, который, как было ранее показано, сохраняет скорости обмена нуклеотидов и GTPase реакции, сопоставимые с белками дикого типа [20]. Gα _i1 -mTq2 обнаруживает локализацию плазматической мембраны при экспрессии в клетках HeLa (рис. 1A). Были проведены пробные эксперименты, чтобы проверить, подходит ли Gα _i1 -mTq2 для измерения с помощью FRET активации комплекса гетеротримерного G-белка при активации GPCR. С этой целью как Gβ, так и Gγ могут быть помечены акцептором для измерения активации гетеротримерного G-белка с помощью FRET [20,21].Ранее мы показали, что самый высокий контраст FRET для Gα _q достигается с cpVenus-Gγ ₂ [26]. Поскольку Gα _i имеет высокую структурную гомологию с Gα _q и сайт, в который вставлен mTurquoise2, аналогичен, мы решили использовать здесь тот же акцептор FRET. Следовательно, чтобы ввести меченый гетеротримерный G-протеиновый комплекс в клетки, мы совместно экспрессировали Gα _i1 -mTq2 вместе с акцептором FRET cpVenus-Gγ ₂ и немаркированным Gβ ₁ [26].Стимуляция коэкспрессированного адренергического рецептора α ₂ (α ₂ AR) с UK14,304 показывает быстрое увеличение флуоресценции CFP и сопутствующую потерю сенсибилизированной эмиссии из канала YFP, отражающую потерю FRET. Утрата FRET может быть интерпретирована как диссоциация гетеротримеров или изменение относительной конформации донора и акцептора. Чтобы обеспечить устойчивую коэкспрессию различных компонентов мультимерного сенсора FRET, мы ввели субъединицы в одну и ту же плазмиду, как мы сообщали ранее для сенсора Gα _q (рис. 1B) [26].В этой стратегии используется вирусный пептид 2A и последовательность IRES для обеспечения оптимальных относительных уровней донора (Gα _i1 -mTq2) и акцептора (cpVenus-Gγ ₂ ) в отдельных клетках при минимизации гетерогенности межклеточной экспрессии. в образце. После создания нашего первого варианта мы заметили, что Gα _i1 -mTq2 неправильно локализован в цитоплазме многих клеток (Рис. 1C). Субъединица Gα _i1 миристоилирована и требует наличия остатка глицина сразу после ее исходного метионина.Детальный анализ плазмидной последовательности выявил дополнительный стартовый кодон для Gα _i1 -mTq2 перед нативным стартовым кодоном, генерируемый последовательностью IRES (фиг. 1B). Мы предположили, что в нашем первом варианте сенсора большая часть продуцируемого белка Gα _i1 -mTq2 транслируется из вышележащего метионина в последовательности IRES, что не приводит к образованию миристоилированного белка. Мы удалили вышестоящий метионин с помощью ПЦР с полным вектором (см. Материалы и методы), в результате чего остался только нативный стартовый кодон Gα _i1 -mTq2, за которым следует глицин, обеспечивающий консенсусную последовательность для миристоилирования.Действительно, после трансфекции клеток новой плазмидой мы наблюдали правильно локализованный Gα _i1 -mTq2 (рис. 1B и 1C). Аналогичным образом были сконструированы датчик Gα _i2 и датчик Gα _i3 . Чтобы изучить коэкспрессию трех субъединиц (Gα _i1 -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) из одной плазмиды по сравнению с тремя отдельными плазмидами, мы количественно оценили флуоресценцию CFP и YFP в этих двух экспериментальных условия (рис. 1D). Флуоресценция CFP и YFP при трансфекции стратегии одиночной плазмиды имела коэффициент детерминации r ² , равный 0.64, тогда как трансфекции тремя отдельными плазмидами показали коэффициент детерминации r ² 0,36 между интенсивностью CFP и интенсивностью YFP. Другими словами, корреляция между экспрессией CFP и YFP лучше в конфигурации с одной плазмидой, что указывает на явное преимущество этой конструкции. Дополнительным преимуществом этой плазмиды является экспрессия белка 3: 1 выше и ниже последовательности IRES, что, как ранее было показано, приводит к предпочтительному соотношению экспрессии донора (CFP) и акцептора (YFP) для аналогичного Gα _q FRET. датчик [27].Наконец, отдельные плазмидные конструкции упростят введение в первичные клетки, создание стабильных клеточных линий или трансгенных организмов с Gα _i -сенсорами.

Рис. 1. Разработка и характеристика нового датчика Gα _i1 .

(A) Типичное изображение, показывающее локализацию на плазматической мембране Gα _i1 , слитого с mTurquoise2-Δ9, экспрессированного в клетках HeLa. (B) Схематический обзор плазмиды, содержащей pGβ-2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -CFP, управляемую промотором CMV.На вставке показана последовательность ДНК, кодирующая конец последовательности IRES и начало последовательности Gα _i1 . Предлагаемая трансляция белка показана в строке под последовательностью ДНК (однобуквенные сокращения аминокислот). (C) Конфокальные изображения локализации Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 ( верхний ряд ) и cp173Venus-Gγ ₂ ( нижний ряд ) в клетках HeLa, для варианта 1.0 ( левый столбец ) и вариант 2.0 ( правый столбец ) датчика Gα _i1 .(D) Количественный анализ коэкспрессии каналов CFP и YFP трансфекций cp173Venus-Gγ ₂ и Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 в клетках HeLa. Трансфекция одной плазмиды ( слева, ) по сравнению с трансфекцией отдельных плазмид ( справа, ). Точки отображают интенсивность CFP и YFP, количественно определенную для отдельных отдельных ячеек. R ² — коэффициент детерминации. Ширина отдельных изображений в A и C составляет 143 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0146789.g001

Показатели в анализах активации GPCR

Для тестирования нового биосенсора Gα _i1 при визуализации живых клеток мы использовали хорошо охарактеризованный GPCR, который, как известно, связан с Gα _i1 , адренергическим рецептором α ₂ (α ₂ AR). Клетки HeLa, которые, как было показано ранее, эндогенно содержат АР α ₂ [20], были трансфицированы биосенсором Gα _i1 . При добавлении 10 мкМ UK14,304 мы наблюдали устойчивую потерю FRET, измеряя соотношение между флуоресценцией YFP и CFP биосенсора Gα _i1 , которая была возвращена к исходному уровню добавлением 60 мкМ α ₂ AR. антагонист Йохимбин (рис. 2А). Токсин коклюша (PTX), как было показано, инактивирует передачу сигналов Gα _i в клетках посредством АДФ-рибозилирования субъединицы Gα _i [28], что предотвращает его взаимодействие с GPCR. Активация Gα _i1 была полностью отменена инкубацией в течение ночи с PTX, что показывает, что слияние белка Gα _i1 -mTq2 все еще остается чувствительным к PTX (рис. 2A). Чтобы подтвердить, что датчик может быть использован для анализа активации эндогенных рецепторов в первичных клетках Gα _i1 , мы повторили этот эксперимент на HUVEC (эндотелиальных клетках пупочной вены человека).Добавление хорошо известного стимулятора HUVEC, S1P [29], вызывало стойкое снижение отношения FRET для Gα _i1 -сенсора (рис. 2B), ночная обработка PTX полностью устраняла этот ответ. Затем, чтобы исследовать, насколько надежен датчик Gα _i1 на других анализах активации GPCR, мы протестировали множество GPCR, которые, как было показано, связаны с Gα _i . Рецептор брадикинина 2B (BK _2B ) [30], рецептор лизофосфатидной кислоты 2 (LPA ₂ ) [31,32] и рецептор мускаринового ацетилхолина 3 (M ₃ ) [33,34] были котрансфицированы биосенсор Gα _i1 в клетках HeLa.После стимуляции соответствующими агонистами все три рецептора показали устойчивое снижение соотношения FRET биосенсора Gα _i1 (рис. 2C). Рецептор M ₃ также показал полное восстановление до исходного уровня отношения FRET после добавления антагониста атропина. Рецептор M ₃ в основном известен своей передачей сигналов через Gα _q . Тем не менее, предыдущие исследования показали активацию Gα _i через рецептор M ₃ [19,33–36], что согласуется с нашими наблюдениями.

Рис. 2. Характеристики Gα _i -сенсоров в анализах передачи сигналов GPCR одиночной клетки.

(A) Эксперименты по визуализации соотношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 . Быстрая потеря FRET, наблюдаемая по уменьшению отношения YFP / CFP, после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, специфического агониста α ₂ AR, добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсор в клетках, стимулированных UK-14304.(B) Эксперименты по визуализации отношения FRET в Huvecs, трансфицированных Gα _i1 -сенсором. Устойчивая потеря FRET наблюдается после стимуляции 500 нМ S1P (сфингозин-1-фосфат). Ночная обработка (100 нг / мл) PTX устраняет ответ на Gα _i1 -сенсор в S1P-стимулированных клетках. (C) Эксперименты по визуализации отношения FRET клеток HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i1 и BK _2B ( вверху справа ), LPA ₂ ( вверху слева ), M ₃ ( внизу справа ) и β ₂ AR-2A2-m Черри ( внизу слева ) стимулировали 1 мкМ брадикинина (BK _2B ), 1 мкМ лизофосфатидовой кислоты (LPA ₂ ), 100 мкМ карбахола и 10 мкМ атропина. (M ₃ ) или 10 мкМ изопротеренола и 10 мкМ пропранолола (β ₂ AR).Клетки HeLa, трансфицированные рецепторами BK _2B , LPA ₂ и M ₃ , демонстрируют четкое изменение соотношения YFP / CFP FRET при добавлении их соответствующих агонистов, тогда как стимуляция β ₂ AR не изменяет FRET. передаточное отношение датчика Gα _i1 . В контрольных условиях клетки HeLa, трансфицированные только сенсором Gα _i1 , получали идентичные стимуляции. (D) Эксперименты по визуализации отношения FRET в клетках HeLa, трансфицированных датчиком Gα _i2 или датчиком Gα _i3 .Быстрая потеря FRET наблюдается после стимуляции клеток 10 мкМ UK-14,304, последующее добавление 60 мкМ йохимбина возвращает соотношение FRET к исходным уровням. Ночная обработка (100 нг / мл) коклюшного токсина (PTX) устраняет ответ на биосенсоры Gα _i2 и Gα _i3 в клетках, стимулированных UK-14304. Клетки HeLa стимулировали агонистом при t, = 32 секунды, и антагонист добавляли при t, = 152 секунды, где указано. Клетки Huvec стимулировали S1P при t = 55 секунд.Временные диаграммы показывают среднее изменение отношения флуоресценции YFP / CFP (± s.e.m). Средние кривые состоят из данных по меньшей мере 3 независимых экспериментов, проведенных в разные дни, с указанным количеством клеток ( n ) на условие.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g002

В условиях контроля, например отсутствие сверхэкспрессированного GPCR, мы стимулировали клетки HeLa соответствующим агонистом и антагонистом, и мы наблюдали только очень незначительный ответ на датчике Gα _i1 в случае стимуляции LPA.Скорее всего, это связано с активацией эндогенных рецепторов LPA в клетках HeLa [37]. Когда мы котрансфицировали адренергический рецептор β ₂ (β ₂ AR), ни одна из клеток не показала активацию Gα _i1 в ответ на лечение агонистом и антагонистом (рис. 2C). Следует отметить, что β ₂ AR является классическим активатором Gα _s , но при определенных условиях сообщалось о переходе на Gα _i [38]. Наши результаты согласуются с единственным известным нам исследованием, в котором используются аналогичные инструменты (сенсоры на основе BRET) и сходные условия (сверхэкспрессия β ₂ AR и сенсоры гетеротримерных G-белков) [19].Также в этом случае не наблюдалась активация Gα _i1 при стимуляции β ₂ AR (и только небольшая активация Gα _i2 и Gα _i3 , которая была> 10 раз ниже, чем активация альфа-2C. адренергический рецептор, сильный активатор Gα _i ).

Чтобы проверить работоспособность биосенсоров Gα _i2 и Gα _i3 , мы трансфицировали клетки HeLa их соответствующими плазмидами. Подобно эксперименту с биосенсором Gα _i1 на рис. 2А, мы наблюдали устойчивую потерю FRET после добавления 10 мкМ UK14,304, и сигнал вернулся к исходному уровню при добавлении 60 мкМ йохимбина (рис. 2D).В этих экспериментальных условиях мы не наблюдали существенных различий в кинетике активации или амплитуде ответов между тремя различными субъединицами Gα _i . И Gα _i2 -mTq2, и Gα _i3 -mTq2 все еще чувствительны к лечению PTX, как показано отменой ответа FRET после инкубации с PTX в течение ночи (рис. 2D).

Быстрые кинетические измерения

Чтобы более подробно изучить субсекундную кинетику активации Gα _i1 в живых клетках, клетки HEK293 котрансфицировали с помощью Gα _i1 -сенсора и α ₂ AR или рецептора аденозина A1. соответственно.Используя систему быстрой перфузии для нанесения лиганда, измерения FRET одной клетки показывают быструю потерю отношения FRET более чем на 15% после кратковременного применения 20 мкМ норэпинефрина. После отмывания лиганда сигнал FRET возвращается к исходным уровням. Это можно было воспроизвести несколько раз без видимой потери амплитуды сигнала (рис. 3А). Аналогичный ответ наблюдался для аденозинового рецептора A1 после непродолжительного применения эндогенного лиганда аденозина (30 мкМ) (рис. 3B).

Рис 3.Характеристики датчика Gα _i1 при кинетических измерениях.

(A) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и α ₂ AR, многократно стимулировали 20 мкМ норэпинефрина в течение интервалов, обозначенных короткими горизонтальными линиями. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET.(B) Клетки HEK293, трансфицированные Gα _i1 -сенсором и аденозиновым A1-рецептором, стимулировали 30 мкМ аденозина, что показано короткой горизонтальной линией. Представленные данные являются репрезентативными по крайней мере для шести различных трансфекций, проведенных в течение шести экспериментальных дней. Верхняя панель: эмиссия YFP, центральная панель: эмиссия CFP, нижняя панель: скорректированный и нормализованный коэффициент FRET. (C) Увеличенное изображение он-кинетики активации Gα _i1 , показывающее нормализованное соотношение FRET во время первой стимуляции эксперимента в (A), приспособленное к однокомпонентной экспоненциальной функции затухания с tau = 1160 мс и амплитудой = 0.18 (R = 0,99). (D) График разброса, показывающий средние экспоненциальные постоянные времени (тау) объединенных данных из (n = 10) индивидуальных подборов клеток HEK293, трансфицированных Gα _i1 -сенсором, и α ₂ AR, стимулированных 100 мкМ норэпинефрина или объединенных данные (n = 14) по индивидуальным подборам Gα _i1 -сенсора и аденозинового A1-рецептора, стимулированного 30 мкМ аденозина, соответственно. Планки погрешностей указывают 95% доверительный интервал.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146789.g003

Эти быстрые измерения FRET можно использовать для оценки кинетики активации Gα _i1 с субсекундным разрешением (рис. 3C), как показано крупным планом первой стимуляции в эксперименте, показанном на рис. 3А. Кривая была подогнана к однокомпонентной функции экспоненциального затухания, как описано ранее [39], в результате чего экспоненциальная постоянная времени (τ) составила 1160 мс.

Чтобы оценить точную динамическую кинетику датчика Gα _i1 , клетки стимулировали насыщающими концентрациями лиганда (100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина).Каждый индивидуальный ответ был подогнан к однокомпонентной экспоненте, что привело к средним значениям τ для α ₂ AR, равным 887 мс, и для аденозина A1, равным 963 мс (рис. 3D), что соответствует периодам полувыведения 614 мс и 668 мс соответственно. Эти значения хорошо согласуются с более ранними наблюдениями активации G-белка с помощью FRET [21,40,41].

Заключительные замечания

В этой рукописи мы описываем дизайн, конструкцию и характеристики трех новых биосенсоров FRET для измерения активации Gα _i1 , Gα _i2 , Gα _i3 .Новые сенсоры содержат субъединицу Gα, слитую с донорским флуорофором, mTurquoise2, и субъединицу Gγ, слитую с cp173Venus, поскольку ранее было показано, что эта комбинация для сенсора FRET Gα _q обеспечивает наибольший динамический диапазон [26]. Три субъединицы гетеротримеров (Gα _i -mTq2, Gβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ ) были сконфигурированы на одной плазмиде, что позволило обеспечить устойчивую коэкспрессию с предпочтительной стехиометрией. Мы показываем, что эти датчики хорошо подходят для микроскопии живых клеток и извлечения кинетических параметров с помощью ратиометрической визуализации FRET одной клетки.Стандартизированная компоновка этих биосенсоров FRET для активации G-протеина повысит надежность и воспроизводимость экспериментов внутри лабораторий и между ними. Примером в данной статье является надежная работа датчика Gα _i1 в трех разных лабораториях без оптимизации экспериментальных условий.

Одним из ограничений биосенсоров на основе переноса энергии для гетеротримерных G-белков является то, что они зависят от сверхэкспрессии гетеротримеров, что может влиять на естественное предпочтение GPCR для определенного класса гетеротримерных G-белков.Мечение эндогенных субъединиц флуоресцентными белками потенциально может облегчить это.

Исключительная чувствительность этих датчиков позволяет надежно обнаруживать активацию Gα _i в первичных клетках через эндогенные GPCR. Более того, эти биосенсоры можно использовать для прямого сравнения предпочтительных паттернов активации Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 между различными GPCR, связанными с Gα _i , что может помочь в разработке терапевтических стратегий, нацеленных на Gα _i . сигнальные пути [42].

Методы

Конструирование флуоресцентных слитых белков

Для вставки mTurquoise2-Δ9 (здесь сокращенно mTq2) [25] в белки Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 , версию mTq2 с сайтами рестрикции Age1 на его N-конце и C-конце. был сконструирован путем амплификации mTurquoise2 с прямым праймером 5′-ATaccggttctATGGTGAGCAAGGGCG-3 ‘и обратным праймером 5′-TAaccggtGATCCCGGCGGC-3’. Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i1 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице RnGalpha _i1 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAACTCGCCGGCGTCATA-3 ‘и обратным праймером 5’-ATaccggtCAGCCCTGTCATAA -3 ‘.Чтобы ввести Age1-сайт в Gα _i2 -цитрин, мы выполнили полновекторную ПЦР на матрице HsGalpha _i2 -Citrine [20] с прямым праймером 5′-ATaccggtGAGGAGCAAGGCGTGCT-3 ‘и обратным праймером 5’TGTG -3 ‘. КДНК, содержащая кодирующую последовательность для HsGalpha _i3 с сайтом Age1, была синтезирована Eurofins (www.eurofins.nl). Разрезание продукта ПЦР mTq2 и новых векторов Gα _i1 , Gα _i2 и Gα _i3 с помощью Age1 и последующее лигирование привело к получению RnGalpha _i1 , помеченного mTq2 после позиции 121, и HsGalpha _i2,3 , помеченного mTq2 после положения 114, аналогично ранее описанному функционально меченному Gα _i1,2,3 [20].

Для создания варианта 1.0 сенсора Gα _i1 была проведена ПЦР на плазмиде mTq2-Gα _i1 с прямым праймером 5′-AGGTCTATATAAGCAGAGC-3 ‘и обратным праймером 5′-TATggatccAGCTTAGAAGAGACCACAGTC-3’ для введения Сайт BamHI на С-конце и сайт NcoI на N-конце. Затем было выполнено тройное лигирование с продуктом ПЦР (разрезанным с помощью BamHI и NcoI), вектором, содержащим pGβ ₁ -T2A-cp173Venus-Gγ ₂ [43] (разрезанным с помощью BamHI и SacII), и вектором, содержащим pPRIG -IRES [44] (вырезано с помощью NcoI и SacII).Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-MATT-Gα _i1 -CFP, коэкспрессирует MATT-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9 (нарушение локализации плазматической мембраны), pGβ ₁ и cp173Venus-Gγ ₂ (рис. 1B).

Для создания варианта 2.0 сенсора Gα _i1 мы выполнили ПЦР с мутагенезом с вариантом 1.0 в качестве матрицы путем амплификации с прямым 5′-GAAAAACACGATGATAATATGGGCTGCACACTGAGC-‘3 и 5’-GCTCAGTGTGCAGCCCATATTATCTTC-3TGT-3.Полученная плазмида, pGβ ₁ -2A-cp173Venus-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTurquoise2-Δ9, коэкспрессирует Gα _i1 -mTq2 (правильно расположенная на плазматической мембране), pGβ ₁ и cpVenus-Gγ ₂ (рис. 1B).

Чтобы создать единый плазмидный сенсор для Gα _i2 и Gα _i3 , мы выполнили ПЦР с расширением перекрывания [45]. Gα _i2 -mTq2 амплифицировали с прямым праймером ‘5-acgatgataatATGGGCTGCACCGTGA-3’ и обратным праймером ‘5 -TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3’, а Gα _i3 -mTCat ‘ACGatgTgata и обратным праймером’ 5 праймер ‘5 -TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3’.Еще одну ПЦР проводили на ранее описанном [26] одиночном плазмидном сенсоре Gα _q с прямым праймером «5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3» и обратным праймером «5-GCAGCCCATattatcatcgtgtttttcaaag -3». Впоследствии описанный выше продукт ПЦР Gα _i2 -mTq2 или Gα _i3 -mTq2 смешивали с продуктом ПЦР датчика Gα _q и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с прямым праймером ‘5-GAAGTTTTTCTGTGCCATCC -3 ‘и обратный праймер’ 5- TATtctagaAGCTCAGAAGAGGCCGCAGT-3 ‘и прямой праймер’ 5- GAAGTTTTTCTGTGCCATCC-3 ‘и обратный праймер’ 5-TATtctagaAGCTTAATAAAGTCCACATTCCT-3 ‘соответственно.Затем полученные продукты ПЦР лигировали в основную цепь сенсора Gα _q с помощью SacII и XbaI, в результате чего получали pGβ-2A-cp173Venus -Gγ ₂ -IRES-Gα _i2 -mTurquoise2-Δ9 и pGβ ₁ — 2A-cp173Venus-Gγ2-IRES-Gα _i3 -mTurquoise2-Δ9 соответственно. Последовательности плазмид доступны по запросу. Плазмиды будут распространяться через Addgene: http://www.addgene.org/Dorus_Gadella/. RnGα _i1 -mCitrine и HsGα _i2 -mCitrine были любезным подарком Скотта Гибсона [20].Обратите внимание, что кодирующая последовательность RnGα _i1 отличается только одной аминокислотой от человеческого Gα _i1 (S98A). Рецептор LPA ₂ был получен с cDNA.org. BK ₂ R [46], α ₂ AR [21], M ₃ R [47] и рецептор A1 [48] были описаны ранее. β ₂ AR-P2A-mЧерри — подарок Анны Пьетрашевской (Амстердамский университет).

Культура клеток и подготовка проб

клеток HeLa (American Tissue Culture Collection: Manassas, VA, USA) культивировали в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды) с использованием среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), снабженной глутамаксом, 10% FBS, пенициллином (100 Ед / мл). ) и стрептомицин (100 мкг / мл).Все среды для культивирования клеток были получены от Invitrogen (Bleiswijk, NL).

Клетки трансфицировали в 35-миллиметровой чашке со стеклянным покровным стеклом 24 мм Ø # 1 (Menzel-Gläser, Брауншвейг, Германия), используя 1-2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с протоколом производителя (Invitrogen), 0,5-1 мкг плазмидной кДНК и 50 мкл OptiMeM (Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После инкубации в течение ночи при 37 ° C и 5% CO ₂ покровные стекла помещали в камеру для клеток Attofluor (Invitrogen, Breda, NL) и погружали в среду для микроскопии (20 мМ HEPES (PH = 7.4), 137 мМ NaCL, 5,4 мМ KCL, 1,8 мМ CaCL ₂ , 0,8 мМ MgCl ₂ и 20 мМ глюкозы). Вся микроскопия живых клеток проводилась при 37 ° C.

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) были приобретены у Lonza и культивированы в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) на чашках, покрытых FN, в среде EGM-2 с добавлением одиночных клеток (Lonza, Verviers, Бельгия). HUVEC использовали в пассаже номер 4 или 5. В качестве метода трансфекции использовали систему трансфекции Neon (MPK5000, Invitrogen) и соответствующий набор для трансфекции Neon (Invitrogen).Один импульс генерировали при 1300 В в течение 30 мс для микропорации HUVEC с 2 мкг кДНК, затем клетки высевали на покровные стекла, покрытые FN.

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 клетки HEK293 культивировали в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия) в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина (2 мМ). (PAN Biotech GmbH, Айденбах, Германия), пенициллин (100 Ед / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) и хранили при 37 ° C в атмосфере 7% CO2.Клетки собирали и высевали на 24-миллиметровые покровные стекла, покрытые D-полилизином, при ~ 40% конфлюентности. Через три часа клетки временно трансфицировали 1,0 мкг рецептора (α ₂ AR или аденозин A1) и 3,0 мкг pGβ ₁ -2A-YFP-Gγ ₂ -IRES-Gα _i1 -mTq2 кДНК на 6 -луночный планшет с использованием реагента для трансфекции Effectene ^® (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Среду для выращивания обновляли через 24 часа, и измерения проводили после общего времени инкубации 48 часов.Клетки содержали в среде для микроскопии (140 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, pH 7,3) и постоянно суперслили с этим буфером или буфером, дополненным соответствующим лигандом, с использованием компьютерной системы. Устройство быстрой суперфузии с электромагнитным клапаном (ValveLink 8.2, Automate Scientific).

Широкопольная микроскопия

Ратиометрические измерения FRET в клетках HeLa (результаты представлены на рис. 2A, 2C и 2D) были выполнены с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (Axiovert 200 M; Carl Zeiss GmbH, Германия) в Амстердамском университете (Амстердам, Нидерланды). выдерживали при 37 ° C, снабжали иммерсионным масляным объективом (Plan-Neoflor 40 × / 1.30; Carl Zeiss GmbH) и ксеноновую дуговую лампу с монохроматором (Cairn Research, Faversham, Kent, UK). Изображения были записаны с помощью охлаждаемой камеры устройства с заряженной связью (Coolsnap HQ, Roper Scientific, Tucson, AZ, США). Типичное время экспозиции составляло от 75 мс до 150 мс, а интервал камеры был установлен на 4×4. Флуорофоры возбуждались светом 420 нм (ширина щели 30 нм) и отражались на образец дихроичным зеркалом 455DCLP, эмиссия CFP регистрировалась фильтром BP470 / 30, а эмиссия YFP регистрировалась фильтром BP535 / 30 путем вращения колеса фильтров. .В экспериментах по совместной экспрессии YFP возбуждали светом 500 нм (ширина щели 30 нм) и отражали на образец дихроичным 515DCXR, а излучение регистрировали с помощью фильтра BP535 / 30. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и, для изображения отношения FRET, просачивание эмиссии CFP в канал YFP (55% интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для экспериментов FRET в HUVEC (результаты представлены на рис. 2B) микроскоп Zeiss Observer Z1 использовался в Sanquin Blood Supply (Амстердам, Нидерланды) с 40x NA 1.3 масляный иммерсионный объектив и возбуждающий источник света HXP 120 В. CFP возбуждали через кубический фильтр FRET (Exciter ET 436 / 20x и дихроичное зеркало 455 DCLP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США)). Излучение направлялось на прикрепленный адаптер двойной камеры (Carl Zeiss GmbH, Германия), управляющий дихроичным зеркалом 510 DCSP (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США). Эмиссионные волны с длиной волны 455–510 нм направляются на эмиссионный фильтр ET 480/40 (Chroma, Bellows Falls, Вермонт, США), а затем фиксируются камерой Hamamatsu ORCA-R2.Длина волны излучения 510 нм и выше направляется на эмиссионный фильтр ET 540/40 м (Ludl Electronic Products, Нью-Йорк, США), а затем фиксируется второй камерой Hamamatsu ORCA-R2. Получение изображений осуществлялось с использованием программного обеспечения микроскопа Zeiss-Zen 2011. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал. Регистрация была скорректирована на фоновый сигнал и утечку эмиссии CFP в канале YFP ​​(62% от интенсивности, измеренной в канале CFP).

Для быстрых кинетических измерений активации Gα _i1 (результаты представлены на рис. 3) визуализация проводилась на инвертированном микроскопе Zeiss Axiovert 200 в Университете Вюрцбурга (Вюрцбург, Германия), оборудованном масляным иммерсионным объективом 63x и фотометрическая система с двойным излучением (Till Photonics), описанная ранее [21].Трансфицированные клетки возбуждали светом от полихрома IV (Till Photonics). Освещение было установлено на 40 мс из общего времени интеграции 100 мс. Сигналы CFP (480 ± 20 нм), YFP (535 ± 15 нм) и отношения FRET (YFP / CFP) регистрировались одновременно (светоделитель DCLP 505 нм) при возбуждении на длине волны 436 ± 10 нм (светоделитель DCLP 460 нм). Сигналы флуоресценции регистрировались фотодиодами и оцифровывались с помощью аналого-цифрового преобразователя (Digidata 1440A, Axon Instruments). Все данные были записаны на ПК под управлением Clampex 10.3 (Axon Instruments). Полученные отдельные трассы были подогнаны к однокомпонентной функции экспоненциального затухания для извлечения экспоненциальной постоянной времени tau [39]. Полупериод активации (t _1/2 ) определяется как τ * ln2. В динамических экспериментах клетки стимулировали UK14,304 (10 мкм), йохимбином (60 мкм), брадикинином (1 мкм), LPA (1 мкм), карбахолом (100 мкм), атропином (10 мкм), изопротеренолом (10 мкм), пропранололом (10 мкм), S1P (500 нМ), 20 мкМ или 100 мкМ норэпинефрина или 30 мкМ аденозина в указанные моменты времени.ImageJ (Национальный институт здоровья) использовался для анализа необработанных изображений микроскопии. Дальнейшая обработка данных была проведена в Excel (Microsoft Office), а графики и статистика были выполнены с использованием Graphpad версии 6.0 для Mac, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com.

Конфокальная микроскопия

клеток HeLa, трансфицированных указанными конструкциями, получали с помощью конфокального микроскопа Nikon A1, оснащенного иммерсионным объективом 60x (Plan Apochromat VC, NA 1.4). Размер точечного отверстия был установлен на 1 единицу Эйри (<0,8 мкм).

Образцы последовательно возбуждали лазерной линией 457 нм и 514 нм и отражались на образец дихроичным зеркалом 457/514. Эмиссия CFP фильтровалась через эмиссионный фильтр BP482 / 35; Эмиссию YFP фильтровали через эмиссионный фильтр BP540 / 30. Чтобы избежать проступания, изображения были получены в режиме последовательной строчной развертки. Все измерения были скорректированы на фоновый сигнал.

Благодарности

Мы благодарим Eelco Hoogendoorn (Амстердамский университет) и Marten Postma (Амстердамский университет) за помощь в анализе данных.Мы благодарим Йоррита Броертьеса (магистранта Амстердамского университета) и Денниса Ботмана (магистранта Амстердамского университета) за создание Gα _i1 -mTurquoise2 и Gα _i2 -mTurquoise2 соответственно. Мы благодарим Мерел Аджобо-Херманс, Анну Пьетрашевскую и Скотта Гибсона за предоставленные плазмиды.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JvU PLH CH JG TWG. Проведены эксперименты: JvU ADS BS NRR. Проанализированы данные: JvU ADS BS NRR CH JG.Написал статью: JvU ADS BS NRR PLH CH TWG JG.

Ссылки

1. 1. Суки В.Н., Абрамовиц Дж., Маттера Р., Кодина Дж., Бирнбаумер Л. Геном человека кодирует по меньшей мере три неаллеллических G-белка с субъединицами альфа i-типа. FEBS Lett. 1987; 220: 187–192. pmid: 2440724
2. 2. Kimple ME, Neuman JC, Linnemann AK, Casey PJ. Ингибирующие G-белки и их рецепторы: новые терапевтические мишени при ожирении и диабете. Exp Mol Med. 2014; 46: e102. pmid: 24946790
3. 3.Ван И, Ли Й, Ши Г. Регулирующая функция гетеротримерных белков G в иммунной системе. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2013; 61: 309–319.
4. 4. Дорсам РТ, Гуткинд Ж.С. Рецепторы, сопряженные с G-белком, и рак. Нат Рев Рак. 2007; 7: 79–94. pmid: 17251915
5. 5. Даака Ю. Белки G при раке: парадигма рака простаты. Sci STKE. 2004; 2004: re2. pmid: 14734786
6. 6. Appleton KM, Bigham KJ, Lindsey CC, Hazard S, Lirjoni J, Parnham S и др.Разработка ингибиторов гетеротримерных субъединиц Gαi. Bioorg Med Chem. 2014; 22: 3423–3434. pmid: 24818958
7. 7. Раймонд Дж. Р., Эпплтон К. М., Пирс Дж. Ю., Петерсон Ю. К.. Подавление сообщения GNAI2 при раке яичников. J Ovarian Res. 2014; 7: 6. pmid: 24423449
8. 8. Гарсия А., Ким С., Бхавараджу К., Шенвалдер С.М., Кунапули С.П. Роль фосфоинозитид-3-киназы бета в агрегации тромбоцитов и генерации тромбоксана А2, опосредованной сигнальными путями Gi. Биохим Дж.2010. 429: 369–377. pmid: 20441566
9. 9. la Sala A, Gadina M, Kelsall BL. G (i) -зависимое ингибирование продукции IL-12 опосредуется активацией пути фосфатидилинозитол-3-киназа-протеин-3-киназа B / Akt и JNK. J Immunol. 2005; 175: 2994–2999. pmid: 16116186
10. 10. Kue PF, Daaka Y. Существенная роль G-белков в росте клеток рака простаты и передаче сигналов. J Urol. 2000. 164: 2162–2167. pmid: 11061948
11. 11. Hur EM, Kim KT.Передача сигналов рецептора, связанного с G-белком, и перекрестные помехи: достижение скорости и специфичности. Сотовый сигнал. 2002; 14: 397–405. pmid: 11882384
12. 12. Брюс ДжиЭ, Штрауб С.В., Йол Д.И. Перекрестные помехи между передачей сигналов цАМФ и Са2 + в невозбудимых клетках. Клеточный кальций. 2003. 34: 431–444. pmid: 14572802
13. 13. Фей Д., Краучер Д. Р., Колч В., Холоденко Б. Н.. Перекрестные помехи и переключатели сигналов в каскадах митоген-активируемых протеинкиназ. Front Physiol. 2012; 3: 355. pmid: 23060802
14. 14.Lohse MJ, Nuber S, Hoffmann C. Методы резонансной передачи энергии флуоресценции / биолюминесценции для изучения активации и передачи сигналов рецепторов, связанных с G-белками. Pharmacol Rev.2012; 64: 299–336. pmid: 22407612
15. 15. ван Унен Дж., Вулард Дж., Ринкен А., Хоффманн С., Хилл С., Годхарт Дж. и др. Перспектива изучения передачи сигналов GPCR с помощью RET-биосенсоров в живых организмах. Mol Pharmacol. 2015. 88 (3): 589–595.
16. 16. Гейлс С., Ван Дурм Дж.Дж., Шаак С., Понтье С., Першрансье Й., Одет М. и др.Исследование структурных перестроек, вызванных активацией, в предварительно собранных комплексах рецептор-G-белок. Nat Struct Mol Biol. 2006. 13: 778–786. pmid: 168
17. 17. Gales C, Rebois RV, Hogue M, Trieu P, Breit A, Hébert TE и др. Мониторинг в реальном времени взаимодействий рецепторов и G-белков в живых клетках. Нат методы. 2005; 2: 177–184. pmid: 15782186
18. 18. Ayoub MA, Maurel D, Binet V, Fink M, Prezeau L, Ansanay H, et al. Анализ в реальном времени индуцированной агонистами активации протеазо-активированного комплекса рецептор 1 / Galphai1, измеренный с помощью биолюминесцентного резонансного переноса энергии в живых клетках.Mol Pharmacol. 2007. 71: 1329–1340. pmid: 17267663
19. 19. Saulière A, Bellot M, Paris H, Denis C, Finana F, Hansen JT и др. Расшифровка сложности предвзятого агонизма выявляет новый активный объект рецептора AT1. Nat Chem Biol. Издательская группа «Природа»; 2012; 8: 623–631.
20. 20. Гибсон СК, Гилман АГ. Субъединицы Giα и Gβ определяют селективность активации G-белка α2-адренорецепторами. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2006; 103: 212.
21. 21. Бюнеманн М., Франк М., Лозе М.Дж. С обложки: Активация белка Gi в интактных клетках связана с перестройкой субъединиц, а не с диссоциацией. Proc Natl Acad Sci USA. Национальная академия наук; 2003; 100: 16077.
22. 22. Klarenbeek JB, Goedhart J, Hink MA, Gadella TWJ, Jalink K. Датчик цАМФ на основе mTurquoise как для FLIM, так и для логометрического считывания имеет улучшенный динамический диапазон. PLoS ONE. 2011; 6: e19170. pmid: 21559477
23. 23. Спарта Б, Парджетт М, Минге М, Дистор К, Белл Дж, Олбек Дж.Механизмы рецепторного уровня необходимы для импульсов активности киназы, регулируемой эпидермальным фактором роста (EGF), регулируемой внеклеточным сигналом (ERK). J Biol Chem. 2015; 290: 24784–24792. pmid: 26304118
24. 24. Hamers D, van Voorst Vader L, Borst JW, Goedhart J. Разработка биосенсоров FRET для систем млекопитающих и растений. Протоплазма. 2014; 251: 333–347. pmid: 24337770
25. 25. Goedhart J, Stetten von D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA и др.Структурно-управляемая эволюция голубых флуоресцентных белков в направлении квантового выхода 93%. Nature Communications. 2012; 3: 751. pmid: 22434194
26. 26. Adjobo-Hermans MJW, Goedhart J, van Weeren L, Nijmeijer S, Manders EMM, Offermanns S, et al. Визуализация в реальном времени активации гетеротримерного G-белка Gq в живых клетках. BMC Biol. 2011; 9: 32. pmid: 21619590
27. 27. Goedhart J, van Weeren L, Adjobo-Hermans MJW, Elzenaar I, Hink MA, Gadella TWJ. Количественная совместная экспрессия белков на уровне отдельной клетки — приложение к мультимерному датчику FRET.Дельпрато А.М., редактор. PLoS ONE. 2011; 6: e27321. pmid: 22114669
28. 28. Бернс DL. Субъединичная структура и ферментативная активность токсина коклюша. Microbiol Sci. 1988. 5: 285–287. pmid: 2